Análisis de patrones de restricción (PRA) de Mycobacterium leprae

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
Análisis de patrones de restricción (PRA) de Mycobacterium leprae
obtenido de lepromas humanos y de armadillo de Corrientes, Argentina
Zumarraga, M.1 - Resoagli, E. H.2 - Cicuta, M. E.2 - Martínez, A. R.2
Cataldi, A.1 - Alito, A.1 - Bigi, F.1 - Romano, M. I.1
1) Instituto de Biotecnología (CICV-INTA) - Castelar - Buenos Aires.
E-mail: [email protected]
2) Programa Experimental en Armadillo (PEA) - Facultad de Ciencias Veterinarias - UNNE.
Sgto. Cabral 2.139-3400 Corrientes.
Tel./Fax: +54 (03783) 425753 / 422945 - E-mail: [email protected]
ANTECEDENTES
La lepra salvaje en el armadillo de nueve bandas (Dasypus novemcinctus, Linné,1758) cursa con la
presencia de abundantes bacilos con localización preferentemente linfo-espleno-hepática, con compromiso
nervioso y dérmico, tal cual se pudo observar en animales capturados en la provincia de Corrientes,
Argentina, zona endémica de la enfermedad en humanos (Resoagli y col., 1979,1982). Se reconoció
Mycobacterium leprae, en armadillos naturalmente infectados, a través de técnicas tintoriales específicas
(Ziehl-Neelsen, Fitte-Faraco y King-Young), pérdida de la ácido-alcohol resistencia (AAR) por extracción
con piridina, prueba de la D-Dopa oxidasa, cultivos negativos, replicación en almohadilla plantar de ratón
(técnica de Shepard) y reacción a la bacterina armadillo (BA) elaborada, similar a la lepromina bacilar (LBN40) probada en pacientes humanos con diferentes formas de la enfermedad (Martínez y col.,1984).
Un método para la rápida identificación de micobacterias a nivel de especie fue desarrollado en base
a la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del gen hsp65 presente en todas las
micobacterias y la posterior digestión con dos enzimas de restricción BstEII y HaeIII (Telenti et al, 1993). El
análisis de los fragmentos de restricción de los productos de PCR (PRA) ofrece una alternativa rápida y fácil
que permite la identificación de la especie, sin la necesidad de equipamiento especializado (Rastogi et al.,
1999).
MATERIALES Y METODOS
Se extrajo ADN de las micobacterias presentes en hígado, linfoglándula patelar y axilar de un
animal naturalmente infectado capturado dentro del Programa Experimental en Armadillo (PEA), y de dos
lepromas humanos de pacientes de la misma provincia. Se disgregaron aproximadamente 0,5 g de cada tejido
manualmente con micropilones. El macerado fue suspendido en 300 µl de buffer Tris-EDTA (TE ) 1x con 10
µl de PK (10 mg/ml) e incubada toda la noche a 37 ºC. Luego se incubó 2 hs a 37 ºC con 50 µl de lisozima y
posteriormente se agregaron 100µl de SDS 10% y 10 µl de PK y se incubó 15 minutos a 65 ºC. Se realizaron
dos extracciones de igual volumen con fenol-cloroformo-isoamílico (24-24-1) y una con cloroformoisoamílico (24-1). Se agregaron 100µl NaCl 5M y se precipitó con etanol absoluto a -20 ºC durante la noche.
Se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 minutos descartándose el sobrenadante. Luego de dos lavados con
etanol 70% se resuspendió en 40 µl de buffer TE 1x. Se usaron para PCR 1 µl de DNA. Se amplificó un
fragmento de 439 pb con los primers Tb11 y Tb12, de acuerdo con el procedimiento descripto por Telenti et
al, (1993) y el producto de amplificación obtenido fue digerido con BstEII y HaeIII. Los fragmentos de la
digestión fueron separados en una electroforesis en agarosa al 3% con bromuro de etidio y se visualizaron al
UV. Se empleó como marcador de peso molecular al 50 pb DNA Ladder (Gibco BRL).
Se amplificaron además ADN de M. scrofulaceum, M. szulgai, M. avium y M. tuberculosis
complex.
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DISCUSION DE RESULTADOS
Los resultados del PRA se observan en la Figura 1.
FIG.1. Gel de PRA luego de la digestión con BstEII (calles 1 a 11) y HaeIII (calles 12 a 22) de
fragmentos de ADN de 439 pb amplificado de M. scrofulaceum (calles 1 y 12), M. szulgai (calles 2 y 13), M.
avium (calles 3 y 14), M. tuberculosis complex (calles 4 y 15) y M. leprae de armadillo (calles 6,7,10,17,18 y
21) y de lepromas humanos (calles 5,8,9,16,19 y 20); marcador de peso molecular (calles 11 y 22).
Los patrones de las seis muestras clínicas analizadas fueron idénticos entre sí y coincidentes con los
de M. leprae, descriptos en la bibliografía (Mehra et al., 1986 y Rastogi et al., 1999) que se caracterizan por la
obtención uniforme de dos fragmentos de 315 y 135 pb con la digestión con BstEII y dos fragmentos de 265
y 130 pb con la digestión con HaeIII que están de acuerdo con las secuencias publicadas del antígeno de 65kDa
CONCLUSIONES
Como M. leprae es una micobacteria no cultivable, consecuentemente el diagnóstico de rutina de
lepra está aún basado en la demostración de al menos dos de las siguientes observaciones (Talhari,S., 1996
citado por Rastogi et al., 1999): lesión de piel característica, pérdida de sensibilidad, compromiso nervioso o
presencia de BAAR en improntas de lesión de piel. Dentro de este contexto, el rápido diagnóstico por
métodos de biología molecular ha encontrado un renovado interés en grupos científicos que han descripto una
variedad de técnicas como amplificación de secuencias repetitivas específicas de M. leprae (Yoon, K.H. et
al., 1993), hibridación in situ (Arnoldi et al., 1992), amplificación génica usando nested-primer
(Plikaytis et al., 1990), amplificación del gen que codifica un antígeno de 36 kDa (Hartskeerl et al, 1989), del
gen de 530 pb que codifica un antígeno rico en prolina (de Wit et al, 1991), del fragmento de 360 pb del gen
que codifica aproximadamente el 80% de una proteína de 18-kDa (Williams et al, 1990), o por PCR, usando
una secuencia única de ARN ribosomal de 16S (Cox et al., 1991).
Se concluye que el método PRA es relativamente simple y fue capaz de discernir una variedad de
especies de micobacterias en un solo experimento, permitiendo la identificación concluyente de M. leprae.
Estos estudios, efectuados por primera vez en Argentina, corroboran los hallazgos iniciales en Sudamérica
hecho por este grupo de investigación, sobre la detección de armadillos naturalmente infectados con el bacilo
de Hansen (Resoagli y col., 1979,1982) y la reacción similar de la prueba efectuada en pacientes humanos con
bacterina armadillo (BA) obtenida de este animal y lepromina bacilar (LBN-40) confirman que siempre se
trató de lepra natural o salvaje, adquirida por estos animales en el medio ambiente (Martínez y col. 1984).
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BIBLIOGRAFIA
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