2004_111_33 r bioquimico

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REB 23 (1): 33, 2004
RESPUESTA AL PROBLEMA BIOQUÍMICO
Pregunta 1. La digestión con cualquiera de las enzimas de
restricción P, K, A o C en forma individual (Fig. 1 carril a)
da como resultado un único fragmento, lo cual indica que
este ADN se encuentra en forma circular, ya que al ser
cortado en un único sitio en ambas cadenas, se lineariza y
su comportamiento electroforético se debe únicamente a su
tamaño y no a su forma. Si el ADN muestra fuera lineal, el
corte con una de éstas enzimas de restricción daría como
resultado dos fragmentos. Además el tamaño del
fragmento indica el peso molecular de la molécula de ADN
(43Kb).
Pregunta 2 . La figura 2 esquematiza la interpretación de
los resultados obtenidos del patrón de restricción.
Podemos escoger cualquier sitio de restricción único
como punto de origen de la molécula, por ejemplo el sitio
para P (Fig. 2, No. 1. La doble digestión P + K da como
resultado dos fragmentos (Fig.1, carril b), por lo que el sitio
de restricción para K está 3 kb alejado del sitio de P, con la
posibilidad de que esté en cualquiera de las dos
orientaciones (Fig. 2 No. 2) Lo mismo puede decirse por la
doble digestión P + A (Fig. 2, No. 3) donde el sitio de A está
a 12 kb del sitio de P (Fig. 1, carril c). Para discriminar entre
las cuatro posibles orientaciones, la triple digestión
P + A + K (Fig. 1, carril d) da como resultado que la banda
de 12 kb producto de la digestión con A conserva su
tamaño, mientras que la banda de 31 kb es cortada por K,
dando como resultado una banda de 29 kb y otra de 2 kb
(Fig. 1, carril d). Por lo tanto los sitios de A y K se
encuentran cada una en lados opuestos al sitio de P (Fig. 2
No. 4. ), ya que si estuvieran del mismo lado, la banda de 12
Kb producto de A tendría que ser cortada por K y este no es
el caso. Cable aclarar que también es válido representar la
molécula en espejo de la mostrada en el paso 4 de la figura
2.
La digestión P + C (Fig 1, carril e) da como resultado
dos fragmentos de tamaños 25 y 18 kb, aunque no
conocemos de qué lado está el sitio para C (Fig. 2. No. 5).
La triple digestión P + A + C (Fig. 1, carril f) indica que la
banda de 12 kb producto de la digestión con A se conserva,
mientras que la otra banda de 29 kb es cortada por C a una
distancia de 5 kb del sitio de A. Por lo tanto, el mapa de
restricción con estas cuatro enzimas de restricción es el
indicado en el paso 6 de la figura 2 o su imagen en espejo.
Pregunta 3. La hibridación con la sonda para el citocromo
b (*) en las dobles o triples digestiones que incluyen a la
enzima A muestran un patrón constante de hibridación con
la banda de 12 kb, producto de la digestión con A, por lo
tanto el gen que codifica para el citocromo b se encuentra
en algún lugar entre los sitios de P y A. Por otro lado, las
bandas que hibridan con la sonda para el ARNr 15s son
diferentes a las que hibridan con el cyt b, por lo que este
gen no se encuentra en la banda de 12 kb y se encuentra
en algún lugar de los 31 kb del resto de la molécula. La
triple digestión P + A + C indica que el ARNr 15s hibrida
con el fragmento de 5 kb, por lo que este gen se encuentra
entre los sitios de A y C de la molécula.
Conclusiones: Mapas de restricción más detallados
pueden obtenerse utilizando otras enzimas de restricción
con sitios únicos para considerarlos como puntos de
origen y realizar dobles (o triples) digestiones con
enzimas que tienen más sitios de corte dentro de las
moléculas. Esto puede delimitar más aún la localización
de secuencias importantes dentro del genoma de un
organismo.
P
(1)
!
!
P+K
K P
P+A
P
K
(3)
(2)
A
A
!
P+A+K
P
!
P +C
C
K
P
(4)
A
(5)
C
!
P+A+C
P
K
Cyt b
(6)
A
rRNA 15s
C
Figura 2: Mapa de restricción y localización de los
genes en el mtDNA de Kluyveromyces reconstruído a
partir de los patrones de restricción.