GENETICA BACTERIANA

GENETICA BACTERIANA
Griffiths A., Wessler S., Lewontin R., Gelbart W., Suzuki D., Miller J. (2005) Introduction to
Genetic Analysis (8th ed). W.H. Freeman and Company, New York. QH430/I59/2005
Las bacterias poseen todos
los componentes requeridos
para reproducirse, cosechar
y utilizar la energía del
ambiente.
Se reproducen rápidamente,
una célula da origen a dos
idénticas en cada ciclo de
división, produciendo un
colonia de individuos
idénticos.
Suspensión
celular
bacteriana
Suspensión plaqueada en
caja con agar
Incubación
1 – 2 días
Caja Petri
con agar
Células
individuales
invisibles a
simple vista
Colonias visibles procedentes
de una célula individual
(mismo genotipo y fenotipo)
Mutantes bacterianas
Prototróficas : Son bacterias silvestres que pueden crecer en medios
mínimos (sales inorgánicas, fuente de carbono –
glucosa y agua). A partir de estas sustancias mínimas
las bacterias pueden construir todas las macromoléculas
necesarias para vivir.
Auxotróficas : Las bacterias son generalmente mutantes y no pueden
crecer a menos que se adicionen al medio nutrientes
específicos (Adenina, biotina, metionina, etc.)
Resistencia o susceptibilidad a antibióticos
Marcadores Genéticos
Requiere biotina como suplemento
Requiere arginina como suplemento
Requiere metionina como suplemento
No puede utilizar lactosa como fuente de carbono
No puede utilizar galactosa como fuente de carbono
Resistente al antibiótico estreptomicina
Susceptible al antibiótico estreptomicina
Medio mínimo: medio sintetico básico para el crecimiento bacteriano
sin nutrientes adicionales
Transferencia
genética horizontal
Transferencia
genética vertical
Mecanismos de Transferencia Genética Horizontal
La bacteria donadora es la que contribuye con una
fracción de material genético a la bacteria receptora
El fragmento de DNA donado es llamado exogenota
y el genoma receptor el endogenota
Una bacteria que contiene ambos DNAs, el
exogenota y el endogenota es merocigoto
a+
b+
Exogenota
Endogenota
a
b
Material Genético Transferido
DNA bacteriano
DNA plasmídico
DNA viral
Conjugación bacteriana
E. coli
William Hayes, 1953
F+ (Factor de fertilidad)
FPili
F+
Plásmido F
*Plásmido F codifica alrededor de 100 genes
GENOTIPO
FENOTIPO
¿Es el plásmido F el responsable de fenotipo
WT después de la Conjugación?
F+
F–
¡La frecuencia de transferencia de F es mayor a la
frecuencia de recombinantes para los marcadores genéticos
que se estudiaron!
Estos marcadores genéticos residen en el DNA
del cromosoma bacteriano
Para la transferencia de
DNA del cromosoma
bacteriano mediante
conjugación, se necesita la
INSERCIÓN del plásmido
F al cromosoma generando
una célula Hfr
High Frequency of
Recombination
Integración de F al
cromosoma bacteriano
El bajo nivel de transferencia de marcadores genéticos se debe
a la presencia de unas pocas celulas Hfr en la población F+
La inserción de plásmido F en el cromosoma bacteriano puede ocurrir en
diferentes lugares mediante recombinación (sitios IS y Tn1000 )
Integración del plásmido F al cromosoma
O
Orientación
del origen O
O
Dependiendo de la orientación del Origen de replicación de F
durante la integración, comenzarán a transferirse los
marcadores genéticos
Experimentos de conjugación interrumpida
Wollman y Jacob, 1957
azis
tons
lac
gal
azir
tonr
lac+
gal+
F- strr × Hfr strs
Str +
Después de 2 h
algunos exconjugantes
se convierten en Hfr
F d c
b a O
Orden de Transferencia de Marcadores Genéticos
Dos eventos de recombinación
Generalmente la Conjugación se interrumpe antes de que se
transfiera todo el Hfr; el exogenota es lineal y el endogenota es
circular. Ocurren dos eventos de recombinación.
Recombinación entre exogenote y endogenote
No viable
¡ Doble entrecruzamiento !
a+
a–
a–
No viable
+
a+
Merocigoto
Viable
Recombinantes
recíprocos
Conclusiones:
1. El cromosoma de E. coli es circular.
2. El plasmido F es circular.
3. La orientación en la que se intergra F al
cromosoma determina la polaridad del cromosma
Hfr.
4. Un extremo de F integrado es el Origen donde
comienza la transferencia y el otro extremo es el
término que NO se transfiere a menos que antes
se haya transferido TODO el cromosoma Hfr.
Resumen de la Conjugación bacteriana
PLÁSMIDOS
Elementos de ADN extracromosomal, de doble cadena
circular, covalentemente cerrado. Contienen: origen propio
de replicación, sitios de reconocimiento para enzimas de
restricción, marcadores de selección (resistencia a
antibióticos). Presentes en elevado número de copias en la
célula.
1.
2.
3.
4.
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8.
9.
Eco RI
Sa/I
tetracycline resistance
origin of replication
Pstl
amplicillin resistance
Pst I
EcoRI
SalI
CLASIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS
Por su capacidad de transferencia:
-Conjugativos (a través de un pili a otra membrana)
-No conjugativos
Por sus efectos fenotípicos:
-Fertilidad (factores F)
-Plásmidos bacteriocinogénicos (codifican una proteína
tóxica para otras bacterias que no portan ese tipo de
plásmido)
-Plásmidos de resistencia (factores R)
Por el número de copias:
-Relajados (>1000 copias/célula)
-Restringidos (<100 copias/célula)
Episoma (F’) : Plasmido F con genes bacterianos
Donadora
Exconjugante
Mapeo por frecuencia de recombinantes
Si seleccionamos leu como marcador:
Podemos medir la distancia entre los
genes porque todos tienen la misma
oportunidad de incorporarse al
cromosoma receptor
La frecuencia de recombinación indicará la distancia entre los genes
Las posibilidades de recombinación que existen:
4%
9%
87%
muy poco frecuente
0%
leu+ arg - met - 4%
leu+ arg+ met - 9%
leu+ arg+ met+ 87%
leu -- arg 4 u.m. y
arg – met 9 u.m.
En E. coli, cuatro cepas Hfr donaron los siguientes marcadores
genéticos en el orden:
Cepa
Cepa
Cepa
Cepa
1: Q W D M T
2: A X P T M
3: B N C A X
4: B Q W D M
Todas las cepas Hfr strains derivan de la misma cepa F+.
¿Cuál es el orden de los marcadores en el cromosoma original?
(3) (1)
(4)
N
B
Q
W
D
C
(2)
M
A
X
P
T
Tarea:
1) Se realizó la conjugación entre una cepa Hfr que es met+ thi+ pur+ con
una cepa F que es met thi pur de manera interrumpida.
Se encontró que met es el marcador que se transfiere último, así que los
exconjugantes se seleccionaron en un medio sin metionina.
Para probar la presencia de los alelos thi+ y pur+ se hizo selección en
medios sin estos compuestos, encontrando los siguientes datos:
met+ thi+ pur+ 280
met+ thi+ pur0
met+ thi– pur+
6
met+ thi- pur- 52
Determina el orden de estos marcadores en el cromosoma
Calcula la distancia entre los marcadores en unidades de mapa
2) Se aisló una bacteria mutante con fenotipo StrR pero incapaz de usar acetato
como fuente de carbono (ace-). Para determinar dónde mapea el gen responsable
de la mutación se utilizó la conjugación con cuatro cepas diferentes donadoras
StrS ace+ Hfr que se muestran. Las flechas indican la posición y orientación de F
en cada Hfr.
a) ¿En qué medio seleccionamos los exconjugantes en este experimenmto?
b) ¿Cómo vamos a excluir las células donadoras en este experimento?
c) Si se tienen los siguientes resultados, ubica el gen ace en el mapa
(tomando en cuenta el tiempo en minutos).