Efecto Overhauser Nuclear

EL EFECTO OVERHAUSER NUCLEAR
Jesús Jiménez Barbero
Centro de Investigaciones Biologicas, C.S.I.C.
Ramiro de Maeztu 9, 28040 Madrid
[email protected]
El NOE convencional (longitudinal)
Cuando cualquiera de dos spines, denominados I y S, siente el dipolo magnético del
otro, tiene lugar un fenómeno de interacción dipolo-dipolo denominado relajación cruzada
(cross-relaxation), por el que se transfiere magnetización a través del espacio de un spin al
otro. Por tanto, la intensidad de la señal del spin I debe cambiar cuando se perturba el estado
de equilibrio del spin vecino. La perturbación puede realizarse mediante saturación (S
originalmente se refería al spin saturado) o inversión con pulsos de radio-frecuencia. El
cambio de intensidad que nace de esta interacción dipolar se denomina efecto Overhauser
nuclear, (nuclear Overhauser enhancement, NOE). El cambio de intensidad del spin I está
gobernado por tres probabilidades de transición, de cero, uno y doble cuanto, denominadas
W0IS, W1I y W2IS, respectivamente. Estas describen los mecanismos de relajación cruzada en
un sistema ideal de dos spines. Con estas probabilidades de transición, el cambio de
intensidad en el spin I con el tiempo está definido por la ecuación de Solomon:
dIZ
dt
0
0
= -(IZ - IZ)(W 0IS + 2W1I + W2IS) - (S Z - SZ)(W 2IS - W0IS)
En esta ecuación, SZ e IZ son los componentes longitudinales de la magnetización de
los spines S y I (SZ0 e IZ0 a tiempo cero). La ecuación de Solomon es estrictamente aplicable
sólo para un sistema de spines ideal; es decir, para un par de spines aislados, sin acoplamiento
escalar, y que se encuentran en una molécula rígida y que gira de modo isotrópico.
Dependiendo de la velocidad de giro, la presencia mayoritaria de transiciones de cero cuanto
(movimientos lentos) o de doble cuanto (movimientos rápidos) causan que los efectos NOE
sean negativos o positivos, respectivamente.
176
Jesús Jiménez Barbero
I=δ
S=δ
INVERTIMOS LAS
TRANSICIONES
DE S
N
I=δ
S=-δ
W2
N-δ
W0
N+δ
N
Opera W2. La intensidad de I aumenta
Opera W0. La intensidad de I disminuye
N-∆
N
I=δ+∆
I=δ−∆
W2
N-δ
W2
W0
N+δ
N+∆
N-δ+∆
W0
N+δ−∆
N
Representación Esquemática del NOE generado por inversión de un spin S en un
sistema de dos spines IS.
El efecto Overhauser nuclear
177
La diferencia entre estas probabilidades (W2IS - W0IS), se denomina constante de
velocidad de relajación cruzada (σIS), y describe la velocidad de las transiciones dipolo-dipolo
que dan lugar al NOE. Por tanto, σIS es una medida de cuán rápido crece el NOE entre los
spines I y S. El otro término (ρIS), se llama constante de velocidad de relajación dipolar
longitudinal (W0IS + 2W1I + W2IS) y define la parte del mecanismo de relajación responsable
de restablecer el estado de equilibrio del spin I. Por tanto, incorporando estas definiciones y
considerando, por ejemplo, la saturación del spin S, en el estado estacionario debe cumplirse
que dIZ/dt = SZ = 0, con lo que:
0
IZ − IZ
σ
= IS
0
ρ IS
SZ
Puesto que, en principio, las componentes longitudinales de los spines S e I al
comienzo del experimento son idénticas, (SZ0 = IZ0), SZ0 puede sustituirse por IZ0 para calcular
el NOE máximo (η ) para el spin I en el estado estacionario, tras saturación del spin S:
0
η=
IZ - I Z
IZ0
=
γS
γI
σIS
ρIS
La relación entre los dos cocientes giromagnéticos (γS y γI) significa que esta ecuación
también es aplicable a sistemas en los que los dos spines, I y S tienen frecuencias de precesión
diferentes (ω), como 1H y 13C, lo daría lugar a NOEs heteronucleares (véase el capítulo de
relajación). Para NOE homonucleares, por ejemplo, 1H-1H, γS = γI.
En términos de las funciones de densidad espectral (véase capítulo de relajación), la
constante de velocidad de relajación cruzada puede expresarse como:
σ NOE =
1
(DHH )2 [6J (2ω ) − J (0)]
4
−3
DHH = (µ 0 / 4 π )γ H γ H hrHH
, donde µ 0 es la permitividad en el vacío y la función de densidad
espectral J(ω) puede definirse mediante la aproximación de Lipari y Szabo:
1 − S2 )τ 
2  S2 τ M
(

J (ω ) = 
2 2 +
2 2
5  1 + ω τM 1 + ω τ 
Las probabilidades de transición y, por tanto, también σIS y ρIS, dependen fuertemente
de las frecuencias de precesión (ω) de los spines y del tiempo de correlación del movimiento
global (τc) de la molécula. Este es una medida de la velocidad de reorientación de la molécula
en disolución y puede variar desde unos cuantos picosegundos, para moléculas pequeñas,
hasta decenas de nanosegundos, para biomacromoléculas. En definitiva, cuando estos
178
Jesús Jiménez Barbero
términos se incorporan a la ecuación anterior, se tiene que el máximo NOE homonuclear en el
estado estacionario es:
η
=
5 + ω²τ²c - 4ω4τ4c
10 + 23ω²τ²c + 4ω4τc4
A partir de esta ecuación, puede calcularse la variación del NOE homonuclear con la
velocidad de reorientación de la molécula, para una frecuencia de precesión determinada
ω (Figura 1). Para entidades que se mueven rápidamente en disolución, con tiempos de
correlación menores de 100 ps, como por ejemplo, moléculas de peso molecular bajo en
disolventes orgánicos, el NOE teórico máximo es de +50 %. Esta región de la curva del NOE
se denomina frecuentemente límite de estrechamiento extremo (extreme narrowing limit). Las
biomacromoléculas grandes se mueven mucho más lentamente en disolución, en la escala de
los nanosegundos, por lo que su NOE teórico máximo es de -100 %. A partir de las
probabilidades de transición, es posible observar que para tiempos de correlación cortos,
moléculas pequeñas, la probabilidad W2IS domina la constante de velocidad de relajación
cruzada y conduce a NOEs positivos, mientras que para moléculas grandes, la transición W0IS
es dominante, y lleva a NOEs negativos. Si ωτc = (5/4)1/2 = 1.12, la curva del NOE pasa por
cero, y el NOE teórico máximo desaparece. Dependiendo del tipo de molécula, de la
frecuencia del espectrómetro, de la temperatura y de la viscosidad del medio, esto sucede para
pesos moleculares entre 400 y 2000 Da).
ROE(τc)
0.5
0.0
NOEmax
ROEmax
-0.5
NOE(τc)
-1.0
1x10-11
1x10-10
1x10-9
1x10-8
τc [s]
Figura 1. La variación del NOE con el tiempo de correlación en un espectrómetro de 500 MHz. El
NOE se anula cuando 6J(2 ω) es igual a J(0).
El efecto Overhauser nuclear
179
Por supuesto, en la realidad, no existen sistemas de spin ideales y la relajación dipolar
entre los spines I y S no es el único mecanismo por el que tiene lugar relajación. En estos
casos reales, puede demostrarse que el NOE es inversamente proporcional a la inversa de la
sexta potencia de la distancia entre los núcleos correspondientes.
η∼
τc
r6
Dado un NOE entre una pareja de núcleos dada (por ejemplo, C y D), que están
separados por una distancia conocida, es posible determinar la distancia entre otros dos
núcleos (A y B), usando la relación mostrada en la ecuación siguiente. El uso de este
protocolo se conoce como aproximación de dos spines aislados, ya que asume que el entorno
de los núcleos es despreciable en la magnitud del NOE observado, lo que no es cierto.
NOE AB r −6 AB
=
NOE CD r −6 CD
Este tipo de dependencia del NOE de la inversa de la sexta potencia de la distancia
interprotónica provoca que exista un límite finito de la distancia máxima a la que pueden estar
dos núcleos de hidrógeno para que se genere un NOE detectable experimentalmente. Esta
distancia máxima también depende del tamaño de la molécula. Por ejemplo, en
biomacromoléculas la distancia puede llegar a 5 ó 6 Å, mientras que en moléculas de tamaño
mediano (por ejemplo, oligosacáridos o péptidos) es difícil que se encuentren NOES entre
protones que se encuentren a más de 4 Å de distancia. En todos los casos, la interpretación de
NOEs en términos de distancias está agravado por la presencia de movimientos internos, y
muy especialmente en moléculas flexibles. En cualquier caso, la mejor aproximación para el
tratamiento cuantitativo de los datos consiste en obtener la constante de velocidad de
relajación cruzada a partir de la construcción de la curva de crecimiento del NOE a distintos
tiempos de mezcla. La pendiente de la curva a tiempos de mezcla cortos es directamente
proporcional a σIS.
Figura 2. Curvas de crecimiento del NOE con el tiempo de mezcla para cuatro protones diferentes tras
la inversión de otro protón en el mismo tetrasacárido. Las pendientes son diferentes y, por tanto, las
distancias interprotónicas, también lo son.
180
Jesús Jiménez Barbero
Desde un punto de vista práctico, lo mejor es normalizar las intensidades de los NOEs
obtenidos con respecto a la intensidad del pico diagonal (o pico invertido en un experimento
monodimensional selectivo, véase más adelante) a tiempo de mezcla cero. Entonces, los
NOEs experimentales se ajustan a una función exponencial doble, f(t)=p0(e-p1t)(1-e-p2t) siendo
p0, p1 y p2 parámetros ajustables. La pendiente inicial se determina a partir de la primera
derivada a tiempo, t=0, f'(0)=p0p2. A partir de las pendientes, las distancias entre protones, r,
se obtienen a partir de la aproximación de spines aislados.
El NOE transversal (ROE)
Cuando la magnetización de los spines está confinada en el plano xy del sistema de
coordenadas, que rota con la velocidad del movimiento de precesión de los núcleos (llamado
el sistema de coordenadas giratorio, rotating frame), mediante la aplicación de un pulso largo
y de potencia intermedia (pulso de confinamiento, spin-lock), la relajación dipolar conduce al
denominado efecto Overhauser nuclear en el sistema rotatorio, ROE (Rotating frame
Overhauser Enhancement). Este experimento fue inventado por Bothner-By en 1984 y lo
denominó Camelspin (Cross-relaxation appropriate for mini-molecules emulated by spinlocking), aunque más tarde, Bax denominó ROESY a la versión bidimensional. Debido a la
similitud de este acrónimo con el de NOESY, este es el nombre con el que este experimento
se conoce hoy día.
El experimento tiene la ventaja fundamental de que el ROE es siempre positivo
(Figure 1), independientemente del tamaño de la molécula y de la frecuencia del
espectrómetro. Por tanto, se usa normalmente para detectar interacciones dipolares entre
protones que pertenecen a moléculas de tamaño intermedio, para las que los NOEs son muy
pequeños.
En términos de las funciones de densidad espectral (véase capítulo de relajación), el
ROE tiene su propia constante de velocidad de relajación cruzada, definida por:
σ ROE =
1
(DHH )2 [2 J (0 ) + 3J (ω )],
4
por lo que los ROEs son siempre positivos.
en esta ecuación, la función de densidad espectral J(ω) puede definirse mediante la
aproximación de Lipari y Szabo:
1 − S2 )τ 
2  S2 τ M
(

J (ω ) = 
2 2 +
2 2
5  1 + ω τM 1 + ω τ 
Desafortunadamente, no todo son ventajas. Dada la potencia del campo de
confinamiento (spin-locking field), en torno a los 3000 Hz, cada uno de los spines siente un
campo efectivo ligeramente distinto, que depende de la magnitud del campo de
confinamiento, ω1 y de su offset, ∆. Como consecuencia, el ROE no solo depende de la
distancia internuclear, sino también de los offset de los núcleos involucrados respecto a la
frecuencia a la que se aplica el campo de confinamiento. De hecho, cada spin siente un campo
efectivo que se encuentra inclinado un ángulo θ respecto al eje z del campo magnético
estático:
El efecto Overhauser nuclear
181
θ = arctan(ω 1 ∆ )
Por tanto, la interpretación de los ROEs no es trivial. En numerosas ocasiones, el
campo de confinamiento no se aplica en el centro del espectro, lo que, en principio,
minimizaría los efectos del offset. Esto se debe a la existencia del efecto Hartmann Hahn
Homonuclear (HOHOHA), que es la base del experimento TOCSY (véase el capítulo
correspondiente). En este experimento también se usa un campo de confinamiento, que
intenta que todos los spines sientan el mismo campo efectivo. La potencia típica del campo de
confinamiento en experimentos TOCSY es superior a la del ROESY, en torno a los 1500020000 Hz. Sin embargo, pese a la menor potencia empleada en el ROESY, es casi inevitable
que los componentes de alguna pareja de spines acoplados escalarmente sientan un campo
efectivo similar, se produzca el efecto Hartmann Hahn Homonuclear, y aparezcan artefactos
de tipo TOCSY en los espectros ROESY.
Los picos TOCSY y ROESY pueden diferenciarse por su signo, ya que los primeros
son del mismo signo que los picos diagonales y los segundos son de distinto signo que la
diagonal. No obstante, los picos ROE entre spines acoplados escalarmente pueden anularse
parcialmente por la combinación ROESY/TOCSY, y peor aún, la combinación de
transferencias ROESY (entre A y B) y TOCSY (entre B y C) pueden conducir a picos
espurios (entre A y C) que conduzcan a interpretaciones erróneas. Dadas estas
complicaciones, los experimentos ROESY son difíciles de interpretar.
Con objeto de minimizar los efectos HOHAHA, Hwang y Shaka propusieron el
experimento de ROE inclinado (tilted-ROE, T-ROE), que consiste en una combinación lineal
de ROE y NOE, y en el que una alternancia de fase durante el período de confinamiento
permite minimizar los efectos del acoplamiento escalar.
En este experimento, la constante de velocidad de relajación cruzada, σ T − ROE , es un promedio
entre σ NOE y σ ROE y puede describirse como:
1
2
σ T − ROE = (DHH ) [6 J (2ω ) + 3 J (ω ) + J (0)]
8
De nuevo, la función de densidad espectral J(ω) puede definirse mediante la aproximación de
Lipari y Szabo:
1 − S2 )τ 
2  S2 τ M
(


J (ω ) =
2 2 +
2 2
5  1 + ω τM 1 + ω τ 
Aunque el valor de σ T − ROE es menor que el de σ ROE , es recomendable usar esta
secuencia de pulsos frente a la ROESY clásica.
182
Jesús Jiménez Barbero
La distinta de dependencia de las constantes de velocidad de relajación cruzada de las
funciones de densidad espectral ha sido utilizada para detectar movimientos moleculares de
distintas frecuencias. De hecho, la secuencia off-resonance ROESY, que se basa en la
combinación lineal de NOE y ROE, permite minimizar los efectos HOHAHA y además
puede usarse para determinar, cuantitativamente, tiempos de correlación locales para distintas
parejas de protones de la molécula. Desde el punto de vista experimental, el período de
confinamiento (spin-lock) se consigue mediante la aplicación de una radiofrecuencia ω1 de
unos ~10 kHz, pero que está sensiblemente desplazada del centro del espectro. De nuevo, este
desplazamiento (offset) del campo de radiofrecuencia provoca que cada spin, con un offset ∆,
sienta un campo efectivo que se encuentra inclinado un ángulo θ respecto al eje z del campo
magnético estático:
θ = arctan(ω 1 ∆ )
donde ω1 es la amplitud del campo de radiofrecuencia (RF) y ∆, la distancia en Hz entre la
posición de la frecuencia portadora de este campo RF y la frecuencia de cada spin.
Desde el punto de vista experimental, se realizan varios experimentos en el intervalo 10° < θ
< 55°, ya que puede demostrarse que la contribución del HOHAHA es mínima si θ < 60°.
Como en cualquier experimento de NOE, lo mejor es construir curvas de crecimiento de
NOEs con el tiempo de mezcla, para distintas parejas de protones para deducir las constantes
de velocidad de relajación cruzada ROE off-resonance, σ OR − ROE , que pueden usarse en un
protocolo de ajuste para obtener directamente σ NOE y σ ROE :
σ OR− ROE = σ NOE cos2 θ + σ ROE sin2 θ
σ ROE =
1
(DHH )2 [2 J (0 ) + 3J (ω )] y σ NOE = 1 (DHH )2 [6 J (2ω ) − J (0)]
4
4
donde DHH depende de la distancia interprotónica y una serie de constantes. Por tanto, como la
El efecto Overhauser nuclear
183
función de densidad espectral J(ω) solamente depende de la frecuencia del espectrómetro y de
la amplitud y frecuencia de los movimientos, el cociente entre ambas constantes de velocidad
de relajación σ NOE / σ ROE solamente depende de los movimientos moleculares y es
independiente de la distancia.
Así, a partir de las velocidades de relajación cruzada entre dos protones i y j se
obtienen los tiempos de correlación efectivos para cada pareja de protones ( τ cp ), así como las
distancias interprotónicas correspondientes ( r ij ), una vez que se escoja un modelo
determinado para la función de densidad espectral. Por tanto, el uso de off-resonance ROESY
permite tener en cuenta la dinámica interna de la molécula antes de determinar la estructura
tridimensional de la misma.
Figura 3. En moléculas flexibles, distintas parejas de protones pueden dar lugar a NOEs positivos,
mientras que otras parejas dan lugar a NOEs negativos, dependiendo de sus tiempos de correlación
efectivos (espectros de la derecha a 298 K). Al aumentar la temperatura, los movimientos se hacen más
rápidos y todos los NOEs son positivos (espectros de la izquierda).
La Matriz de Relajación
Obviamente, las moléculas tienen más de dos núcleos 1H entre los que puede
detectarse un NOE y, por tanto, muestran un comportamiento mucho más complejo que el que
puede predecirse a partir de un modelo ideal de dos spines. Las intensidades de los NOEs en
sistemas de muchos spines se describen más adecuadamente mediante ecuaciones que
emplean matrices. En experimentos transitorios (véase más adelante), las intensidades de los
NOEs (a) varían en función del tiempo de mezcla del experimento, τm, de acuerdo con la
matriz siguiente:
a ( τ m ) = e − Rτ m
184
Jesús Jiménez Barbero
en la que R es la matriz de relajación completa, que consiste de los elementos de la diagonal,
ρi (constantes de velocidad de relajación longitudinal de los spines i) y de los elementos de
fuera de la diagonal, σij = σji (constantes de velocidad de relajación entre los spines i y j).
ρ1 σ12
σ21 ρ2
R = ...
...
σn1 ...
...
...
...
...
σ1n
...
...
ρn
Esta ecuación puede resolverse numéricamente calculando la matriz diagonal de los
valores propios (D) y la matriz de los vectores propios (T) de R.
a ( τ m ) = T exp( − Dτ m )T −1
Puesto que tanto ρi como σij dependen de rij-6, la matriz de relajación puede usarse para
calcular los NOEs teóricos, dadas las distancias internucleares, o dado un conjunto completo
de intensidades NOESY, puede determinarse una matriz de distancias internucleares. La
aproximación mencionada aquí es válida para spines débilmente acoplados y se basa en que el
movimiento global de la molécula es rígido e isotrópico; es decir, que la rotación de todos los
spines de la molécula puede describirse mediante un parámetro único (τc). No obstante, se han
realizado aproximaciones para incluir efectos de movimientos anisotrópico, de correlación
cruzada, cross-correlation, o de acoplamiento escalar fuerte. La presencia de movimientos
internos representa otro grave problema para el tratamiento cuantitativo de los NOEs, que
requiere la asignación de tiempos de correlación efectivos o parámetros de orden diferentes
para distintas parejas de protones de la molécula (véase el capítulo de relajación).
El tratamiento de la matriz de relajación permite explicar el fenómeno de difusión de
spin, que define la transmisión de efecto NOE entre protones que están próximos a un tercero
(o varios). La perturbación del estado de equilibrio de un spin I por inversión de S produce
una perturbación en el estado de equilibrio de un tercer spin, J, si está próximo a I. Este
fenómeno es muy eficiente en macromoléculas y conduce a la transmisión de NOEs a
distancias relativamente alejadas del spin perturbado inicialmente. Puede demostrarse que,
para macromoléculas, tanto los picos de cruce NOE directos, como los que provienen de
difusión de spin tienen el mismo signo (negativo, igual que los picos diagonales). En cambio,
en moléculas pequeñas, los picos de NOE que provienen de difusión de spin cambian de signo
alternadamente. Es decir, el pico de cruce en un tercer spin que proviene de difusión de spin
es negativo, al contrario que el directo (positivo, en moléculas pequeñas). Por tanto, los
efectos indirectos (efecto de tres spines) pueden diferenciarse de los directos en moléculas
pequeñas (o en todas las moléculas empleando ROESY o sus modificaciones T-ROESY, off
resonance ROESY).
El efecto Overhauser nuclear
185
Representación esquemática del fenómeno de difusión de spin en un sistema de tres
spines
Los experimentos NOE en 1D y 2D
Para que la relajación cruzada entre dos spines, o más, tenga lugar, es necesario que el
estado de equilibrio de al menos uno de ellos sea perturbado mediante saturación o inversión.
Durante muchos años, los NOEs se obtuvieron mediante su medida en estado estacionario,
mediante el registro de experimentos 1D en los que se saturaba, durante varios segundos, una
resonancia dada del espectro (on-resonance) y se restaba de otro experimento, realizado en las
mismas condiciones, en el que la saturación tenía lugar en una zona del espectro sin señales
de resonancia (off-resonance). Estos experimentos se han empleado muy frecuentemente,
aunque tienen la limitación de que la saturación sea incompleta o no sea totalmente selectiva,
dependiendo de la complejidad del espectro.
Hoy es frecuente el empleo de experimentos transitorios, en los que el spin escogido
se invierte mediante un pulso selectivo de radiofrecuencia y se sigue el crecimiento del NOE
generado en los spines próximos, durante el denominado tiempo de mezcla, τm.
Desde una perspectiva teórica, el NOE máximo para un experimento transitorio en el
límite de estrechamiento extremo es del 38.5%, mientras que en estado estacionario es del
50%. No obstante, aparte de esta pequeña diferencia, la dependencia del NOE transitorio con
ωτc se ajusta a la curva representada en la Figura 1. La secuencia de pulsos básica del
experimento 2D NOESY, así como del 2D ROESY y de sus experimentos
monodimensionales correspondientes se da en la Figura 4.
186
Jesús Jiménez Barbero
1H
90°
∆
τm
2D NOESY
τm
1D NOESY
τm
1D transient NOE
Selective
90° or 270°
Selective
180°
1H
Selective
180°
τm
1D DPFGSE NOE
PFG
1H
90°
*
∆
Selective
90° or 270°
τm
SL
*
2D ROESY
τm
SL
1D ROESY
Figura 4. Representación esquemática de distintas secuencias de pulsos básicas para generar NOE en
distintas condiciones.
En la secuencia 2D NOESY de la Figura 4, los dos primeros pulsos de 90º y el período
de evolución t1, aquí representado por ∆, seleccionan e invierten los spines (-Sz cosωS∆).
Durante el tiempo de mezcla subsiguiente (τm), la relajación cruzada conduce a una
transferencia de magnetización incoherente a lo largo del eje longitudinal (-Sz cosωS∆→ -Iz
cosωS∆). El ultimo pulso envía la magnetización longitudinal al plano transversal (-Iy
cosωS∆), tal que ahora es observable durante el período de adquisición, t2 (-Iy cosωS∆
cosωIt2). El tiempo de evolución ∆ se incrementa sistemáticamente en los distintos
experimentos y el espectro bidimensional se obtiene por dos transformadas de Fourier
consecutivas en t2 y ∆ (t1).
En principio, la adquisición de un experimento 2D NOESY simplemente requiere de
la calibración cuidadosa del pulso de 90°, junto con la estimación de los tiempos de demora
entre pulsos, tiempo de mezcla y tiempos de adquisición más adecuados para la muestra en
El efecto Overhauser nuclear
187
cuestión. En general, en macromoléculas se emplean tiempos de mezcla menores de 200 ms,
para evitar los efectos de la difusión de spin, mientras que en moléculas pequeñas pueden
emplearse tiempos de mezcla de varios centenares de ms, hasta llegar a 1 s. Obviamente, el
control de la temperatura es esencial, así como la decisión sobre el número de scans e de
incrementos óptimo para conseguir las señales adecuadas con el menor ruido posible. Como
ejemplos, se muestran los espectros 2D NOESY de distintos pseudodisacáridos (Figura 5C,
D, E) y de una proteína (Figura 6).
Figura 5. Representación de distintos experimentos NOESY (C) y T-ROESY (D, E) de tres distintos
pseudodisacáridos. Algunos 1D-DPFGSE NOESY se muestran en A y B. Los picos de cruce son de
distinto signo de los picos diagonales.
Los experimentos 1D (Figura 4) pueden derivarse sencillamente de cualquier
secuencia bidimensional, eliminando el período de evolución y combinando los primeros
pulsos de la secuencia. Los primeros experimentos 1D mostrados, 1D NOESY, 1D transient
NOE y 1D ROESY siguen estas reglas. Está demostrado que los pulsos gaussianos de 270° se
comportan mejor que los gaussianos o semi-gaussianos de 90°, en este tipo de experimentos.
Sin embargo, la mejor selección de una resonancia dada se consigue mediante la
utilización de la secuencia de doble eco de spin, con gradientes de pulso (DPFGSE, double
pulsed-field-gradient spin-echo), seguida de un pulso de 90º para enviar la magnetización
deseada al eje longitudinal, y del período de crecimiento de NOE durante el tiempo de
mezcla.
Con el modulo DPFGSE, se excita selectivamente una resonancia, mientras que el
resto de las señales se desfasa mediante el empleo de los gradientes de pulso (véase el
capítulo correspondiente), antes del comienzo del tiempo de mezcla y, por tanto, no
contribuye al espectro final. Mediante este protocolo, los artefactos se reducen enormemente,
por lo que es el método de elección para moléculas de tamaño pequeño o intermedio (Figura
5AB).
188
Jesús Jiménez Barbero
Hβ
β30/HN27
Hβ
β30/HN25
Hα
α28/HN3
2
27
31 30
32
25
29
28
26
Figura 6. Representación de una parte de espectro NOESY de una proteína pequeña. Los
picos de cruce son del mismo signo de los picos diagonales.
NOESY Transferido (TR-NOESY)
El NOE transferido (TR-NOE) fue inventado por Bothner-By y más tarde utilizado
por Feeney y sus colaboradores, así como por Clore y Gronenborn. Este experimento permite
conocer la conformación bioactiva de ligandos en el sitio de reconocimiento de receptores
macromoleculares. El TR-NOESY se realiza mediante una secuencia NOESY normal
aplicada a un ligando en intercambio entre su estado libre y asociado. A veces, dependiendo
del tamaño del receptor, se incluye un período corto de spin-lock (ca. 10 ms), después del
primer pulso de 90º, y con la fase desplazada 90º, para desfasar las señales del receptor. El
ligando está en exceso respecto al receptor (ca. 50:1), por lo que los desplazamientos
químicos observados están muy próximos a los del ligando libre. En general, si el intercambio
es rápido en la escala de tiempos de la relajación, estos experimentos funcionan muy bien. Ya
que el ligando asociado adopta el movimiento lento de la macromolécula receptora, las
constantes de velocidad de relajación de los protones del ligando en el estado asociado
(bound, σB), son negativas y de distinto signo de las del estado libre (free, σF). Por tanto, los
picos de cruce del TR-NOESY son negativos, aunque el ligando sea muy pequeño. En este
sentido, el fenómeno de difusión de spin puede conducir a interpretaciones erróneas, por lo
El efecto Overhauser nuclear
189
que es conveniente complementar los experimentos TR-NOESY con TR-ROESY o con
módulos de tipo QUIET-NOESY, que bien detectan o eliminan los picos de cruce que
provienen de difusión de spin. Por tanto, la existencia de interacción ligando-receptor puede
detectarse fácilmente mediante inspección visual de los picos de cruce. Las condiciones para
que el experimento funcione son bien conocidas y dependen críticamente de la constante de
velocidad de disociación del complejo y de la relación molar empleada.
H4
H1
H1
H
H
H3
2
H3
H4
H2
LIBRE
ASOCIADO
1
1
3
2 3
4
4
4
3
2
NOESY
3
2
3
1
1
4
3
2
2
1
1
TR-NOESY
TR-ROESY
RECEPTOR + LIGANDO(exceso) ↔ RECEPTOR.LIGANDO
pbσB > pfσF
k-1>>σB
pb y pf son las fracciones molares de ligando asociado y libre y σB y σF las constantes de
velocidad de relajación cruzada correspondientes, respectivamente; k-1 es la constante de
velocidad de disociación. Es obvio que para que se cumplan estas condiciones, la velocidad
de disociación tiene que ser rápida en la escala de tiempos de la relajación, lo que es cierto
normalmente para asociaciones en el rango micromolar y milimolar.
Aunque el mejor tratamiento cuantitativo de los datos de TR-NOE implica el uso de la
matriz de relajación completa, que incluya una matriz cinética que contemple la presencia de
intercambio químico, como aproximación puede demostrarse que, si se cumplen las
condiciones indicadas arriba,
σobs = pbσB + pfσF
190
Jesús Jiménez Barbero
Agradecimientos
Agradezco al MECD por su apoyo económico (BQU2003-03550-C03-01), así como a
todos mis colaboradores por su apoyo continuo y donación de las figuras que se incluyen en
este capítulo; en concreto, Dr. Javier Cañada, Dr. Juan Luis Asensio, Dr. Juan Félix Espinosa,
Dr. Angeles Canales, Dr. Patrick Groves, Dr. Nuria Aboitiz, Dr. Matteo Politi, Dr. Dolores
Díaz, Dr. Blanca López, Dr. Alba Silipo, Mª Carmen Fernández, Silvia Mari, Víctor García,
Isabel Chavez, Paloma Vidal, José Manuel Alonso, y José Juan Hernández.
Referencias
GENERALIDADES
A. W. Overhauser, Phys. Rev. 1955, 92, 411-415.
D. Neuhaus and M. Williamson, The Nuclear Overhauser Effect in Structural and
Conformational Analysis, Wiley-VCH, New York, 2000.
J. Jiménez-Barbero, T. Peters, NMR of Glycoconjugates, Wiley VCH, Weinheim, 2002
I. Solomon, Phys. Rev. 1955, 99, 559-565.
ROESY
A. Bax, D. G. Davis, J. Magn. Reson. 1985, 63, 207-213.
A. A. Bothner-By, R. L. Stephens, J.-M. Lee, J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, 811-813.
Matriz de Relajación
R. Boelens, T. M. G. Koning, G. A. Van der Marel, J. H. Van Boom, R. J. Kaptein, J. Magn.
Reson. 1989, 82, 290-308.
B. A. Borgias, T. L. James, Methods Enzymol. 1989, 176, 169-183.
Matriz de Relajación con Intercambio Químico (TRNOESY)
R. E. London, M. E. Perlman, D. G. Davis, J. Magn. Reson. 1992, 97, 79-98.
Movimientos Internos
G. Lipari, A. Szabo, J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 4546-4559, 1982, 104, 4559-4570.
A. Poveda, M. Martín-Pastor, J. Jiménez-Barbero, Glycoconj. J. 1998, 15, 309-321
J. L. Asensio, F. J. Cañada, X. Cheng, N. Khan, D. R. Mootoo, J. Jiménez-Barbero, Chem.
Eur. J. 2000, 6, 1035-1041.
J. L. Asensio, A. Hidalgo, I. Cuesta, C. González, J. Cañada, C, Vicent, J. L. Chiara, G.
Cuevas, J. Jiménez-Barbero, Chem. Eur. J. 2002, 8, 5228-5240.
Pulsos Selectivos
H. Kessler, S. Mronga, G. Gemmeker, Magn. Reson. Chem. 1992, 29, 527-557.
L. Emsley, G. Bodenhausen, J. Magn. Reson. 1989, 82, 211-221.
Crecimiento del NOE con el tiempo de mezcla. Pendiente Inicial
T. Weimar, B. Meyer, T. Peters, J. Biomol. NMR, 1993, 3, 399-414.
1D DPFGSE NOE
K., Stott, J. Stonehouse, J. Keeler, T.-L. Hwang, A. J. Shaka, J. Am. Chem. Soc., 1995, 117,
4199-4200.
El efecto Overhauser nuclear
191
T-ROESY
T.-L. Hwang, A. J. Shaka, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 3157-3159.
T.-L. Hwang, A. J. Shaka, J. Magn. Reson., Ser. B 1993, 102, 155-165.
A. Poveda, J. L. Asensio, M. Martín-Pastor, J. Jiménez-Barbero, Carbohydr. Res. 1997, 300,
3-10.
Off resonance ROESY
H. Desvaux, P. Berthault, N. Birlirakis, M. Goldman, J. Magn. Reson. A 1994, 108, 219
H. Desvaux, M. Goldman, J. Magn. Reson., Ser. B 1996, 110, 198-201.
A. Poveda, M. Santamaría, M. Bernabé, A. Rivera, J. Corzo, J. Jiménez-Barbero, Carbohydr.
Res. 1997, 304, 219-228.
G. Lippens, J.-M. Wieruszkski, D. Horvath, P. Talaga, J.-P. Bohin, J. Am. Chem. Soc. 1998,
120, 170-177.
TR-NOESY
A. A. Bothner-By, R. Gassend, Ann. N. Y. Acad. Sci. 1973, 222, 608-614.
J. P. Albrand, B. Birdsall, J. Feeney, G. C. K. Roberts, A. S. V. Burgen, Int. J. Biol.
Macromol. 1979, 1, 37-41.
T. Haselhorst, J. F. Espinosa, J. Jiménez-Barbero, T. Sokolowski, P. Kosma, H. Brade, L.
Brade, T. Peters, Biochemistry 1999, 38, 6449-6459.
V. L. Bevilacqua, D. S. Thomson, J. H. Prestegard, Biochemistry 1990, 29, 5529-5534.
J. L. Asensio, F. J. Cañada, and J. Jimenez-Barbero. Eur. J. Biochem. 1995, 233, 618-630.
J. F. Espinosa, J. L. Asensio, J. Cañada, H. Dietrich, M. Martin-Lomas, R.R. Schmidt, J.
Jimenez-Barbero, Angew. Chem. Int. Ed. 1996, 35, 303-306.
J. F. Espinosa, E. Montero, J. L. Garcia, H. Dietrich, R. R. Schmidt, M. Martin-Lomas, A.
Imberty, J. Cañada, J. Jimenez-Barbero, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1309-1316.
J. L. Asensio, J. F. Espinosa, H. Dietrich, F. J. Cañada, R. R. Schmidt, M. Martín-Lomas, H.J. Gabius, J. Jiménez-Barbero, J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 8995-9000.
J. F. Espinosa, F. J. Cañada, J. L. Asensio, M. Martín-Pastor, H. Dietrich, M. Martín-Lomas,
R. R. Schmidt, J. Jiménez-Barbero, J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 10862
E. Montero, M. Vallmitjana, J. A. Perez-Pons, E. Querol, J. Jiménez-Barbero, J. Cañada,
Febs Lett. 1998, 421, 243-248.
QUIET-TRNOESY
S. F. J. Vincent, C. Zwahlen, C. B. Post, J. W. Burgner, G. Bodenhausen, Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 1997, 94, 4383-4388.
192
Jesús Jiménez Barbero