Como clasificar hoy en dia las leucemias y linfomas

Cómo clasificar hoy en día las Leucemias
y los Linfomas?
El rol de la citometría de flujo
SANDRA QUIJANO GÓMEZ MSc. PhD.
Octubre de 2011
SÍNDROMES LINFOPROLIFERATIVOS CRÓNICOS B (SLPC-B)
Expansiones (mono)clonales de linfocitos B maduros
clínicamente heterogéneas
CLASIFICACIÓN DE LOS SLPC-B SEGÚN LA OMS
Leucemias linfoides crónicas de células B maduras/periféricas:
Leucemia linfática crónica/Linfoma linfocítico de célula B pequeña
Leucemia prolinfocítica
Tricoleucemia
Linfomas de células B maduras/periféricos:
Linfoma
Linfoma
Linfoma
Linfoma
Linfoma
Linfoma
Linfoma
Linfoma
linfoplasmocítico
de la zona marginal esplénica
de la zona marginal extranodal tipo MALT
de la zona marginal nodal (células B monocitoides)
folicular
de células del manto
B difuso de célula grande
de Burkitt
Neoplasias de células plasmáticas:
Mieloma múltiple/plasmocitoma
Campo E. et al. Blood 2011
SLPC-B: ANOMALÍAS QUE AFECTAN A GENES DE CONTROL DE
CICLO CELULAR Y DE LA APOPTOSIS
SLPC-B Gen
LF
MALT
LCM
LLC-B
BCL2
BCL10
API2/MLT1
MALT1
FOXP1
Función
LLP
PAX5
MW
BLIMP1
t(14;18)
80%-90%
Inhibición de apoptosis
a través de NFκ
κB
t(1;14)
t(11;18)
t(14;18)
t(3;14)
<5%
30%-50%
20%
10%-50%
t(11;14)
>90%
del(13q)
del(11q)
del(17p)
+12
10%-60%
5%-15%
1%-5%
15%-25%
Diferenciación B
t(9;14)
50%
Diferenciación B
Ciclo celular (arresto G0/G1)
del(6q21)
30%-50%
30%-40%
5%-10%
30%-40%
Factor de transcripción
regulador de desarrollo B
Control del ciclo celular
LBDCG
BCL6
C-MYC
BCL-2
Activación y diferenciación B
Control del ciclo celular
Inhibición de apoptosis
t(3q27)
t(8;14)
t(14;18)
LB
C-MYC
Diferenciación
Control del ciclo celular
Inducción de apoptosis
t(8;14)
t(8;22)
t(2;8)
Küppers R. Nat Rev Cancer 2005
Frecuencia
Inhibición de apoptosis
CICLINA D1 Ciclo celular (transición G1/S)
RB/D13S25
ATM/MLL
P53
MDM2?
Alteración
Quijano S et al. Blood. 2008
80%
5%
15%
Campo E. et al. Blood 2011
MECANISMOS DE TRANSFORMACIÓN MALIGNA DE CÉLULAS B
DE CENTRO GERMINAL EN SLPC-B
Centro germinal (CG)
DC foliculares
Célula B
del CG
Linfoplasmocito
Célula
plasmática
B T
Apoptosis
Mecanismos
oncogénicos
C-MYC
NFκ
κB
BCL2
BCL-6
PAX5
BCL6
*Anomalías adicionales de P53, RB,
P16, P27, ATM
Küppers R. Nat Rev Cancer 2005
MAYOR AGRESIVIDAD TUMORAL Y
VENTAJA PROLIFERATIVA
Alteraciones genéticas en Leucemias agudas
•60-80%
de
los
casos
presentan
cromosómicas estructurales y/ó numéricas
alteraciones
*Pronóstico: buen pronóstico -t(12;21) e hiperdiploidia (51-65 cromosomas)
mal
pronóstico -t(9;22); t(4;11), t(1,19) e hipodiploidia-.
* Implicadas en proceso de transformación maligna, activación de vías mitógenas,
inhibición de la apoptosis y la respuesta inmune anti-tumoral.
Van Dongen et al, Lancet 2010.
Onciu M. Hematol Oncol Clin N Am. 2009
Malignidades hematológicas:
hematológicas:
APLICACIONES CLINICAS DEL
INMUNOFENOTIPO
Diagnóstico: identificación de células
neoplásicas (presencia vs ausencia)
Clasificación: identificación de línea,
estadio madurativo, screening de
alteraciones cromosómicas
Evaluación Pronóstica
Monitorización del tratamiento
Caracterización inmunofenotípica de células
tumorales por citometría de flujo
EN QUE SE PARECEN LAS CELULAS LEUCEMICAS A
LAS CELULAS NORMALES ?
- Reflejan línea celular y estadio madurativo.
EN QUE SE DIFERENCIAN LAS CELULAS LEUCEMICAS
DE LAS CELULAS NORMALES ?
- Reflejan distintos patrones de expresión de
proteínas
(alteraciones genéticas)
La interpretación adecuada de neoplasias
hematológicas requiere el
“CONOCIMIENTO“
del Inmunofenotipo de
MUESTRAS NORMALES
Van Lochem. et al. Clinical Cytometry 2004
Wood B. et al. Clinical Cytometry 2007
Pérez de Andrés M. et al. Clinical Cytometry. 2010
Saavedra, C., Quijano S, Orfao A. et al. Biomédica 2010
Inmunofenotipo de poblaciones B de Médula Ósea normal:
Citometría de flujo de 4 fluorescencias
Clinical Cytometry 2004
Inmunofenotipo de poblaciones B de Médula Ósea normal:
Citometría de flujo de 4 fluorescencias
Selección de
células CD19+
Pre-pre B
Pre-B
Célula B inmadura
Célula B madura
Van Lochem. et al. Clinical Cytometry 2004
Inmunofenotipo de células B de distintos tejidos normales
Clinical Cytometry 2010
Inmunofenotipo de células B de distintos tejidos normales
Citometría de flujo de 6-8 fluorescencias
B maduras
B maduras
B inmaduras
SP= 614 individuos sanos
20-90 años
B inmaduras
Pre-B II
Plasmablastos
Pre-B I
Plasmáticas
PB
B memoria
B memoria
Plasmablastos
B centro germinal
B vírgenes
Plasmablastos
B vírgenes
B inmaduras
Pérez de Andrés et al. Clinical Cytometry 2010
Población de estudio: 10 muestras de MO de individuos
61-79 años
OBJETIVOS
1. Cuantificar distintas subpoblaciones celulares hematopoyéticas de
MO normal en términos absolutos y relativos.
2. Analizar la expresión de diferentes marcadores celulares cuya
reactividad está asociada a la diferenciación linfoide y mieloide, con el
fin de establecer rangos de expresión para los mismos.
3. Utilizar estos resultados como parámetros de análisis para el
diagnóstico y clasificación de las leucemias mieloides agudas y
síndromes mielodisplásicos que se estudien en la Unidad de Citometría
del Hospital Universitario San Ignacio.
Análisis de muestras de MO mediante citometría de flujo
EDTA Muestras de MO disgregadas (aprox. 5 mL)
Pasadas por jeringa (diámetro X)
100 uL muestra
Marcaje celular
FITC
PE
PERCP
APC
ESFERAS
cyTdT
cyMPO
CD45
CD34
+
CD34
CD11b
CD45
CD34
+
HLA-DR
CD117
CD45
CD34
+
CD64
CD14
CD45
CD34
+
CD71
CD36
CD45
CD34
+
CD15
CD16
CD33
CD34
+
Adquisición y análisis en el Citómetro de flujo FACSCalibur BDB
Programas informáticos CellQuest Pro y Paint A Gate BDB
Análisis de precursores CD34+
Precursores mieloides
Precursores linfoides
Malignidades hematológicas:
hematológicas:
APLICACIONES CLINICAS DEL
INMUNOFENOTIPO
Diagnóstico: identificación de células
neoplásicas (presencia vs ausencia)
Clasificación: identificación de línea,
estadio madurativo, screening de
alteraciones cromosómicas
Evaluación Pronóstica
Monitorización del tratamiento
LLA-B Momento del Diagnóstico (90% de linfoblastos)
FRECUENCIA ELEVADA
0
256
512
768
1024
FSC-A ->
2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs
HEMATOPOYETICAS
100
101
102
103
104
CD45 PerCP-A ->
2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs
CELULAS
INMADURAS
100
101
102
LINEA B
103
104
CD34 PE-A ->
2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs
100
101
102
102
103
104
CD19 FITC-A ->
2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs
CELULAS
INMADURAS
100
101
MARCADORES
ABERRANTES
103
104
CD10 APC-A ->
2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs
100
101
102
103
104
CD38 PE-Cy7-A ->
2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs
SPLCSPLC
-B: fenotipo normal vs aberrante
Célula B normal
Células B aberrantes
Tricoleucemia
LLC-B
Tricoleucemia
Tricoleucemia
Malignidades hematológicas:
hematológicas:
APLICACIONES CLINICAS DEL
INMUNOFENOTIPO
Diagnóstico: identificación de células
neoplásicas (presencia vs ausencia)
Clasificación: identificación de línea,
estadio madurativo, screening de
alteraciones cromosómicas
Evaluación Pronóstica
Monitorización del tratamiento
Clinical Cytometry 2004
0
256
FSC-A ->
MO_MUESTRA.fcs
512
FSC-A
768
1024
SSC-A
SSC-A
SSC-A
Leucemia Promielocítica Aguda:
INMUNOFENOTIPO DE CASO t(15;17)+
CD33++
100
101
102
CD33 PerCP-Cy5-5-A ->
MO_MUESTRA.fcs
103
104
CD33 PERCPCY5.5
Promielocito normal CD15+
CD117-/+
100
101
102
103
104
CD117 APC-A ->
MO_MUESTRA.fcs
CD117 APC
Promielocito aberrante CD15+ débil
Clinical Cytometry 2004
100
10 1
102
CD10
RFR7690.008
CD10 ->
103
10 4
100
10 1
CD13 ->
102
CD13
RFR7690.008
103
10 4
CD20
CD45
CD19
CD19
LLA-B:
INMUNOFENOTIPO DE CASO BCR/ABL+
100
101
102
103
10 4
CD34 ->
CD34
RFR7690.007
CD19++,CD13+, CD45-/+, CD20-/+
100
10 1
10 2
CD34
RFR7690.011
CD34 ->
103
104
FENOTIPO Y ALTERACIONES GENÉTICAS EN LLC-B
CD23
CD43
CD5
bcl2
CD38
CD11c
SSC
CD27
CD25
CD22
sIgM
sIg
CD79b
Marcador
CD20
FMC7
CD24
CD19
FSC
13qtrisomía 12
11q17p-
n= 180 pacientes
Alteración genética
Pacientes
Grupo A
(n=38)
Grupo B
(n=19)
A
Grupo fenotípico
B
% +12
11%
37%
46%
% -13q
78%
43%
33%
% -11q
5%
5%
18%
% -17p
5%
5%
3%
FMC7CD23-
CD38+
CD20+
FMC7+
sIg+
CD79b+
Fenotipo
CD38CD79b-/d
sIg-/d
Grupo C
(n=33)
-3.00
0.00
+3.00
Quijano S et al. Clinical Cytometry. 2008
C
Expresión de Zap70 en LLC-B por citometría de flujo
LINFOCITOS T
LINFOCITOS T
CD3 PercP
CD3 PercP
Casos ZAP70+:
- Peor pronóstico
- Ausencia de mutaciones genes
IGVH (fenotipo de linfocito B
virgen)
-Trisomía 12
- Asociado
a
estadios
avanzados
LLC-B
NEGATIVA
Zap70 PE
CELULAS B
TUMORALES
Zap70 PE
Zap70 PE
CELULAS B
TUMORALES
Zap70 PE
Inmunohistoquímica
Crespo M et al. N Engl J Med 2003
Carreras J et al. J of Pathol 2005
Lanasa M. Hematology 2010
Rivkina A et al. Exp Oncol 2011
LLC-B
POSITIVA
Análisis del ciclo celular en neoplasias hematológicas
por citometría de flujo
- La tasa proliferativa y la aneuploidia de ADN se asocian
con la agresividad tumoral y son factores pronósticos
independientes.
- Identifican grupos de pacientes con mayor riesgo de
transformación a variantes más agresivas de la enfermedad.
- Las leucemias y linfomas muestran una tasa proliferativa
muy heterogénea que, puede reflejar la de su
contrapartida madurativa normal y que varía según la
alteración genética asociada y el microambiente celular.
Quijano S et al. Clinical Cytometry. 2008
Quijano S et al. Blood. 2008
ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR:
SP (n=5):
CD20/CD23/DRAQ5
GGLL (n=5): CD38/CD20/DRAQ5
CD23-PE
CD38/CD19/DRAQ5
400
No de eventos
MO (n=10): CD45/CD19/DRAQ5
100 101 102 103 104
- Muestras control:
300
%S+G2/M= 0.1%
200
100
0
100 101 102 103 104
0
256
CD20-FITC
512
768
1024
Cantidad de ADN
- Linfomas B (n = 432 pacientes):
Quijano S et al. Blood. 2008
400
%S+G2/M= 18%
300
No de eventos
SSC
CD19/CD20/CD22/CD23-FITC +
Yorudo de propidiop (IP)
0 256 512 768 1024
Kit Cycloscope-NHL (Cytognos; Salamanca)
200
100
10 0 10 1
3
4
10 2 10 10
CD19/20/22/23 FITC
0
0
256
512
768
Cantidad de ADN
1024
TASA PROLIFERATIVA DE LAS CÉLULAS B NORMALES
A LO LARGO DE LA DIFERENCIACIÓN B
MO
SP
GGLL
30%
*
25%
% de células en fase S+G2/M
MO
20%
15%
10%
*
5%
*
*
*
*
*
*
0%
CD45lo CD45+ CD45hi
CD19lo CD19hi CD19+
Precursores B
CD20+ CD20+
CD23+ CD23-
CD38lo CD38+ CD38hi
CD20+ CD20hi CD20lo
Linfocitos B maduros
Quijano S, et al. Blood 2008.
Quijano S, et al. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2008.
CD38hi
CD19+
Células Plasmáticas
*p<0.05
TASA PROLIFERATIVA DE LOS LINFOMAS B
VS SU CONTRAPARTIDA NORMAL
% de células en fase S+G2/M
50%
SPN:
MON:
Linfocitos B Células B
CD45hiCD19+ CD20+CD23+
GL: Células B CD38loCD20+
GL: Células B CD38+CD20hi
*
CP normales de
MO y GL
*
**
40%
30%
20%
*
*
10%
*
74%
*
16%
60%
37%
50%
**
*
0%
LLC-B
(MO)
16%
LLC-B
(SP)
LZME
LCM
TL LCM
MALT
(MO/SP) (GL)
*Fase S+G2/M significativamente elevada
**Fase S+G2/M significativamente disminuida
93%
21%
LF
LBDCG
83%
LB
LLP/MW
% de casos alterados
% de casos aneuploides
LINFOMAS B: FRECUENCIA DE LAS
ALTERACIONES GENÉTICAS ANALIZADAS
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
5%
21%
10%
18%
42%
29%
LLC-B
LCM
MALT
LF
LBDCG
LB
6%
LLP/MW
LB
LF
LCM
77%
13q-
25%
22%
+12
9%
11q-
LBDCG
13
93%
MALT
LLC-B
37%
86%
61
7%
17p-
LLP/MW
38%
t(11;14) t(14q32) t(14;18) t(3q27) t(8;14)
30%
8%
6q21- t(14q32)
Ploidia de ADN en pacientes pediátricos
con LLA-B
*
n=14
n=30
LLA-B
Indice de ADN
Media ± DS
Rango
P
Diploides
0,94 ± 0,02
0,94-1
<0,001
Hiperdiploides
1,15 ± 0,2
1,01-1,9
Quijano S, Saavedra C et al. Artículo en preparación 2011.
Tasa proliferativa de blastos en pacientes
pediátricos con LLA-B
*
*
*
*
n=7
n=44
*
Quijano S, Saavedra C et al. Artículo en preparación 2011.
Malignidades hematológicas:
hematológicas:
APLICACIONES CLINICAS DEL
INMUNOFENOTIPO
Diagnóstico: identificación de células
neoplásicas (presencia vs ausencia)
Clasificación: identificación de línea,
estadio madurativo, screening de
alteraciones cromosómicas
Evaluación Pronóstica
Monitorización del tratamiento
ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL
*Realizados con técnicas altamente sensibles: Biología molecular y
citometría de flujo
Leucemia Mieloide Aguda
Citometría de Flujo:
*fenotipos anormales: 75-85% de los
casos
- Sensibilidad: puede variar según las
aberraciones fenotípicas detectadas al
diagnóstico
San Miguel JF et al. Blood 2001.
PCR cuantitativa (RQ-PCR):
-Detección de WT1, FLT3, AML1-ETO,
CBFbeta/MYH11 en casos con t(8;21) e
inv(16): identificación de pacientes con
alto riesgo de recaída.
-Sensibilidad: 0.1%-0.001% (1/10001/100.000) (leucémicas/normales)
% de células
residuales posttratamiento (15
días)
Probabilidad de
recaída
<0.01%
Baja
0.01%-0.1%
0.1%-1%
Intermedia
>1%
Alta (84%)
Shook D et al. Clin Lymphoma Myeloma 2009.
ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL
Leucemia Linfoide Aguda
Citometría de Flujo:
*Requiere
conocimiento
de
perfiles
fenotípicos de MO y SP en condiciones
normales y EXPERIENCIA en el análisis de
clones y selección de los marcadores
adecuados
- Muy útil en fases pre y post-trasplante
de células stem.
-Sensibilidad: puede variar según las
aberraciones fenotípicas detectadas al
diagnóstico
- Límite de positividad: 0.01%
Bruggemann M. Blood 2006
PCR cuantitativa (RQ-PCR):
-Detección de BCR-ABL, MLLAF4,
E2A-PBX1
y
TEL-AML1
con
sensibilidad: 0.1%-0.001% (1/10001/100.000) (leucémicas/normales)
Adultos LLA-B
% de células
residuales posttratamiento
Probabilidad de
recaída (durante
3 años)
Días 11 y 24
<0.01%
0%
Hasta la semana
16:
0.01%
>0.01%
47%
94%
Campana D. Semin Hematol. 2010.
I Consenso Colombiano de Citometría: Manejo de
muestras para estudios inmunofenotípicos
Tipo de
muestra
Sangre
periférica**
Médula Ósea
Sangre
de
cordón
umbilical+
Productos
de
leucaféresis
Biopsias
de
tejidos
sólidos**
Punciones
de
tejidos sólidos
(PAAF)**
Líquido
cefalorraquídeo
(LCR)
Otros
fluidos
corporales**
Tiempo*
Lavados
Estabilizantes
Centrifugación
Anticoagulantes
Hasta 24
horas
Hasta 24
horas
Hasta 24
horas
Si
No
Si
EDTA, Heparina
Solución
salina/PBS
estéril para
transporte
No
Si
No
Si
EDTA, Heparina
No
No
No
No
EDTA, Heparina
No
Hasta 24
horas
60 minutos
No
No
No
EDTA, Heparina
No
Si
No
Si
No
Si
60 minutos
Si
No
Si
No
Si
Temperatura
30 minutos
(sin
estabilizar)
60 minutos
Si
Si***
Si (máximo dos
pasos)
EDTA
No
Si
Si
Si
EDTA
Si
*Tiempo máximo comprendido entre la obtención, transporte, y procesamiento de la muestra.
**Las muestras pueden ser estabilizadas si se requieren confirmar estudios posteriores .
***El empleo de una solución estabilizante previene la pérdida celular por periodos de tiempo superiores a las 24-48
horas de su obtención.
+: Viabilidad celular
Saavedra, C., Quijano S, Orfao A. et al. Biomédica 2010
Rastreo diagnóstico de meningitis
neoplásica por citometría de flujo
“El manejo de muestras de LCR requiere unas condiciones
especiales de almacenamiento, transporte, preparación y
marcaje”.
Kraan J et al. Current Protocols Cytometry 2008
Fase pre
pre-analítica
Muestras de LCR estabilizadas (Transfix, Immunostep SL)
EDTA
Previene pérdida celular por periodos
Superiores a 24-48horas (MO y SP)
LCR: mantiene celularidad >10d a 2-8°C
Canonico B et al. J Immunol Methods 2004
Quijano S et al. J. Clin Oncol. 2009
Quijano S et al. Eur. J. Hematol. 2010
Kraan J et al. Current Protocols Cytometry 2008
DETECCIÓN DE INFILTRACIÓN DE SNC EN
LNH-B AGRESIVO:
CMF versus Citología (n=123)
Infiltración
de LCR
CMF
Citología
P
27/123 (22%) 7/123 (6%) <0,0001
100%
75%
Positivos
Negativos
50%
25%
0%
CMF
Quijano S et al. J. Clin. Oncol. 2009; 27(9): 1462-9
Citología
200
*p<0,001
150
100%
*p<0,001
% de células
Nº de células/µ
células/µL
FRECUENCIA DE CÉLULAS B NEOPLÁSICAS
EN MUESTRAS DE LCR INFILTRADAS POR CMF
80%
100
60%
50
40%
20%
*
*
0
Citología+/CMF+
Citología-/CMF+
0%
Citología+/CMF+
Citología-/CMF+
Punto de corte: <20% y <1 célula B
neoplásica/µ
µL
Quijano S et al. J. Clin. Oncol. 2009; 27(9): 1462-9
ANALISIS DE RECAIDAS DURANTE EL
SEGUIMIENTO
Seguimiento: 105/123 (85%)
20 meses (rango 10-33 meses)
Sancho JM, Orfao A; Quijano S. European J. Hematology 2010; 85 (4): 821-8.
GRACIAS