laboratorio de quimica - Universidad Iberoamericana

Laboratorio de Química Orgánica Aplicada.
Práctica 2. Cromatografía en columna.
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LABORATORIO DE QUÍMICA ORGÁNICA APLICADA
PRÁCTICA # 2
SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DE
PIGMENTOS VEGETALES
Y SUS ESPECTROS DE ABSORCIÓN
OBJETIVOS
Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:
1. Preparar una columna para cromatografía.
2. Preparar un extracto de pigmentos de plantas.
3. Separar por cromatografía en columna la mezcla de pigmentos extraídos.
4. Obtener el espectro de absorción en la zona del visible de los pigmentos extraídos.
5. Explicar los conceptos fundamentales en los que se basa la cromatografía.
INFORMACION GENERAL
Pigmentos de las plantas
Las plantas verdes y algunos microorganismos que abundan en la superficie terrestre llevan a cabo un
proceso llamado fotosíntesis, por el cual, mediante la energía solar, transforman el bióxido de carbono en
carbohidratos como la glucosa y su polímero el almidón, que son compuestos con alto contenido en energía
química y, por ello, estos seres vivos son productores primarios de los ecosistemas. La glucosa formada es
utilizada por ellos mismos y por otros seres vivos durante el proceso de respiración, en el cual se oxida hasta
CO2 y H2O, obteniendo así la energía necesaria para llevar a cabo sus diversas funciones.
Para atrapar la energía solar e iniciar el proceso de transformación de energía luminosa a energía química, las
plantas superiores contienen en sus células un organelo llamado cloroplasto, en donde se encuentran los
llamados centros de reacción, formados por proteínas y diversos pigmentos, en especial las clorofilas. Las
clorofilas a y b se encuentran en las plantas y las bacterioclorofilas a o b se encuentran en las bacterias
fotosintéticas. Además de estas moléculas, los organismos fotosintéticos tienen otros pigmentos con
capacidad para absorber luz. Los pigmentos accesorios incluyen por ejemplo a los carotenos, xantofilas,
antocianinas y otras moléculas con colores característicos.
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La estructura de estas sustancias se muestra en la fig. 1.
Fig. 1. Estructura de algunos pigmentos de plantas
Estas sustancias son coloridas por el número elevado de dobles ligaduras conjugadas que poseen, lo que
permite que las excite la radiación con longitud de onda en la región del visible. La clorofila absorbe bien en
la región del rojo y el azul y muy poco en la zona del verde. Las plantas que contienen clorofila son verdes
porque la luz verde se refleja, no se absorbe.
Estos pigmentos no son solubles en agua, pero pueden extraerse con solventes orgánicos cuando las células
que los contienen se rompen. Los extractos tienen, además de pigmentos, grasas y algunos otros compuestos
incoloros. Entre los tipos de pigmentos más solubles en solventes orgánicos, se encuentran las clorofilas
(azul-verde) y los carotenoides (amarillo-naranja). Algunos colores rosas y rojos en las plantas (por ejemplo
en el betabel, la col morada, la jamaica y en las flores) se deben a xantocianinas, las cuales si son solubles en
agua y no se extraen con solventes orgánicos.
Métodos cromatográficos
Los métodos cromatográficos son métodos de separación que involucran la transferencia reversible de un
compuesto que está adsorbido en una fase estacionaria (adsorbente) a una fase móvil (solvente) que fluye a
través de la fase estacionaria.
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La separación surge de las interacciones mutuas de componentes de una muestra, solvente y adsorbente. El
adsorbente está presente en un gran exceso, con una gran superficie y con sitios polares capaces de unir
reversiblemente pequeñas concentraciones de sustancias por un proceso esencialmente electrostático. El
solvente compite con los componentes de la muestra por los sitios de unión. Estos componentes son
desplazados reversible y continuamente en la dirección del flujo del solvente. El proceso descrito puede
escribirse como un equilibrio competitivo en donde hay una partición de los componentes entre la fase
estacionaria y la fase móvil:
componentes-adsorbente
↔
solvente-adsorbente
↔
componente-solvente
Entre más polar sea un compuesto, más fuertemente se adsorbe en la fase estacionaria, por lo que su
migración a lo largo de ella es menor, siendo eluído (arrastrado) más lentamente por la fase móvil, que los
compuestos menos polares. De este modo, la separación selectiva de los componentes de una muestra, por
cromatografía, se debe a las diferencias en la migración de los componentes individuales a lo largo de la fase
estacionaria.
En la cromatografía en fase líquida se usa una fase móvil (líquida) y una fase estacionaria (sólida), siendo los
adsorbentes más comunes la sílica gel (SiO2.H2O), alúmina (A2O3) y celulosa.
La distribución de los componentes entre la fase sólida y líquida es determinada, además de por la polaridad
propia de cada compuesto, por el grado de actividad del adsorbente (el cual depende principalmente del grado
de hidratación y de la polaridad del solvente).
El principal factor para controlar el movimiento de los diferentes compuestos en un cromatograma es la
polaridad del solvente. Una lista de los solventes más usados en los diferentes tipos de cromatografía, en
orden de polaridad creciente, se indica en la Tabla 1. Entre más polar sea un solvente, más rápido es el
movimiento de los compuestos y menos efectiva la separación.
Menos polar
Más polar
Hexano
Tolueno
Cloruro de metileno
Cloroformo
Éter
Acetato de etilo
Acetona
Propanol
Etanol
Metanol
Agua
Ácido acético
Tabla 1. Disolventes comunes para cromatografía de líquidos
Cromatografía en columna
La cromatografía en una columna de adsorbente proporciona un medio para la separación y aislamiento de
los componentes de una mezcla. La muestra se aplica en la parte superior de la columna y se deja pasar
solvente a través del adsorbente. Este proceso desarrolla el cromatograma en bandas que contienen los
compuestos individuales; estas bandas pueden ser eluídas (arrastradas) en secuencia por adición de más
solvente y recolectadas en fracciones separadas. La columna se prepara y desarrolla usando el solvente menos
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polar que disuelva a la muestra y que permita el movimiento de los compuestos a una velocidad práctica.
Generalmente es necesario ir cambiando a solventes más polares para efectuar la elusión de los compuestos,
dependiendo de los grupos funcionales que tengan los componentes de la mezcla. La facilidad de ser eluído
más rápidamente, dependerá de la menor polaridad de los grupos funcionales, como se muestra en la Tabla 2.
El cambio de solventes debe efectuarse gradualmente, mediante mezclas de los solventes (5 a 10% del
solvente siguiente en polaridad), para evitar que se alteren las zonas que ya han sido desarrolladas
(separadas).
Las sustancias demasiado polares, como azúcares o aminoácidos, no pueden separarse de sus mezclas por
cromatografía en columna, ya que con los adsorbentes anteriormente mencionados no pueden utilizarse agua
o ácido acético porque, con estos solventes demasiado polares, el equilibrio componentes-adsorbente se
desplaza hacia el de solvente-adsorbente y de ahí al de componentes-solvente y, de esta manera, todos los
componentes de la mezcla se eluyen simultáneamente.
VELOCIDAD
menos polar
RAPIDEZ DE ELUSIÓN
más rápido
más polar
más lento
GRUPO FUNCIONAL
alcanos
halogenuros de alquilo
alquenos
dienos
hidrocarburos aromáticos
halogenuros aromáticos
éteres
ésteres
cetonas
aldehídos
aminas
alcoholes
fenoles
ácidos carboxílicos
ácidos sulfónicos
Tabla 2. Velocidades relativas de elución para diferentes grupos funcionales
En la práctica, los pasos de desarrollo y elusión frecuentemente son distinguibles, ya que la banda que se
mueva más rápido puede empezar a emerger de la columna antes de que se complete la separación de las
bandas que se mueven más lentamente.
Frecuentemente, los compuestos a separar en la mezcla son incoloros por lo que no pueden verse las bandas.
En este caso se recolectan fracciones de volumen pequeño. se evapora el solvente y los residuos se comparan
por cromatografía en placa delgada para determinar cuáles fracciones tienen igual composición y pueden ser
reunidas.
La columna se prepara en un tubo de vidrio que, en uno de sus extremos, lleva una llave de paso (puede
utilizarse una bureta). El adsorbente se sostiene en un disco de vidrio poroso o un tapón de algodón o lana de
vidrio cubierto con una capa de arena para retener partículas finas. La relación usual de diámetro de la
columna a altura del adsorbente es aproximadamente de 1 a 10 y debe haber suficiente espacio adicional en la
columna para permitir que haya solvente arriba del adsorbente. Si el tubo tiene un diámetro de 1 cm o mayor,
se llena parcialmente con el solvente que se vaya a usar para disolver la muestra. Se añade el adsorbente, ya
sea seco, dejándolo caer como un chorro muy fino, o bien, suspendiéndolo en un vaso de precipitados con el
mismo solvente y añadiendo la suspensión a la columna. Mientras se añade el adsorbente, debe mantenerse
entreabierta la llave de la columna para que el solvente siga fluyendo lentamente. Si la columna tiene un
diámetro menor a 1 cm (como las usadas en técnicas de microescala, en las que se puede usar una pipeta
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Pasteur como columna)) no se pone solvente y el adsorbente se añade en seco. En cualquiera de los casos, la
columna debe ser compacta y uniforme; una columna no uniforme, en la que haya capas disparejas de
adsorbente, cuarteaduras o burbujas, no es utilizable. Arriba del adsorbente se coloca una pequeña capa de
arena para prevenir que la parte superior del adsorbente sea alternada. El exceso de solvente es drenado de la
columna, justo hasta arriba del adsorbente y entonces se añade, usando una pipeta Pasteur, la muestra disuelta
en un volumen mínimo de solvente. La muestra debe adsorberse en la zona más angosta posible, ya que las
bandas se vuelven más difusas a medida que la columna se desarrolla. Al llevar a cabo un cromatograma es
importante mantener siempre el nivel de solvente arriba de la columna de adsorbente para prevenir la
formación de cuarteaduras en el adsorbente.
Las mezclas complejas de pigmentos de plantas presentan un gran problema de separación. Generalmente la
separación completa de todos los pigmentos de un extracto no se logra en un solo cromatograma; por
ejemplo, las diferentes clorofilas pueden separarse utilizando azúcar pulverizada como adsorbente pero la
separación de carotenos, menos polares, requieren de un adsorbente más activo. Esta separación “fina” no se
llevará a cabo en esta práctica.
En las condiciones de separación usadas en esta práctica ocurren algunos cambios en los pigmentos más
sensibles durante la extracción y cromatografía, lográndose únicamente una separación parcial; además, los
compuestos incoloros se detectarían en el residuo si se evaporaran las fracciones. En este caso no se analizará
la pureza de las fracciones para comprobar que la separación fue completa; sin embargo, los principios del
método si podrán ser observados.
Los resultados de esta cromatografía dependerán de variables como la fuente de los pigmentos, la eficiencia
de la extracción, la actividad de la alúmina utilizada como adsorbente, las dimensiones de la columna, los
volúmenes de cada solvente y las mezclas de cada solvente utilizadas en el desarrollo. Cambios muy
pequeños en algunos de estos factores pueden afectar la separación e incluso causar cambios en las posiciones
individuales de los pigmentos en el cromatograma.
Ya que es imposible especificar todas estas variables, no importa que tan detallado sea el procedimiento
indicado para llevar a cabo el cromatograma, no en todos los casos se obtendrán resultados óptimos. En el
procedimiento dado en la parte experimental, se sugiere una secuencia general de cambio de solventes y
recolección de fracciones pero los detalles dependerán del cromatograma individual. El principal objetivo es
obtener tantos pigmentos individuales como sea posible en tubos de ensaye separados.
Espectroscopía de absorción
La espectroscopía de absorción es la medición de la cantidad de radiación que absorbe un compuesto como
función de la longitud de onda de la radiación que incide sobre ella. En general, se irradia una muestra con
una fuente de radiación y se mide con un detector la cantidad de radiación transmitida a diversas longitudes
de onda.
Las principales técnicas espectroscópicas (y otras relacionadas), que constituyen herramientas poderosas para
la elucidación de estructuras en química orgánica son las siguientes:
- Espectroscopía de infrarrojo, que observa las vibraciones de los enlaces y da evidencia acerca de los grupos
funcionales presentes en una molécula.
- Espectroscopía de ultravioleta-visible, que observa las transiciones electrónicas y da información acerca de
los electrones, especialmente de los no compartidos y de los sistemas de enlaces múltiples en la muestra.
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- Espectroscopía de resonancia magnética nuclear, que da información sobre el entorno de todos los átomos
de hidrógeno de la molécula en estudio y, por lo tanto, sobre la estructura de la cadena alifática y/o aromática
y sobre los grupos funcionales cercanos a los hidrógenos.
- Espectrometría de masas, técnica en la que se bombardean las moléculas con electrones para romperlas. El
análisis de las masas de los fragmentos obtenidos da información sobre el peso molecular, los heteroátomos y
los grupos funcionales presentes en la molécula original.
El espectro electromagnético incluye todas las posibles frecuencias, desde cero hasta infinito. En la práctica,
el espectro abarca desde frecuencias muy bajas, como las de radio utilizadas para la comunicación con
submarinos, hasta frecuencias muy altas, como las de los rayos gama. La Tabla 3 muestra la frecuencia, la
longitud de onda y las relaciones de energía de las diversas zonas del espectro electromagnético.
mayor frecuencia
menor longitud de onda
longitud de
onda
10-10 m
región del
espectro
rayos gama
energía por
mol
106 kcal
efectos
moleculares
10-8 m
rayos X
104 kcal
ionización
102 kcal
10-6 m
Ultravioleta
lejano
Ultravioleta
cercano
Visible
10-4 m
Infrarrojo
1 kcal
10-2 m
Microondas
10-4 kcal
10 0 m
Radio
10-6 kcal
102 m
transiciones
electrónicas
color
10 kcal
vibraciones
moleculares
movimiento
rotacional
transiciones en
el spin del
electrón
Tabla 3. Espectro electromagnético
El espectro electromagnético es continuo y la posición exacta de la división entre cada región es más o menos
arbitraria. En la parte superior se encuentran las frecuencias más altas y, por lo tanto, longitudes de onda más
cortas y mayor energía. En la parte inferior se encuentran las frecuencias menores y, por lo tanto, longitudes
de onda mayores y menor energía.
Las moléculas orgánicas sufren diferentes efectos de acuerdo a la energía de la radiación que incide sobre
ellas: Si se utilizan ondas de radio de baja frecuencia, se puede modificar el spin de los electrones, en especial
el del hidrógeno, lo que aprovecha la técnica de NMR. La energía en la región de las microondas permite la
rotación de las moléculas. En la región del infrarrojo hay vibración de los enlaces entre los átomos de una
molécula. En el ultravioleta los electrones se excitan y pasan a niveles de energía más altos dentro de las
moléculas. Los rayos X tienen tanta energía que excitan los electrones por encima de los niveles de energía
del enlace y permiten la ionización de la molécula.
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En la práctica # 1 se puede utilizar la espectroscopía de infrarrojo para determinar la presencia de los grupos
funcionales en una muestra problema. En esta ocasión, utilizaremos la espectroscopía de ultravioleta-visible,
únicamente en la región de visible, para determinar las longitudes de onda de absorción de algunos de los
pigmentos de plantas, que fueron separados por cromatografía en columna. Posteriormente se verificarán los
resultados con los datos reportados en la literatura.
Espectroscopía en la región del ultravioleta-visible
La excitación de los electrones de una molécula orgánica puede requerir desde 40 a 300 kcal/mol. Las
longitudes de onda correspondientes a estas energías abarcan la región del visible (400-800 nm), el
ultravioleta cercano (200-400 nm) y el ultravioleta lejano (100-200nm). La información más útil se obtiene
de los electrones π y los pares de electrones no compartidos, pues estos enlaces son más débiles y requieren
menos energía (y mayor longitud de onda) para pasar del estado basal al estado excitado.
En especial en los alquenos, el fotón absorbido corresponde a la energía requerida para la transición π → π*.
A estos grupos que facilitan la absorción de energía para la transición electrónica se les llama cromóforos. Si
el alqueno está conjugado, y entre mayor sea el número de dobles enlaces conjugados, la energía requerida
para llevar a cabo esta transición disminuye (y la longitud de onda aumenta), como puede observarse en la
siguiente tabla:
nombre
etileno
1,3-butadieno
1,3,5-hexatrieno
1,3,5,7-octatetraeno
estructura
CH2=CH2
CH2=CH-CH=CH2
CH2=CH-CH=CH-CH=CH2
CH2=CH-CH=CH-CH=CH-CH=CH2
(nm)
165
217
268
290
Si el cromóforo se sigue extendiendo, la longitud de onda de la transición π → π* se desplaza a la zona del
visible, en donde se da el máximo de absorción (λmax). En esa situación, la sustancia tendrá color. Ya que la
longitud de onda absorbida estará en la zona azul del espectro, el compuesto se verá amarillo. El color
cambiará a rojo cuando la energía del fotón requerido para excitar a la molécula sea todavía menor.
La transición π → π* se observa abajo de 190 nm. En el caso de los compuestos que tienen el cromóforo
carbonilo: >C=O, éste también absorbe radiación en la región del ultravioleta., Sin embargo, el carbonilo
contiene un átomo de oxígeno con pares de electrones no compartidos que se encuentran en el estado basal n
y que pueden ser excitados al orbital π*. La energía necesaria para esta transición n → π* es menor que la
del alqueno y la absorción se encuentra en la región del UV cercano (270 nm para la acetona).
La λmax que presenta un cromóforo en particular es muy sensible a los cambios estructurales en el sistema π,
es decir, al grado de sustitución que tengan las dobles ligaduras, a la presencia de anillos aromáticos, de
heteroátomos, etc. Es posible calcular la λ max de un compuesto en especial siguiendo las reglas de
Woodward-Fieser.
Refiriéndonos específicamente al caso de esta práctica, si se observa la estructura de los carotenos (de color
naranja) se verá que son polienos conjugados. En las clorofilas (de color verde o azul-verde), el cromóforo es
más complejo, pero básicamente también corresponde a un sistema poliénico altamente conjugado, con pares
de electrones no compartidos en los átomos de nitrógeno (ver la Fig. 1).
A continuación se incluyen los espectros de visible-UV de los pigmentos aislados en dos cromatografías de
extractos de espinaca. Los espectros de la primera cromatografía se reunieron en tres fracciones: 1) de
polaridad baja, 2) de polaridad intermedia y 3) de polaridad alta. Los espectros de la segunda cromatografía
en cuatro fracciones.
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ESPECTROS DE ULTRAVIOLETA DE LAS FRACCIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN
COLUMNA DE PIGMENTOS DE PLANTAS
Tubo 2. Fracción de menor polaridad, de color amarillo, eluída con hexano.
Tubo 3. Fracción de polaridad baja, de color verde, eluída con cloruro de metileno.
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Tubo 4. Fracción de polaridad media, de color amarillo, eluída con acetato de etilo.
Tubo 5. Fracción de polaridad alta, de color verde, eluída con metanol.
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Nombres:
Equipo:
TÉCNICA EN MICROESCALA:
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Grupo:
PREGUNTAS PARALELAS:
a) Preparación de la muestra de pigmentos:
Pesa 1 g de hojas de espinaca cortadas en piezas
pequeñas y colócalas en un mortero con media
cucharadita de arena y 3 mL de metanol.
¿Para qué sirve la arena en la molienda?
Muele con la mano del mortero hasta obtener una
papilla, añade 6 mL de hexano y muele otra vez.
¿Por qué se extrae primero con metanol y
luego con hexano?
Con una pipeta Beral pasa el líquido a un embudo de
separación chico, a través de un embudo de vidrio con
un pedacito de algodón del tamaño de un chícharo. Trata
de dejar el sólido en el mortero.
Repite la molienda con otros 6 mL de hexano y reúnelos
con el primer extracto en el embudo de separación.
Añade 10 mL de agua de la llave a la solución de
hexano, tapa el embudo y agita. Deja separar las fases y
remueve la capa acuosa inferior, poniéndola en un vaso
de precipitados.
¿Para qué se extrae con agua? ¿Porqué es
mejor que sea de la llave y no destilada?
Repite el lavado del hexano con una segunda porción de
10 mL de agua de la llave. Tapa, agita y deja separar
muy bien las fases.
Remueve nuevamente la capa inferior, elimina lo más
posible toda el agua.
Reúne esta segunda fase acuosa con la primera, para
posteriormente deséchelas al drenaje.
¿Qué contiene este extracto y por qué puede
desecharse al drenaje?
A partir de este momento, todo el material debe de
estar bien seco. Lávalo sólo si es necesario. Para
secarlo, escurre bien el agua, enjuaga con una cantidad
pequeña de acetona, que puedes usar para varias piezas,
escurre nuevamente y termina de secar la pieza con
vacío.
¿Cómo afecta el agua a la cromatografía?
Transfiere la solución de hexano a un matraz Erlenmeyer
de 25 mL. Añade a este matraz suficiente sulfato de
sodio anhidro para que se aclare la turbidez del hexano y
quede un poco de polvo fino Deja reposar por 5 minutos
agitando de vez en cuando. Si no queda polvo fino de
sulfato anhidro, añade un poco más del sufato y deja
reposar otros 5 min.
Si ya se separó el agua, ¿por qué se necesita
el sulfato de sodio anhidro?
Con una pipeta Pasteur pasa la solución colorida a otro
matraz Erlenmeyer de 25 mL. Enjuaga el sulfato de
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sodio con porciones de 0.2-0.3 mL de hexano. y con la
pipeta reúnelas al matraz con la solución de los
pigmentos.
Marca el matraz con tu número de equipo, ponle unas
tres piedras de ebullición y evapora la solución, en una
parrilla en la campana, a un volumen aproximado de 2-3
mL. Ten cuidado de no evaporar todo el solvente para
evitar la descomposición de los pigmentos.
¿Qué pasaría si se omiten las piedras?
b) Preparación de la columna de cromatografía:
Prepara la columna en una columna pequeña con llave.
Si no dispones de estas columnas, puedes usar una pipeta
Pasteur corta, adáptale en la punta un tubo capilar de
plástico obtenido de una pipeta Beral; esto te permite
tener un tamaño de gota muy pequeño y también, si es
necesario, detener el flujo de la columna. En la parte
superior de la pipeta enrolla una liga, para poder sostener
la pipeta con una pinza, sin que se resbale.
Con la ayuda de un alambre de cobre, coloca un pedacito
de algodón, que no debe estar apretado, en la parte
donde la columna se angosta. Cubre el algodón con una
capa de arena de 3-4 mm de altura. Golpea ligeramente
la columna para que la superficie de la arena esté bien
horizontal.
¿Para qué sirve la arena en la parte inferior
de la columna?
Añade en seco el adsorbente para cromatografía a la
columna, de preferencia sílica gel (también puede ser
alúmina pero no es tan conveniente). Deja caer el
adsorbente dentro de la columna como un chorro muy
fino. La altura del adsorbente en la columna debe ser de
unos 10-12 cm (si es un pipeta de 6 a 8 cm) dejando
espacio adicional en la columna para permitir que haya
suficiente solvente arriba del adsorbente. Golpea muy
ligeramente la columna, para que el adsorbente quede
uniforme y su superficie horizontal. Evita golpearla
mucho para que no se compacte demasiado.
¿Por qué es importante que el adsorbente esté
horizontal y que no tenga ni estratos más
compactos, ni grietas, ni burbujas?
Arriba del adsorbente coloca una pequeña capa de arena,
de 3 a 4 mm de altura.
¿Para qué sirve la arena en la parte superior
de la columna?
Sujeta con una pinza la columna ya preparada en un
soporte, a una altura adecuada para que puedas recoger
las fracciones en tubos de ensaye sostenidos en una
gradilla o un vaso y cambiar estos tubos con facilidad.
c) Cromatografía:
Numera consecutivamente 15 tubos de ensaye de 100 x 8
mm, marcándolos con “masking tape”. Acomódalos en
una gradilla.
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Práctica 2. Cromatografía en columna.
Con una pipeta Pasteur añade a la columna de
cromatografía parte del extracto en hexano de los
pigmentos de espinaca. Como la cantidad de adsorbente
en la columna es pequeña, añade sólo una pipeta del
extracto.
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¿Qué pasa si usas todo el extracto o si el
extracto está en un volumen grande de
solvente?
La muestra debe adsorberse en una zona de la columna
lo más angosta posible, ya que las bandas se vuelven más
difusas a medida que la columna se desarrolla.
Al llevar a cabo una cromatografía es importante
mantener siempre el nivel de solvente arriba de la
columna de adsorbente.
¿Por qué es importante que el solvente no
baje de la arena?
Con una pipeta Beral o Pasteur, enjuaga la parte superior
de la columna con cantidades muy pequeñas de hexano
hasta que todo el pigmento haya entrado en la columna.
Continúa añadiendo porciones de 2-3 mL del hexano y
anota todos los cambios en la apariencia de la columna.
Conforme las bandas empiezan a bajar y a separarse en
la columna, recolecta las fracciones de los pigmentos
separados en los tubos de ensaye numerados.
¿Por qué se separan en bandas los
componentes de la mezcla, en vez de bajar
todos juntos?
Cambia de tubo cuando esté lleno hasta dos terceras
partes o antes, si notas un cambio de coloración en el
eluyente.
Mientras el movimiento de los pigmentos ocurra a una
velocidad apreciable, continúa añadiendo porciones del
mismo solvente, no importa cual sea el volumen
utilizado ni cuantos tubos se llenen con el mismo
eluyente.
¿Cómo notarías si una columna no estuvo
bien preparada?
Si ya no hay movimiento de los pigmentos, empieza a
usar como eluyente el solvente puro o la mezcla de la
siguiente polaridad y continúa con el mismo solvente
hasta que nuevamente ya no haya cambios.
¿Por qué todos los solventes deben de estar
bien secos?
Continúa eluyendo los pigmentos con solventes y
mezclas de solventes de polaridad creciente. El orden de
solventes que debe seguirse, para esta práctica es el
siguiente:
Hexano,
Hexano con 10% de cloruro de metileno,
Cloruro de metileno puro,
Cloruro de metileno con 10% de acetato de etilo,
acetato de etilo puro,
acetato de etilo con 10% de metanol,
metanol puro.
¿Por qué es necesario hacer los cambios de
polaridad tan paulatinamente?
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Cuando se tienen mezclas muy complejas pueden
utilizarse, además de éstos, otros disolventes y hacer los
cambios aun más paulatinamente, por ejemplo pueden
usarse secuencias de mezclas de 5%, 10% y 20%.
¿Qué pasaría si los cambios se hicieran
solamente con solventes puros sin usar
mezclas?
Ve anotando tus resultados en la tabla: los colores de las
fracciones recolectadas, el solvente con el que se eluyó
cada una de ellas y el volumen aproximado de cada
fracción.
¿Cuántos componentes diferentes puedes
apreciar que se separaron?
Al terminar la cromatografía, observa los tubos y en base
a los colores determina cuales de ellos corresponden al
mismo pigmento. Anótalo en la tabla asignándole el
mismo número de compuesto a las fracciones iguales.
¿Cuántas clorofilas y cuantos carotenos se
separaron?
De acuerdo con las profesoras, reúne en los matraces que
se te indique el contenido de los tubos que correspondan
al mismo pigmento. Esto debe hacerse con especial
cuidado para no volver a mezclar los diferentes
componentes ya separados.
¿Cuál fue la secuencia de clorofilas y de
carotenos de menor a mayor polaridad?
Al terminar la práctica, las maestras se encargarán de
evaporar en la campana el solvente de cada uno de los
componentes, hasta un volumen pequeño y con estas
muestras se obtendrán los espectros de ultravioleta –
visible de cada una de los pigmentos separados.
Para en análisis de resultados se usarán los espectros
obtenidos en semestres anteriores, que ya fueron
incluidos en el instructivo.
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HOJA DE RESULTADOS
Nombres de los integrantes del equipo:
# de equipo:
Grupo:
1. TABLA DE RESULTADOS DE LA CROMATOGRAFIA:
Número
de la
fracción
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Solvente
Color e
intensidad del color
de la fracción
Volumen
aproximado
de la fracción
Clase y número del compuesto
separado (clorofila 1, 2… o
caroteno 1, 2…)
2. TABLA DE RESULTADOS DE LOS ESPECTROS DE ULTRAVIOLETA-VISIBLE
Anota las λmax, de mayor a menor, en los espectros de las páginas 32-34 del instructivo.
Fracción
Cromatografía 1
1. polaridad baja
2. polaridad media
3. polaridad alta
Cromatografía 2
1. polaridad baja
2. polaridad media baja
2. polaridad media alta
3. polaridad alta
λmax 1
λmax 2
λmax 3
λmax 4
λmax 5
λmax 6
λmax 7
λmax 8
PREGUNTAS DE PRELABORATORIO
1.
El contenido de agua en los tejidos de plantas es muy elevado. Tomando esto en cuenta, explique porqué
la extracción de pigmentos se lleva a cabo en metanol y luego se pasan al hexano. ¿Sería conveniente
extraer directamente con hexano?
2.
¿Cuál sería el efecto en los resultados de la cromatografía en columna si ocurriera alguno de los
siguientes errores:
a) Al añadir la muestra a la columna se usa una cantidad excesiva de solvente.
b) No se mantiene el nivel del solvente arriba del adsorbente y la columna se agrieta.
c) No se elimina completamente el metanol del extracto de pigmentos antes de hacer la cromatografía.
Departamento de Ingeniería y Ciencias Químicas. Universidad Iberoamericana.
Laboratorio de Química Orgánica Aplicada.
Práctica 2. Cromatografía en columna.
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3.
Diga cuáles son algunas de las aplicaciones más importantes de la cromatografía en columna.
4.
¿Qué información, en general, nos da el espectro de absorción en UV de un compuesto y para qué sirve
esta información?
5.
Responda a la pregunta 15-21 de la página 712 del capítulo 15 del libro “Química Orgánica” de Wade.
(La copia de la información necesaria está incluida en el manual de este laboratorio).
PREGUNTAS DE POST LABORATORIO:
1.
El extracto de las plantas, además de pigmentos contiene compuestos incoloros. Explique qué haría para
detectar estos compuestos y tener una buena separación entre estos compuestos y los pigmentos.
2.
En un cromatograma de un extracto de hojas verdes, se separaron cuatro bandas coloridas en la siguiente
secuencia: 1:amarillo-naranja, 2:verde, 3:amarilla, 4: verde. Asumiendo que estas bandas corresponden a
los dos carotenos y a las dos clorofilas cuya estructura se da en este instructivo, indique cuál compuesto
corresponde a cada una de las bandas 1 a 4 y explique su respuesta.
3.
¿Cree que la cromatografía que hizo podría optimizarse? ¿Cómo?
4.
Existen otros tipos de cromatografía en las que también se utilizan columnas:
a) la cromatografía de intercambio iónico;
b) la cromatografía de gases;
c) la cromatografía de líquidos de alta presión.
Diga cuáles son las principales características, las diferencias entre ellas y las aplicaciones de estas
técnicas.
5.
Busque en el Merk Index u otro manual las λmax de los α- y β-carotenos y de las los α- y β-clorofilas.
6.
¿Qué información dan los datos espectroscópicos de los componentes separados en esta cromatografía?
Compara los datos experimentales de la tabla 2 con los valores reportados (pregunta 5)? ¿Qué
conclusiones pueden sacarse de esta información respecto a la identidad y pureza de los compuestos
separados?
REPORTE
1.
2.
3.
Entrega la HOJA DE RESULTADOS con la información obtenida en la práctica.
Conclusiones de los datos obtenidos en la hoja de reporte.
Responde a las preguntas de postlaboratorio.
BIBLIOGRAFIA
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Wilcox, Jr. Charles F. & Wilcox, Mary F.; “Experimental Organic Chemistry. A Small-Scale Approach”,
2nd. Ed., Prentice-Hall, New Jersey, USA, 1995. pp. 122-145 y UV 154-162.
Mayo, Dana W., Pike, R. M. & Trumper Peter K., "Microscale Organic Laboratory with Multistep and
Multiscale Syntheses", 3rd. Ed., John Wiley, USA, 1994. pp. 97-101.
Williamson, Kenneth L., "Macroscale and Microscale Organic Experiments", 2nd. Ed., Heath and
Company, USA, 1994. pp. 170-182.
Eaton, David C., "Laboratory Investigations in Organic Chemistry", McGraw-Hill, USA, 1989. pp. 127139.
Departamento de Ingeniería y Ciencias Químicas. Universidad Iberoamericana.