Monitorización de Fármacos Antirretrovirales

DETERMINACION SIMULTANEA DE DIEZ FARMACOS ANTIRRETROVIRALES
MEDIANTE CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA
Alaguero Calero M 1, Gutiérrez García TJ 2, Rosado María C 1, Costa García A 2
1
Servicio de Farmacia. Hospital Universitario Central de Asturias. Oviedo.
2 Departamento de Química Física y Analítica. Universidad de Oviedo.
OBJETIVO
• Desarrollar y validar un método analítico de cromatografía HPLC para la determinación simultánea de concentraciones plasmáticas de 10 fármacos
antirretrovirales: 8 inhibidores de la proteasa (amprenavir, atazanavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir y tipranavir) y 2 inhibidores de
la transcriptasa inversa no nucleosídicos (efavirenz y nevirapina).
MATERIAL Y MÉTODOS
• El método cromatográfico desarrollado emplea como fase móvil una
mezcla de acetonitrilo y tampón Na2HPO4 0,1% de pH=6 (55%:45%). La
duración del análisis es de 25 minutos y el flujo utilizado es de 1,5 mL/min.
• El equipo de cromatografía utiliza un detector Visible-UV Simadzu SPD10AV y la longitud de onda que detecta durante el análisis es de 215 nm. La
columna seleccionada es una Kromasil C-18 (5 µm, 25 cm x 4,6 mm) y se
mantiene una temperatura de 30ºC.
• El tratamiento de las muestras de plasma de los pacientes se realiza
mediante una extracción en fase sólida utilizando cartuchos C18 (Figura 1).
Eliminar impurezas con
1 mL tampón pH 6 y
Eluir los fármacos con
0,5 mL de una mezcla
1,5 mL de metanol
metanol /tampón (20:80)
400 µL
tampón
pH=6
100 µL
Estandar
Interno
500µL
plasma
50 µL
Cartucho C18 acondicionado
previamente con 2 mL de
metanol y 2 mL de tampón
H3PO4 de pH 6
DESECHAR
Evaporar con corriente
de N2 y reconstituir con
300 µL de fase móvil
Figura 1: Pretratamiento de las muestras de plasma
RESULTADOS
• Los tiempos de retención obtenidos fueron: nevirapina 2,0; indinavir 3,0;
amprenavir 3,9; clozapina 5,2; atazanavir 6,4; ritonavir 7,5; lopinavir 8,7;
saquinavir 9,4; efavirenz 10,6; tipranavir 15,2 y nelfinavir 18,1 minutos.
(Figura 2)
• Las rectas de calibrado se elaboraron siguiendo el método del estándar
interno (Figura 3). Todos los fármacos determinados mostraron una
respuesta lineal en un rango de concentraciones entre 0,05 y 20 µg/mL
(Tipranavir hasta 50 µg/mL).
Rectas de Calibrado
1,8
1,6
1,4
Nevirapina (r=0,9999)
Indinavir (r=0,9999)
Nelfinavir (r=0,9998)
Saquinavir (r=0,9998)
Ritonavir (r=0,9999)
Lopinavir (r=0,9961)
Saquinavir (r=0,9998)
Atazanavir (r=0,9975)
Tipranavir (r=0,9997)
Efavirenz (r=0,9999)
5
Area / Area (EI)
10
1
Nelfinavir
0,8
Tipranavir
Efavirenz
Lopinavir
Saquinavir
Ritonavir
1,2
Atazanavir
Amprenavir
Indinavir
Clozapina (Estándar Interno)
Nevirapina
2
15
0,6
0,4
20
25
minutos
Figura 2: Cromatograma con 10 µg/mL de todos los fármacos.
0,2
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
Concentración / Concentración (EI)
La precisión y exactitud del método se evaluaron analizando 5 veces
muestras de 3 concentraciones diferentes ( 1, 5, y 10 µg/mL) y repitiendo el
proceso durante 3 días (Tabla 1). Las desviaciones respecto del valor
nominal fueron inferiores al 15 %. Los límites de detección varían entre
0,02 y 0,04 µg/mL y los de cuantificación entre 0,04 y 0,06 µg/mL.
1,0 (14,1%)
5,2 (4,9%)
10,5 (5,5%)
1,1 (8,2%)
5,3 (4,1%)
10,3 (4,8%)
1,2 (9,4%)
5,4 (3,9%)
10,8 (5,7%)
1,0 (4,9%)
5,1 (3,4%)
9,8 (5,7%)
1,0 (12,4%)
5,0 (6,6%)
10,2 (5,4%)
0,8 (16,9%)
5,1 (3,4%)
9,9 (6,1%)
--5,0 (5,1%)
10,5 (6,1%)
1,0 (8,8%)
5,2 (1,9%)
10,0 (5,8%)
1,1 (14,3%)
5,2 (6,8%)
9,9 (5,0%)
de
Lopinavir
- 1 µg /mL
- 5 µg /mL
- 10 µg /mL
Saquinavir
- 1 µg /mL
- 5 µg /mL
- 10 µg /mL
Efavirenz
- 1 µg /mL
- 5 µg /mL
- 10 µg /mL
Tipranavir
- 10 µg /mL
- 25 µg /mL
- 50 µg /mL
Nelfinavir
- 1 µg /mL
- 5 µg /mL
- 10 µg /mL
--4,9 (4,0%)
10,1 (7,3%)
--4,9 (6,1%)
9,8 (6,8%)
0,9 (11,2%)
4,9 (6,1%)
10,2 (3,4%)
1,1 (38,2%)
4,9 (5,4%)
10,3 (4,4%)
1,2 (25,7%)
4,9 (8,2%)
10,0 (6,9%)
1,3 (21,8%)
4,9 (7,7%)
9,8 (7,8%)
10,2 (8,6%)
-----
10,6 (6,7%)
-----
1,1 (8,6%)
5,3 (2,8%)
10,2 (5,3%)
1,3 (16,9%)
5,3 (5,9%)
10,6 (5,6%)
Tabla 1: Concentraciones medias y coeficientes de variación intradía e interdía.
5
Lopinavir 8,6 µg/mL
1,0 (6,4%)
5,0 (6,0%)
10,2 (6.2%)
plasmáticas
Media
Media
intradía (n=5) interdía
(CV intradía) (CV interdía)
Ritonavir 3,8 µg/mL
Nevirapina
- 1 µg /mL
- 5 µg /mL
- 10 µg /mL
Indinavir
- 1 µg /mL
- 5 µg /mL
- 10 µg /mL
Amprenavir
- 1 µg /mL
- 5 µg /mL
- 10 µg /mL
Atazanavir
- 1 µg /mL
- 5 µg /mL
- 10 µg /mL
Ritonavir
- 1 µg /mL
- 5 µg /mL
- 10 µg /mL
Finalmente se determinaron las concentraciones
antirretrovirales en pacientes VIH positivos (Figura 4).
Clozapina (EI)
Media
Media
intradía (n=5) interdía
(CV intradía) (CV interdía)
Figura 3: Rectas de calibrado de los fármacos antirretrovirales determinados.
10
15
minutos
Figura 4: Cromatograma de una muestra de plasma de un paciente en tratamiento
con lopinavir y ritonavir.
CONCLUSIONES
• El método permite la determinación de concentraciones plasmáticas de 10 fármacos antirretrovirales, incluyendo dos inhibidores de la proteasa de reciente
comercialización: atazanavir y tipranavir, en un tiempo de análisis inferior al descrito en otros métodos publicados.
• La aplicación de este análisis a la determinación de niveles plasmáticos de antirretrovirales en pacientes VIH positivos puede servir tanto para controlar la
adherencia como para mejorar la eficacia y seguridad del tratamiento antirretroviral.