vectores retrovirales.(es2153654)

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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kInt. Cl. : C12N 15/86
11 Número de publicación:
2 153 654
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ESPAÑA
C12N 5/16
C12N 7/00
A61K 48/00
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 97909436.4
kFecha de presentación : 17.10.1997
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 904 392
kFecha de publicación de la solicitud: 31.03.1999
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54 Tı́tulo: Vectores retrovirales.
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30 Prioridad: 17.10.1996 GB 9621680
25.11.1996 GB 9624457
Medawar Centre, Robert Robinson Avenue,
The Oxford Science Park
Oxford 0X4 4GA, GB
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72 Inventor/es: Kingsman, Alan John;
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74 Agente: Curell Suñol, Marcelino
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.03.2001
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
01.03.2001
ES 2 153 654 T3
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73 Titular/es: Oxford Biomedica (UK) Limited
Aviso:
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Kingsman, Susan Mary;
Kim, Narry y
Mitrophanous, Kyriacos
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCION
Vectores retrovirales.
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La presente invención se refiere a los sistemas de producción de vectores retrovirales y a las partı́culas
de vectores retrovirales producidas mediante dichos sistemas. En particular, se refiere a unos sistemas y
partı́culas de vectores de los cuales están ausentes ciertos factores retrovirales auxiliares. La invención se
refiere asimismo a utilizaciones de vectores retrovirales, en particular para una terapia génica.
Los vectores retrovirales han constituido el vehı́culo de elección para una transferencia génica clı́nica
debido a su eficacia, seguridad y expresión génica estable a largo plazo. Según el informe RAC de los
United States National Institutes of Health publicado en septiembre de 1996 (Ross et al., 1996), 76 de
107 pruebas examinadas por los NIH se basaron en sistemas de vectores derivados del virus de leucemia
murina (MLV).
Un inconveniente importante de dichos vectores consiste en su incapacidad para infectar células no
proliferativas, tales como neuronas, macrófagos y células germinales hematopoyéticas. Dichas células
constituyen dianas importantes para una terapia génica.
El virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) pertenece a una subfamilia dentro de los
retrovirus, los lentivirus y al igual que otros miembros de dicha familia de VIH pueden infectar células
estáticas. Esto hace que los lentivirus sean vectores atractivos para una terapia génica.
Se cree que los determinantes virales para una infección por VIH-1 de células no divisibles residen en
la proteı́na matriz p17 (MA) y vpr (Gallay et al., 1966). La MA presenta propiedades cariófilas conferidas por un tramo conservado de restos básicos, que constituyen una señal de localización nuclear (NLS)
(Bukrinsky et al., 1993). El vpr contiene asimismo una NLS diferenciada (Mahalingam et al., 1995). Los
virus mutantes MA-NLS fracasan en replicarse eficazmente en macrófagos en ausencia de un gen vpr
funcional (Heinzinger et al., 1994). Estos datos han sido interpretados en el sentido que significan que el
vpr ası́ como la MA funcionan como determinantes cariófilos de VIH-1. En ausencia de vpr, la eficacia
de transducción de macrófagos derivados de monocitos se reduce en una proporción superior al 50 %, en
presencia de MA funcional. (Naldini et al., 1996).
Después del trabajo dado a conocer por Lever et al., 1989 que mostró la secuencia requerida para la
encapsidación de VIH-1, ha habido un considerable interés en el desarrollo de un vector de terapia génica
basado en VIH-1. La transferencia de genes extraños en una lı́nea de células T humanas mediante un
vector basado en VIH-1 de replicación defectuosa fue demostrada por Poznansky et al. (Poznansky et al.,
1991). Otros grupos han diseñado vectores basados en VIH-1 que son inducibles por tat (Buchschacher,
Jr. y Panganiban, 1992) o que utilizan promotores heterólogos (Shimada et al., 1991). Sin embargo,
los tı́tulos virales obtenidos con dichos vectores fueron bajos (a lo sumo 103 partı́culas infecciosas por
cada ml), y no resultaba claro si el sistema de vectores podı́a garantizar la producción de vectores exentos de virus cooperadores. Más recientemente, nuevos esfuerzos para producir vectores exentos de virus
cooperadores se han basado en cotransfecciones con tres plásmidos (Richardson et al., 1995). Se pueden
pseudotipificar vectores de VIH con glicoproteı́na del virus de estomatitis vesicular (VSV-G) y dichas
partı́culas mantienen su capacidad de infección después de concentración por ultracentrifugación (Akkina
et al., 1996). La pseudotipificación con VSV-G confiere un margen de huéspedes más amplio y elimina las
probabilidades de una recombinación para producir una cubierta de VIH de tipo salvaje. Se ha demostrado la transducción in vivo de células neuronales no divisibles con una pseudotipificación con VSV-G
de VIH-1 en un sistema de cotransfección con tres plásmidos (Naldini et al., 1996 y Naldini et al., 1996a).
El VIH-1 contiene nueve genes, tres de los cuales: gag, pol y env se encuentran en todos los retrovirus.
Estos son los genes estructurales. Los otros seis: vif, vpu, vpr, nef, tat y rev se denominan genes auxiliares. Otros retrovirus presentan conjuntos diferentes de genes auxiliares en sus genomas de tipo salvaje.
Algunos de los genes auxiliares de otros retrovirus son análogos a los de VIH-1, aunque puede que no
siempre se les hayan designado con los mismos nombres en la bibliografı́a. Los genes auxiliares análogos
presentan una homologı́a en sus secuencias de nucleótidos y realizan las mismas o similares funciones. Las
cepas VIH-2 y SIV contienen generalmente genes env, vpr, vif y nef análogos a los de VIH-1. El VIH-2
y algunas cepas de SIV contienen asimismo vpx que, en algunas cepas de SIV que carecen de vpr, puede
considerarse análogo al vpr. Los lentivirus distintos de VIH-1 contienen asimismo genes auxiliares que
no son análogos a los genes auxiliares de VIH-1. Unos genes auxiliares de retrovirus fueron examinados,
por ejemplo, por Tomonaga y Mikami (1996) y por Joag et al. en Fields Virology, vol. 2.
Hasta la fecha, todos los sistemas de vectores basados en VIH contienen algunos o todos los genes
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auxiliares de VIH. El rev actúa como una proteı́na de exportación de ARN y el tat es un transactivador
importante de la repetición terminal larga (LTR) proviral. Los genes auxiliares desempeñan un papel
crucial en la replicación viral y en la patogenia. Los genes auxiliares no han sido totalmente caracterizados ni se ha definido su función.
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Sin embargo, se cree que algunos de los genes auxiliares están implicados en la patogenia de VIH-1. El
tat ha sido involucrado en el desarrollo del sarcoma de Kaposi (Barillari et al., 1993; Ensoli et al., 1990).
Se ha demostrado que el vpr de VIH causa la interrupción y la apoptosis celular y se ha propuesto que esta
es la causa de la disfunción de células T observada en pacientes de SIDA (Jowett et al., 1955). Asimismo,
se ha sugerido que el Vpr extracelular, presente en sangre periférica, contribuye a patologı́as especı́ficas
de tejidos asociadas con una infección por VIH, ya que el Vpr induce la proliferación y diferenciación
celular (Levy et al., 1993 y Levy et al., 1995).
Puesto que los papeles de los genes auxiliares no están claros y desempeñan probablemente un papel
importante en la patogenia, es deseable su eliminación de sistemas de producción de vectores de VIH-1,
siempre que se pueda mantener un tı́tulo del vector de retrovirus suficientemente alto y la capacidad de
transducir células no proliferativas.
Los datos de Naldini et al. muestran que la presencia de vpu no presenta ningún efecto sobre el tı́tulo
de partı́culas de vectores. Es decir, un sistema de encapsidación que utilizaron produjo un tı́tulo de 4 x
105 cuando pseudotipificaron con VSV-G y dicho sistema era negativo para env y vpu. En otro sistema
que era negativo únicamente para env, obtuvieron el mismo tı́tulo (Naldini et al., 1996 y Naldini et al.,
1996a). Sin embargo, como ya se ha expuesto, otro sistema de Naldini et al. que era negativo para
vpr ası́ como negativo para vpu proporcionó una eficacia de transducción que se redujo en un 50 % en
comparación con un sistema positivo para vpr.
Los presentes solicitantes han descubierto que si se dejan algunos de los genes auxiliares fuera de
los sistemas de producción de vectores de retrovirus no se comprometen significativamente los tı́tulos de
partı́culas de vectores ni la capacidad de las partı́culas de vectores para transducir células no divisibles.
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La invención proporciona por tanto en un aspecto un sistema de producción de vectores retrovirales
para producir partı́culas de vectores de replicación defectuosa, derivadas de lentivirus para una terapia
génica, siendo dichas partı́culas de vectores capaces de infectar y transducir células diana no divisibles
de mamı́feros, el cual sistema comprende un conjunto de secuencias de ácidos nucleicos que codifican los
componentes del vector, incluyendo el genoma de ARN del vector, las proteı́nas gag y pol, la proteı́na env
o un sustituto funcional de la misma, y el gen auxiliar rev o un gen análogo al mismo procedente de otros
lentivirus o un sistema funcionalmente análogo, en el que las secuencias de ácidos nucleicos que codifican
los genes auxiliares, vpr, vif, tat y nef, o genes auxiliares análogos, procedentes de los lentivirus a partir
de los cuales dichas partı́culas se derivan, se disgregan de modo que dichos genes auxiliares son incapaces
de codificar las proteı́nas auxiliares funcionales, o son eliminados del sistema.
En otro aspecto, la invención proporciona una partı́cula de vector de replicación defectuosa, derivada
de un lentivirus, para una terapia génica, siendo dicha partı́cula de vector capaz de infectar y transducir
células diana no divisibles de mamı́feros, comprendiendo dicha partı́cula de vector el genoma de ARN del
vector, las proteı́nas gag y pol, la proteı́na env o un sustituto funcional para la misma, y el gen auxiliar
rev o un gen análogo al mismo procedente de otros lentivirus o un sistema funcionalmente análogo, en la
que se disgregan las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los genes auxiliares vpr, vif, tat y nef,
o genes auxiliares análogos, procedentes de lentivirus a partir de los cuales dichas partı́culas se derivan,
de modo que dichos genes auxiliares son incapaces de codificar las proteı́nas auxiliares funcionales, o son
eliminados del sistema.
En todavı́a otro aspecto, la invención proporciona una construcción de ADN para su utilización en un
sistema de producción de vectores retrovirales que se describe en la presente memoria, codificando dicha
construcción de ADN un genoma de vector ARN encapsidable para formar una partı́cula de vector retroviral y que está unida de manera factible a un promotor, en la que todos los genes auxiliares retrovirales
funcionales están ausentes de la construcción, excepto el rev que está presente. La construcción de ADN
se puede proporcionar como parte de un conjunto de construcciones de ADN que codifican asimismo
algunos o todos los componentes estructurales de las partı́culas de vectores.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la preparación de un sistema de
producción retroviral para producir partı́culas de vectores de replicación defectuosa, derivadas de lentivirus para una terapia génica, siendo dichas partı́culas de vectores capaces de infectar y transducir células
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diana no divisibles de mamı́feros, el cual sistema comprende un conjunto de secuencias de ácidos nucleicos
que codifican los componentes del vector incluyendo el genoma de ARN del vector, las proteı́nas gag y
pol, la proteı́na env o un sustituto funcional para la misma, y el gen auxiliar rev o un gen análogo al
mismo procedente de otros lentivirus o un sistema funcionalmente análogo, que comprende eliminar o
disgregar del conjunto de secuencias de ácidos nucleicos, los genes auxiliares vpr, vif, tat y nef, o genes
auxiliares análogos, de modo que los genes son incapaces de codificar las proteı́nas auxiliares funcionales.
La invención prevé asimismo la utilización del sistema de producción de partı́culas de vectores retrovirales que se describen en la presente memoria, para producir partı́culas retrovirales de tı́tulo elevado
que pueden transducir células no divisibles.
En aspectos adicionales, la invención prevé la utilización de partı́culas de vectores retrovirales que se
describen en la presente memoria para una terapia génica y en la preparación de un medicamento para
una terapia génica; y un procedimiento para realizar una terapia génica sobre una célula diana, el cual
procedimiento comprende infectar y transducir la célula diana utilizando una partı́cula de vector retroviral que se describe en la presente memoria. La invención proporciona además células diana transducidas
que resultan de dichas utilizaciones y procedimientos. La invención proporciona por tanto un sistema de
suministro de genes para su utilización en medicina.
La expresión “basadas en lentivirus” significa que las partı́culas de vectores se derivan de un lentivirus. El genoma de la partı́cula de vector comprende componentes del lentivirus en forma de una cadena
principal. La partı́cula de vector en conjunto contiene componentes del vector esenciales compatibles con
el genoma de ARN, incluyendo sistemas de transcripción inversa y de integración. Normalmente, éstos
incluirán las proteı́nas gag y pol derivadas del lentivirus.
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Al derivarse de un lentivirus, las partı́culas de vectores retrovirales son capaces de infectar y transducir células no divisibles. Por tanto, las partı́culas de vectores son capaces de proporcionar un gen o
genes seleccionados, tales como genes terapéuticamente activos, al genoma de una célula diana. Durante
el proceso de infección, los retrovirus forman un complejo de preintegración en el citoplasma de la célula
diana que contiene integrasa, proteı́nas nucleares y ADN proviral. El complejo es capaz de pasar a través
de las membranas nucleares de la célula diana, por medio de secuencias señales en las proteı́nas. Los
retrovirus no lentivirales, o bien carecen de las proteı́nas o contienen las proteı́nas, pero sin las apropiadas
secuencias señales.
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Son ejemplos de lentivirus, virus VIH-1 y VIH-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV y visna. De éstos,
los VIH y SIV son actualmente los mejor comprendidos. Sin embargo, se puede preferir un virus no de
inmunodeficiencia para su utilización en una terapia génica, debido a que los virus de inmunodeficiencia
llevan consigo inevitablemente consideraciones de seguridad y perjuicios.
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La ausencia de genes auxiliares funcionales del sistema de producción de vectores retrovirales significa
que dichos genes funcionales estarán asimismo ausentes de las partı́culas de vectores retrovirales producidas por el sistema. Asimismo, cualquiera de las proteı́nas auxiliares que serı́an codificadas de otro
modo por dichos genes e incorporadas en las partı́culas de vectores, estarán ausentes de las partı́culas de
vectores. En sistemas conocidos de producción de vectores retrovirales, los genes auxiliares pueden estar
presentes como parte del ADN que codifica el genoma del vector, o junto con los componentes de encapsidación. La localización de un gen auxiliar en un sistema de producción de vectores depende en parte de
su interrelación con otros componentes retrovirales. Por ejemplo, el vif forma parte con frecuencia de una
casete de encapsidación de gag-pol en una célula de encapsidación. Por tanto, la eliminación de un gen
auxiliar funcional para los propósitos de la invención, puede implicar su eliminación de los componentes
de encapsidación, o del genoma del vector, o quizás ambas cosas.
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Para eliminar un gen auxiliar funcional puede que no sea necesaria la eliminación del gen en su totalidad. Normalmente, la eliminación de parte del gen, o disgregación del gen de algún otro modo, será
suficiente. La ausencia de un gen auxiliar funcional se entiende en la presente memoria que significa que
el gen no está presente en una forma en la que es capaz de codificar la proteı́na auxiliar funcional.
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Según la invención, los genes funcionales vpr y tat o genes análogos normalmente presentes en el lentivirus en el que se basan las partı́culas del vector, están ambos ausentes. Dichos dos genes auxiliares están
asociados con caracterı́sticas de lentivirus que son particularmente indeseables para un vector de terapia
génica. En un sistema según la invención para producir partı́culas de vectores basados en VIH-1, cuatro
de los genes están ausentes en su forma funcional. Muy preferentemente, los cinco genes auxiliares vpr,
vif, tat, nef y vpu están ausentes en su forma funcional. De manera similar, para sistemas relacionados
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con otros lentivirus, todos los genes auxiliares están ausentes en su forma funcional (excepto el rev que
está presente a menos que esté sustituido por un sistema análogo al sistema rev/RRE).
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Con el fin de asegurar una exportación eficaz de transcripciones de ARN del genoma del vector del
núcleo al citoplasma, es necesario incluir secuencias de rev funcional y de elementos de respuesta de rev
(RRE) en el genoma del vector, o incluir secuencias alternativas en el genoma que realizan la misma
función que el sistema rev/RRE. Por ejemplo, un análogo funcional del sistema rev/RRE se encuentra en
el virus de mono Mason Pfizer. Este es conocido como CTE y consiste en una secuencia de tipo RRE en
el genoma que se cree que interactúa con un factor en la célula infectada. Se puede pensar que el factor
celular es un análogo de rev. Por tanto, se puede utilizar CTE como una alternativa al sistema rev/RRE.
Como resultará evidente, con el fin de funcionar como un vector, las partı́culas de vectores retrovirales que se describen en la presente memoria necesitarán presentar un sistema de transcripción inversa
(transcripción inversa compatible y sitios de unión de iniciadores) y un sistema de integración (integrasa
compatible y sitios de integración) que permitan la conversión en el provirus y la integración del ADN de
doble cadena en el genoma de la célula diana. Adicionalmente, el genoma del vector necesitará contener
una señal de encapsidación. Dichos sistemas y señales se derivarán generalmente del lentivirus en el cual
se basa el vector. Resultará evidente que aunque el vector según la invención se basa en un lentivirus, los
elementos del lentivirus incorporados en el vector pueden consistir en versiones modificadas genéticamente
o de otra manera de los elementos del lentivirus de tipo salvaje. Se pueden conseguir modificaciones manipulando, ya sea el genoma del ARN, u otros componentes del sistema de producción de partı́culas
de vectores retrovirales. Por ejemplo, se pueden excluir porciones del genoma del lentivirus que no se
necesitan para el vector. Asimismo, el sistema de producción de vectores puede emplear sustitutos, p.ej.
para el gen env del lentivirus, para proporcionar al vector un margen diferente de células diana (esto es
conocido como pseudotipificación).
Una partı́cula de vector retroviral según la invención lleva uno o más genes seleccionados para administrar a una célula diana. Los genes seleccionados se seleccionan según el efecto que se busca conseguir.
Para propósitos de una terapia génica habrá por lo menos un gen terapéuticamente activo que codifique
un producto de gen que sea activo contra la afección que se desea tratar o prevenir. Adicionalmente,
puede haber un gen seleccionado que actúe como marcador que codifique un producto detectable. Los
genes terapéuticos pueden codificar por ejemplo un ARN antisentido, una ribozima, un mutante negativo
transdominante de una proteı́na diana, una toxina, una toxina condicional, un antı́geno que induce anticuerpos o células T cooperadoras o células T citotóxicas, un anticuerpo de cadena simple o una proteı́na
supresora de tumores.
Preferentemente, la construcción del genoma del vector es tal, que en el provirus de ADN, el gen o
genes terapéuticos está o están bajo el control transcripcional del 5’ LTR, pero no unidos de otro modo
de manera factible a ningún otro promotor del vector. Por tanto, la expresión del gen o genes tiene
lugar en una unidad de transcripción única. Preferentemente asimismo, el 5’ LTR consiste en un LTR
de lentivirus modificado para el que la función promotora no depende de tat. Esto se puede conseguir
sustituyendo las funciones promotoras de lentivirus R y U3 por funciones promotoras alternativas, que
se pueden derivar de otro retrovirus o pueden ser de origen no retroviral. Se describe una estrategia de
este tipo por Cannon et al. 1996 y en los Ejemplos.
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Resultará evidente que el término “gen” se utiliza en la presente memoria de una manera amplia, e
incluye cualquier ácido nucleico que codifique el polipéptido o ARN deseado. Normalmente, los genes
proporcionados por vectores según la invención serán cADN.
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Las partı́culas de vectores retrovirales según la invención serán capaces asimismo de infectar y transducir células que son lentamente divisibles, y que no lentivirus tales como MLV no serı́an capaces de
infectar y transducir eficazmente. Las células lentamente divisibles se dividen una vez aproximadamente
cada tres a cuatro dı́as. Las células no divisibles y lentamente divisibles de mamı́feros incluyen células
cerebrales, células germinales, macrófagos terminalmente diferenciados, células epiteliales pulmonares y
otros diversos tipos de células. Se incluyen asimismo ciertas células tumorales. Aunque los tumores
contienen células rápidamente divisibles, algunas células tumorales, especialmente las que se encuentran
en el centro del tumor, se dividen con poca frecuencia.
La construcción de ADN que codifica el genoma del vector que se describe en la presente memoria
está unida preferentemente a un promotor de elevada eficacia, tal como el promotor CMV. Se conocen
otros promotores de elevada eficacia. Esto da lugar a un nivel elevado de expresión del ARN del vector
mediante el sistema de producción de vectores retrovirales.
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Son bien conocidos en la técnica células huésped o productoras adecuadas para su utilización en el
sistema de producción de vectores retrovirales según la invención. Muchos retrovirus han sido ya disociados en genomas de replicación defectuosa y componentes de encapsidación. Para los que no lo han
sido, la tecnologı́a está disponible para hacerlo ası́. La célula productora codifica los componentes virales
no codificados por el genoma del vector, tales como las proteı́nas gag, pol y env. Los genes gag, pol y
env se pueden introducir en la célula productora e integrar de manera estable en el genoma de la célula
para proporcionar una lı́nea celular de encapsidación. El genoma del vector retroviral se introduce a
continuación en la lı́nea celular de encapsidación mediante transfección o transducción para obtener una
lı́nea celular estable que presenta todas las secuencias de ADN requeridas para producir una partı́cula de
vector retroviral. Otro enfoque consiste en introducir las diferentes secuencias de ADN que se requieren
para producir una partı́cula de vector retroviral, p.ej. la secuencia codificadora de env, la secuencia
codificadora de gag-pol y el genoma retroviral defectuoso, dentro de la célula simultáneamente mediante
una transfección triple transitoria. En un sistema preferido según la invención, tanto los componentes
estructurales como el genoma del vector estarán todos codificados por ADN integrado de manera estable
en un genoma de la célula huésped.
En las figuras anexas:
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la Figura 1 representa un sistema de producción de vectores según la invención, que utiliza una cotransfección con tres plásmidos de células 293T;
la Figura 2 representa genomas de vectores basados en VIH para su utilización en la invención;
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la Figura 3 representa plásmidos de expresión de genes gag-pol de VIH-1 para su utilización en la
invención; y
la Figura 4 representa las eficacias de transducción para vectores según la invención que carecen de
los cinco factores auxiliares.
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Para producir un sistema seguro de encapsidación de VIH desprovisto de todos los genes innecesarios,
los presentes solicitantes han desarrollado un sistema que no contiene vpr, nef, tat, vif ni vpu (Figura
1). Los componentes de encapsidación se dispusieron en tres plásmidos independientes y se minimizó el
solapado de secuencias para asegurar que no se produjera ninguna recombinación ni la producción de
virus cooperadores. Se ha demostrado que dicho vector VIH transduce células no divisibles tratadas con
afidicolina en ausencia de vpr. Se obtuvieron tı́tulos que son similares a los tı́tulos de Naldini et al. para
sistemas que contienen todos los genes auxiliares (Naldini et al., 1996a).
Esto constituye el primer sistema de vector lentiviral mı́nimo. El hecho de que se observen tı́tulos
elevados con dicho sistema demuestra que los genes auxiliares (excepto el rev) son superfluos para la
producción de tı́tulos elevados y para la transducción de células no divisibles. Esto es contrario a la
suposición hecha por Naldini et al. de que la razón para la producción de cepas de virus de tı́tulo elevado
es debida a la incorporación de proteı́nas accesorias (tales como nef) en la partı́cula viral (Naldini et al.,
1996).
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El sistema puede presentar ventajas adicionales para una terapia de VIH. La sustitución del LTR de
VIH-1 por un promotor diferente, tal como un promotor HCMV constitutivo, permite la utilización de
moléculas anti-Tat, tales como mutantes transdominantes de Tat (Echetebu et al., 1994) o reclamos de
TAR (Lisziewicz et al., 1993) como agentes terapéuticos, ya que no afectarán a la producción de vectores.
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Resultará evidente que los vectores lentivirales mı́nimos que se describen en la presente memoria, que
carecen de todos los genes auxiliares de virus de tipo salvaje, pueden presentar asimismo aplicaciones
como vacunas.
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Ejemplos
Materiales y procedimientos
Construcción de plásmidos
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El pGP-RRE1 es un plásmido de expresión gagpol vif derivado de pWI3 (Kim et al., 1989). El RRE
de pWI3 (número de referencia: U26942) se insertó haciendo romos los extremos del fragmento Sty I/Sty
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I (7720-8050) en el corte pBluescript KS+ Sma I para obtener pBSRRE. El fragmento Nar I/Eco RI
de pWI3 (637-5743) se insertó en el corte pBSRRE con Cla I y Eco RI para obtener pBSGPRRE1. El
fragmento Xho I/Not I (que contiene gagpol y RRE) se insertó en el plásmido de expresión pCl-Neo para
obtener pGR-RRE1. Para eliminar la región codificadora de vif, se cortó pBSGPRRE1 con NdeI y SmaI,
se hicieron romos los extremos y se relegó para generar pBSGPRRE2. El gen gagpol y RRE se insertaron
en pCl-neo en el sitio de XhoI y NotI para preparar pGP-RRE2.
Se ha descrito la construcción de pTIN406, pTIN408 y pTIN414 (Cannon et al., 1996). Los 5’LTR
de pH3Z y pH4Z contienen un promotor CMV en la posición U3 y las regiones VIH R y U5. Se preparó
VIHdge a partir de VIHgpt (Page et al., 1990) haciendo romos los extremos del sitio de Cla I (829) para
obtener una mutación por cambio en el marco de lectura. Se cortó VIHdge con Bgl II y Pst I (473-1414)
y se insertó en pTIN406. El pTIN406 presenta una estructura LTR de CMV, R (VIH) y U5 (MLV). Esto
produce un LTR hı́brido que contiene CMV y R, U5 a partir de VIH, denominado pBS5’. Para proporcionar el plásmido con rev y RRE, el fragmento Eco RI/Xho I (5743-8897) se cortó a partir de VIHdge
1.2 que es un derivado de VIHdge que contiene una deleción de Nde I a Bgl II (6403-7621) y se insertó
en pBS5’ para obtener pBS5’R. El 3’LTR se proporcionó insertando el fragmento Not I/Xho de pBS3’
en pBS5’R para obtener pH2. Se obtuvo pBS3’ mediante un ligamiento de tres elementos del fragmento
Xho I/Hind III de pWI3, el fragmento Hind III/Kpn I de pTIN408 en pBluescript KS+ (Xho I/Kpn I).
Se insertó un promotor CMV en el sitio Xho I único de pH2 procedente de pSPCMV (Sal I/Xho I) para
preparar pH2CMV. Se obtuvo pSPCMV insertando pLNCX (número de referencia: M28246) (Pst I/Hind
III) en pSP72 (Promega). El gen β-galactosidasa se insertó a partir de PTIN414 en pSP72 (Xho I/Sph I)
para preparar pSPlacZ. Una digestión con Xho I/Sal I de pSPlacZ proporcionó la región codificadora de
β-galactosidasa que se insertó en pH2-CMV para proporcionar pH3Z. El pH4Z se construyó para obtener
un vector deficiente en tat. Los primeros 50 pb (pares de bases) de la región codificadora de tat se eliminaron para sustituir el fragmento EcoRI (5743)I-Spel en pH3 por el producto EcoRI (5881)-Spel PCR
amplificado utilizando iniciadores de PCR, DELT5 (5’-CGTGAATTCGCCTAAAACTGCTTGTACCA3’) y DELT3 (5’-GAACTAATGACCCCGTAATTG-3’ para obtener pH4. El fragmento Nsi I/Spe de pH4
se insertó en pH3Z para generar pH4Z.
Se construyó un plásmido de expresión de vpr mediante amplificación por PCR de la región codificadora de vpr de pNL4.3 (número de referencia: U26942) utilizando los siguientes iniciadores: iniciador 5’,
GCGAATTCGGATCCACCATGGAACAAGCCCCAGAAGAC (5563-5583) e iniciador 3’, GCGAATTCGGATCCTCTAGGATCTACTGGCTCCATT (5834-5853). Este amplicón se clonó en pLIGATOR (R
& D Systems). El plásmido de expresión pCl-vpr se preparó insertando el fragmento Mlu I y Xho I que
contiene la región codificadora de vpr en pCl-Neo (Promega).
Se cortó pAC29.1 mediante Bam HI para proporcionar la región codificadora de VSV-G que se insertó
en pSA91 (Bgl II).
40
Lı́neas celulares
Se mantuvieron células 293T (293ts/A1609) (DuBridge et al., 1987) en un medio de Eagle modificado
de Dulbeco (GIBSO), células HeLa y células 208F en MEM (GIBCO), todos los cuales contenı́an suero
de ternera fetal al 10 % (v/v) complementado con antibióticos.
45
Producción y ensayos de vectores
50
55
60
Se produjeron cepas de vectores retrovirales según el protocolo de los presentes solicitantes anteriormente publicado (Soneoka et al., 1995). Dicho en pocas palabras, se aplicaron células 293T de
riñón humano (1,5 x 106 ) sobre placas de 10 cm y se transfectaron transitoriamente con 15 mg de cada
plásmido (plásmidos de expresión gag-pol y env junto con un plásmido vector) mediante precipitación
de ADN con fosfato de calcio (Chen y Okayama, 1987). Los materiales sobrenadantes de los cultivos
se recogieron 36 horas después, se filtraron a través de un filtro de 0,45 mm y o bien se utilizaron inmediatamente o se congelaron a una temperatura de -70◦ C. La transducción se llevó a cabo añadiendo
virus a células diana durante 2 horas, en presencia de 8 mg/ml de polibreno seguido de la adición de
medios de recién aportación. Se utilizo 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactósido (X-Gal) para medir la
expresión de β-galactosidasa 48 horas más tarde, tal como se ha descrito anteriormente (Soneoka et al.,
1995). Se obtuvieron tı́tulos contando el número de unidades formadoras de lac z (focos azules) por cada
ml (l.f.u./ml). Se prepararon cultivos interrumpidos en la fase G1/S añadiendo afidicolina (5 mg/ml) 24
horas antes de la infección y a continuación diariamente a lo largo del experimento.
7
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Resultados
Producción de vector VIH
5
10
15
20
25
El H3Z (positivo a tat) y el H4Z (negativo a tat) son vectores basados en VIH-1 ideados para ser
producidos mediante cotransfección con tres plásmidos en células 293T (Figura 2). Para una encapsidación eficaz mediante núcleos de VIH, los vectores contienen las primeras 778 bases de gag pero una
mutación por cambio en el marco de lectura, que introdujo 40 pb del codón de partida ATG, impide la
expresión de proteı́nas gag. Se incluyó RRE para reforzar la eficacia de encapsidación y se expresa rev
del vector para soportar la exportación de mARN de VIH. Se insertó el gen β-galactosidasa impulsado
por el promotor CMV interno para servir como gen informador. Para los dos genomas de vectores, la
transcripción se impulsa mediante un promotor CMV que se ha utilizado para sustituir el 5’ LTR U3.
Esto hace al genoma del vector independiente de tat. Se prepararon dos construcciones gagpol de VIH-1
(Figura 3); pGP-RRE1 (positivo a vif) y pGP-RRE2 (negativo a vif). Puesto que se han insertado los
genes gagpol en pCl-neo que es un plásmido de expresión impulsado por CMV, la expresión de gagpol es
independiente de tat. Se utilizó pRV67, la construcción de glicoproteı́na VSV para la pseudotipificación.
Disponiendo los diferentes genes en diferentes plásmidos, se pudo minimizar la probabilidad de generar
un virus competente de replicación por recombinación.
Eficacia de transducción del vector
Se generaron partı́culas retrovirales de replicación defectuosa mediante cotransfección transitoria de
células 293T de riñón humano con los tres plásmidos anteriormente descritos y o bien se utilizaron inmediatamente o se congelaron a una temperatura de -70◦C. Las diferentes construcciones de vectores
se utilizaron para producir un virus. Se encontró que las construcciones mı́nimas (H4Z y pGP-RRE2)
proporcionaron tı́tulos comparables al de los virus positivos a vif, vpr, nef y tat (Tabla 1).
30
Cuando se ensayó el sistema mı́nimo en diversas lı́neas celulares, los tı́tulos fueron diferentes. (Tabla
2). Los vectores proporcionaron tı́tulos de 3,2 x 105 l.f.u./ml con un tratamiento con polibreno y 9,1 x 104
l.f.u./ml sin un tratamiento con polibreno en células 293T. Asimismo los mismos vectores, sin polibreno,
proporcionaron 9,6 x 103 l.f.u./ml y 8,3 x 103 l.f.u./ml en células HeLa y 208F, respectivamente. Dichos
tı́tulos son comparables con los obtenidos por Naldini et al., 1996 (Naldini et al., 1996), que son los más
elevados publicados hasta ahora.
35
Efecto del vpr sobre la transducción de células tratadas con afidicolina
40
Para ensayar el efecto del vpr sobre la transducción de células no divisibles, se incluyó vpr en el sistema de encapsidación mediante cotransfección de pCl-vpr junto con los plásmidos pH4Z, pGP-RRE2 y
pRV67. Las eficacias de transducción de las partı́culas virales generadas se ensayaron en células 293T y
células HeLa en crecimiento y con interrupción del crecimiento (Figura 4). Vectores de encapsidación y
de transducción derivados de MLV (Soneoka, 1995) sirvieron como testigos. A las células HeLa y células
293T se les interrumpió el crecimiento en la fase G1/S mediante un tratamiento con afidicolina. El vector
VIH mı́nimo H4Z fue tan eficaz en la transducción de células HeLa y 293T interrumpidas en la fase G1/S
como proliferativas, mientras que el vector basado en MLV fue únicamente eficaz en un 0,002 %.
45
El H4Z deficiente en vpr pudo transducir las células con crecimiento interrumpido tan eficazmente
como el vector que contenı́a vpr, lo cual sugiere que la MA de VIH-1 es suficiente para proporcionar el
vector con la capacidad de transducir células no divisibles.
50
55
60
Conclusión
Los presentes solicitantes han establecido un sistema de producción de vectores basados en VIH-1,
que no contiene vpr, vpu, nef, vif ni tat, basado en un procedimiento de cotransfección de tres plásmidos.
Dicho vector puede transducir células proliferativas con un tı́tulo de hasta 3,2 x 105 l.f.u./ml, que es comparable con otros vectores basados en MLV y puede aumentarse fácilmente por concentración utilizando
una ultracentrifugación (datos no representados). No se ha detectado ningún virus cooperador (datos no
representados).
Se ha demostrado que este vector mı́nimo transduce células HeLa y células 293T con crecimiento
interrumpido tan eficazmente como vectores que contienen vpr, vif, nef y tat. Por tanto, se puede llegar a
la conclusión de que se necesita únicamente rev para la producción de vectores basados en VIH de tı́tulo
elevado y que dichos vectores pueden transducir células no divisibles.
8
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5
Este constituye el primer informe de la construcción de un vector lentiviral mı́nimo de tı́tulo elevado
que puede transducir células no divisibles. La eliminación de cinco de los seis genes auxiliares (excepto
rev) y el mı́nimo solapado de secuencias entre los plásmidos hacen de este sistema el más seguro hasta la
fecha para la producción de vectores de VIH para una terapia génica.
Leyendas de las figuras
10
15
Figura 2. Genomas de vectores de VIH. Los números indican las coordenadas a partir de HXB2.
Promotor HCMV (-597 a -1). Secuencias de VIH (455 a 1415; 5743 (H3Z) ó 5881 (H4Z) a 6403; 7621 a
8897; 8897 a 9720) a partir de HXB2. El promotor HCMV como promotor interno (900 pb). Sitio de
clonación (Xhol). Cadena principal; pBluescriptKS+.
Figura 3. Plásmidos de expresión de genes gag-pol de VIH-1. La región codificadora gagpol de VIH y
RRE se clonó en pCl-neo (PROMEGA) en el sitio de Xhol y Notl.
Figura 4. Transducción de células no divisibles. Las eficacias de transducción de los vectores H4Z se
midieron mediante tinción con X-gal y se representan en el eje Y expresadas como l.f.u./ml. Se prepararon células interrumpidas en fase G1/S tratando las células con afidicolina (5 µg/ml).
20
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TABLA 1
Efectos de la expresión de genes accesorios sobre el tı́tulo del vector
25
Genes accesorios
Plásmidos
Tı́tulo
(l.f.u./ml)a
30
35
40
45
Tat
Vif
Nef
Vpr
Vector
Gagpol
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
-
+
-
pH3Z
pH3Z
pH3Z
pH3Z
pH4Z
pGP-RRE1
pGP-RRE1
pGP-RRE1
pGP-RRE2
pGP-RRE2
Nef
Vpr
pCl- Vpr
pC-Nef
2,2
2,5
4,0
3,7
4,6
x
x
x
x
x
105
105
105
105
105
a: La eficacia de transducción se midió en células 293T contando el número de colonias azules después
de una tinción con X-gal 48 horas después de la transducción y se indicaron como unidades formadoras
de colonias lac Z por ml de cepa de virus (l.f.u./ml).
TABLA 2
Eficacia de transducción del vector H4Z mı́nimo sobre diversas lı́neas celulares
50
Lı́nea celular
55
60
293T
HeLa
208f
Tı́tulo (l.f.u./ml)a
Sin polibreno Con polibreno
9,1 x 104
9,6 x 103
8,3 x 103
Riñón humano
Epitelio humano
Fibroblasto de rata
3,2 x 105
N.D.
N.D.
a: La eficacia de transducción se midió contando el número de colonias azules después de una tinción
con X-gal 48 horas después de la transducción y se indicaron como unidades formadoras de colonias lac
Z por ml de cepa de virus (l.f.u./ml).
10
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REIVINDICACIONES
5
10
1. Sistema de producción de vectores retrovirales para producir partı́culas de vectores de replicación
defectuosa, derivadas de lentivirus para una terapia génica, siendo dichas partı́culas de vectores capaces
de infectar y transducir células diana no divisibles de mamı́feros, el cual sistema comprende un conjunto
de secuencias de ácidos nucleicos que codifican los componentes del vector incluyendo el genoma de ARN
del vector, las proteı́nas gag y pol, la proteı́na env o un sustituto funcional para la misma, y el gen auxiliar
rev o un gen análogo al mismo procedente de otros lentivirus o un sistema funcionalmente análogo, en
el que las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los genes auxiliares vpr, vif, tat y nef, o genes
auxiliares análogos, procedentes del lentivirus a partir del cual dichas partı́culas se derivan, se disgregan
de modo que dichos genes auxiliares son incapaces de codificar las proteı́nas auxiliares funcionales, o son
eliminados del sistema.
15
2. Sistema de producción de vectores retrovirales según la reivindicación 1, en el que el gen auxiliar
vpu, o un gen auxiliar análogo, normalmente presente en el lentivirus a partir del cual las partı́culas
de vectores se derivan, se disgrega asimismo de modo que es incapaz de codificar la proteı́na auxiliar
funcional, o es eliminado del sistema.
20
3. Sistema de producción de vectores retrovirales según la reivindicación 1 ó 2, en el que una secuencia
de ácido nucleico que codifica el genoma de ARN del vector comprende uno o más genes terapéuticamente
activos.
4. Sistema de producción retroviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el vector
se deriva de un lentivirus VIH-1, VIH-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV o visna.
25
30
35
40
5. Sistema de producción de vectores retrovirales según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el
que el conjunto de secuencias de ácidos nucleicos que codifican los componentes del vector incluye tres
construcciones de ADN que codifican el genoma de ARN del vector, las proteı́nas gag y pol, y la proteı́na
env o un sustituto funcional para la misma, respectivamente.
6. Sistema de producción de vectores retrovirales según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el
que una secuencia de ácido nucleico que codifica el genoma de ARN del vector comprende secuencias rev
y RRE o equivalentes funcionales de las mismas.
7. Sistema de producción de vectores retrovirales según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en
una célula huésped.
8. Construcción de ADN para su utilización en el sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 7, codificando dicha construcción de ADN un genoma de vector ARN encapsidable y unido de manera
factible a un promotor.
9. Construcción de ADN según la reivindicación 8, en la que el promotor es un promotor no lentiviral,
de eficacia elevada.
45
50
10. Conjunto de construcciones de ADN para su utilización en el sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende la construcción de ADN según la reivindicación 8 ó 9, y una construcción de ADN que codifica las proteı́nas gag y pol o un sustituto funcional de las mismas.
11. Conjunto de construcciones de ADN según la reivindicación 10, que comprende además una construcción de ADN que codifica la proteı́na env o un sustituto funcional de la misma.
12. Construcciones de ADN para su utilización en el sistema según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 7, que comprenden las construcciones de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en uno
o más vectores de expresión.
55
60
13. Procedimiento para la preparación de un sistema de producción retroviral para producir partı́culas
de vectores de replicación defectuosa, derivadas de lentivirus para una terapia génica, siendo dichas
partı́culas de vectores capaces de infectar y transducir células diana no divisibles de mamı́feros, el cual
sistema comprende un conjunto de secuencias de ácidos nucleicos que codifican los componentes del vector incluyendo el genoma de ARN del vector, las proteı́nas gag y pol, la proteı́na env o un sustituto
funcional para la misma, y el gen auxiliar rev o un gen análogo al mismo procedente de otros lentivirus
11
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o un sistema funcionalmente análogo, que comprende eliminar o disgregar del conjunto de secuencias de
ácidos nucleicos los genes auxiliares vpr, vif, tat y nef, o genes auxiliares análogos, de modo que los genes
son incapaces de codificar las proteı́nas auxiliares funcionales.
5
10
14. Procedimiento según la reivindicación 13, que comprende además eliminar o disgregar de las
secuencias de ácidos nucleicos que codifican los componentes del vector, el gen auxiliar vpu, o un gen
auxiliar análogo, de modo que dicho gen es incapaz de codificar la proteı́na auxiliar funcional.
15. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que el vector se deriva de un lentivirus VIH-1,
VIH-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV o visna.
16. Sistema de producción retroviral producido mediante el procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15.
15
20
25
17. Procedimiento para la preparación de una partı́cula de vector retroviral, que comprende introducir
un conjunto de secuencias de ácidos nucleicos o construcciones de ADN según se define en cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12 en una célula huésped, y obtener la partı́cula de vector retroviral.
18. Partı́cula de vector retroviral producida mediante el sistema o procedimiento según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, 16 ó 17.
19. Partı́cula de vector de replicación defectuosa, derivada de un lentivirus para una terapia génica,
siendo dicha partı́cula de vector capaz de infectar y transducir células diana no divisibles de mamı́feros,
comprendiendo dicha partı́cula de vector el genoma de ARN del vector, las proteı́nas gag y pol, la proteı́na
env o un sustituto funcional para la misma, y el gen auxiliar rev o un gen análogo al mismo procedente
de otros lentivirus o un sistema funcionalmente análogo, en la que las secuencias de ácidos nucleicos que
codifican los genes auxiliares vpr, vif, tat y nef, o genes auxiliares análogos, procedentes del lentivirus
a partir del cual dichas partı́culas se derivan, se disgregan, de modo que dichos genes auxiliares son
incapaces de codificar las proteı́nas auxiliares funcionales, o son eliminados del sistema.
30
20. Partı́cula de vector según la reivindicación 19, en la que el gen funcional vpu, o un gen auxiliar
análogo, normalmente presente en el lentivirus a partir del cual las partı́culas de vectores se derivan, es
eliminado asimismo del sistema.
35
21. Partı́cula de vector según la reivindicación 18 ó 20, en la que una secuencia de ácido nucleico que
codifica el genoma de ARN del vector comprende uno o más genes terapéuticamente activos.
22. Partı́cula de vector según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en la que el vector se deriva
de un lentivirus VIH-1, VIH-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV o visna.
40
23. Partı́cula de vector según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que el conjunto de
secuencias de ácidos nucleicos que codifican los componentes del vector incluye tres construcciones de
ADN que codifican el genoma de ARN del vector, las proteı́nas gag y pol, y la proteı́na env o un sustituto
funcional para la misma, respectivamente.
45
24. Partı́cula de vector según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en la que una secuencia de
ácido nucleico que codifica el genoma de ARN del vector comprende secuencias de rev y RRE o equivalentes funcionales de las mismas.
50
55
25. Partı́cula de vector según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, en una célula huésped.
26. Utilización de un sistema de producción de vectores retrovirales según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó 16 o construcciones de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para
la producción de una partı́cula de vector retroviral de tı́tulo elevado que puede transducir células no
divisibles.
60
12
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27. Composición farmacéutica que comprende una partı́cula de vector retroviral según cualquiera de
las reivindicaciones 18 a 25.
5
28. Células diana aisladas, infectadas o transducidas con la partı́cula de vector retroviral según
cualquiera de la reivindicaciones 18 a 25.
10
15
20
25
30
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45
50
55
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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