CITOQUIMICA

CITOQUIMICA
“APLICADA A LA HEMATOLOGIA”
Bqca. Ivan María Victoria
Hematología Clínica
2013
La citoquímica estudia la composición química de la
célula y permite detectar la localización topográfica
de algunos principios inmediatos: enzimas, metales
pesados, sustancias orgánicas moléculas de depósito y
otras sustancias.
MORFOLOGÍA <-----> BIOQUÍMICA
 Son un complemento de las tinciones hematológicas.
 Por medio de ellas se localizan enzimas y sustancias
inorgánicas.
 Así se mejora la diferenciación celular.
 También sirven para el diagnóstico
CONFIABILIDAD DE LOS METODOS PARA EL Dx
DE LAS LEUCEMIAS AGUDAS
CITOMORFOLOGIA.
70-80%
CITOQUIMICA.
90-95%
INMUNOFENOTIPO
MAS
MICROSC. ELECTRN.
99100%
CITOGENETICA Y BIOL. MOLECULAR
MUESTRAS UTILIZADAS
 EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFÉRICA
 PUNCION DE MÉDULA ÓSEA
 PUNCION DE GANGLIOS
 LCR
TIPOS DE TINCIONES
Se pueden clasificar en:
 Atendiendo al nivel de vitalidad de las células que
se pretende colorear, se pueden dividir en vitales y
no vitales.
 Atendiendo al momento en el que empezaron a ser
utilizadas para el Dx hematológico, se dividen en
tradicionales y especiales.
TINCIONES VITALES Y NO VITALES
 Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se
practican sobre células que están vivas.
 Las tinciones vitales son aquellas que se efectúan sobre
células que están vivas, mediante la introducción de un
colorante en la circulación de un organismo vivo. Son
colorantes vitales: el verde Jano y el azul de metileno.
 Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre
células o tejidos vivos, pero que están aislados del organismo
del que proceden.
 Las tinciones no vitales se realizan sobre células muertas. La
coloración de células muertas requiere un proceso previo de
fijación, que tiene por objeto el mantener inalterada su
estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del
portaobjetos.
TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES
 Colorantes ácidos: tienen una especial afinidad por las
estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la
hemoglobina (eosina).
 Colorantes básicos: tienen una especial afinidad por las
estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los
ácidos nucleicos (azul de metileno).
 Colorantes neutros: son sales de un ácido y de una base
coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de
otro (eosinato de azul de metileno).
 Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por
estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y
tiñen a aquellas sustancias que tienen un poder de
disolución superior al del líquido empleado para preparar la
solución colorante (Sudán III)
También hay combinaciones de colorantes
que dan lugar a tinciones polícromas.
 Una coloración es panóptica cuando se utilizan
sucesivamente sustancias colorantes neutras.
(May-Grünwald-Giemsa)
 Y es pancrómica cuando se aplican todas las
sustancias colorantes neutras juntas (azul de
metileno, eosina, Wright)
Las reacciones citoquímicas pueden también
clasificarse según el mecanismo químico
involucrado
1-Progresivas estables: Son reacciones que
exigen un tiempo mínimo pero no un máximo.
2-Progresivas indefinidas: En estas la reacción
continúa y puede hacer ilegible el preparado o
conducir a valores erróneos.
3-Fugaces: Son las que pierden color
rápidamente y no pueden conservarse mucho
tiempo.
CLASIFICACION DE LAS TÉCNICAS
CITOQUÍMICAS
CITOQUÍMICA CLÁSICA
CITOQUÍMICA ELCTRÓNICA
CITOQUÍMICA FLUORESCENTE
INMUNOCITOQUÍMICA
NO FLUORESCENTE
CITOQUÍMICA AUTOMATIZADA
Citoquímica Clásica: Se fundamenta en reacciones coloreadas que pueden observarse e
interpretarse con el microscopio óptico común.
Citoquímica electrónica: Se caracteriza por ser una metodología de elevada sensibilidad
Citoquímica Fluorescente: puede o no ser inmunocitoquímica, se fijan sobre distintas
estructuras de las células y al ser excitadas por luz UV producen fluorescencias de distintos colores
Inmunocitoquímica no fluorescente:Se basa en la marcación de anticuerpos con
sustancias que son capaces de dar reacciones citoquímicas intensamente coloreadas que permiten su revelación.
Fisicocitoquímíca electroforética Permite reconocer determinados componentes
de las organelas celulares obtenidas en solución mediante la lisis de la misma. Mediante electroforesis en un
campo eléctrico y la identificación por reacciones citoquímicas, permite identificar complejos isoenzimáticos,
mientras que los métodos citoquímicos simples revelan una enzima en bloque.
Citoquímica automatizada: Es el fundamento de la CMF que utiliza la citoquímica
fluorescente
CITOQUIMICA ELECTRONICA:
CITOQUIMICA FLUORESCENTE:
•INMUNES
•NO INMUNES
S
INMUNOCITOQUíMICA NO FLUORESCENTE
Inmunocitoquímica con detección
indirecta y enzimática. La sección
se obtiene de tejido previamente
fijado. Inmediantemante después
se incuban en una solución de
bloqueo que satura los posibles
sitios de unión inespecífica, gracias
a una alta concentración de
proteína como la albúmina de suero
bovino. Tras cada paso de unión de
anticuerpos o del complejo avidinabiotina-peroxidasa se procede a
lavar los cortes en una solución
tamponada de fosfato (tampón
fosfato), en la que también van
disueltos los anticuerpos. La
reacción de la peroxidasa convierte
unos sustratos, la diaminobencidina
y el peróxido de hidrógeno, en un
producto insoluble y coloreado
visible con el microscopio ótico.
CITOQUIMICA AUTOMATIZADA:
Definición de reacción citoquímica
Es la reacción que por el método de uno o mas
reactivos químicos: aplicados a la célula en
condiciones definidas; determina la formación de
productos coloreados; insolubles; no difusibles;
que permiten el reconocimiento microscópico; de
sustancias o grupos químicos definidos; en su
real ubicación citológica; para lo cual no deben
destruir a la célula, y si lo hacen deben
reemplazar a la sustancia identificada en su
topografía
Las finalidades primordiales
 El reconocimiento y diagnostico celular
 El estudio de la fisiología y la fisiopatología
celulares
 El Dx de la patología
ESTANDARIZACION DE METODOS EN
CITOQUIMICA
 Preparación estricta de los reactivos
 Practicas permanentes de las reacciones con preparados testigos
 Realización, la fijación y conservación adecuada de los preparados y
reactivos
 Determinación de tiempos exactos para cada uno de los pasos
 Ídem de temperatura (especial para enzimas)
 Tiempo y condiciones de la inmersión para la lectura
 Diámetros y conservación idóneos de los elementos sobre los cuales
se lleva a cabo la determinación
Tres pasos fundamentales:
 Fijación: preservar las estructuras y reactividad funcional de las
células.
 Incubación en el medio de reacción: como consecuencia se generan
productos que ponen en evidencia el componente a ser estudiado.
 Contraste: permite detectar con mayor facilidad el producto de
reacción .
Las reacciones deben tener 3
características:
sensibilidad, especificidad y
reproductibilidad.
Pueden ser reconocibles….
SUSTANCIAS RECONOCIBLES:
ENZIMAS RECONOCIBLES
1-DNA Y RNA.
2-PROTEINAS.
3-HEMOGLOBINA.
4-HIDRATOS DE CARBONO.
5-LIPIDOS.
6-FOSFOLIPIDOS.
7-METALES
1-MIELOPEROXIDASAS (MPO)
2-FOSFATASA ALCALINA (FAL)
3-FOSFATASA ACIDA (FAC)
4-ESTERASAS (EST)
5-FOSFATASA ACIDA TARTRATO
RESISTENTE (FAC-TR)
6-DEHIDROGENASAS (DH)
CITOQUIMICA CLASICA
reconocimiento por:
principios no enzimáticos
principios enzimáticos
Hidratos de carbonos: PAS
MPO
Fe hemosiderínico: PERLS
FAL
Lípidos: Red Oíl/Sudan Black
FAL
Hemoglobina fetal: elución acida
ESTEARASAS
CATALASAS
ENZIMAS HIDROLITICAS
TINCIONES CLASICAS
1) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO
ENZIMATICOS
TINCIÓN DE PAS
(Peryodic Schiff Acid)
Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los
carbohidratos por la acción del ácido peryódico, potente
agente oxidante, liberándose grupos aldehído que al
combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de
color rojo púrpura intenso.
-C-C-
ALDEHIDOS
ACIDO PERYODICO
“PURPURA”
SCHIFF
RESULTADOS:
células (+) con patrón difuso fucsia
intenso, lacunar y granular de acuerdo a la progenie
 Serie granulocitica normal: (+) difusa en toda la serie
mieloide
 Basófilos: (+) con patrón lacunar o (–) hasta un 50%
 Serie eritroide normal: negativa
 Serie megacariocitica normal: (+) en plaquetas con un
patrón difuso mas granular o bloques
 Precursores linfoides: (-), hasta llegar a linfocito en el
que un 30% es (+) en corona de gránulos
NEUTROFILO Y ERITROBLASTOS NORMALES
MEGACARIOCITOS Y PLAQUETAS NORMALES
LINFOBLASTOS LEUCEMICOS PAS (+)
LMA6 en MO PAS (+)
TINCION DE PERLS
 Se basa en la liberación de los iones férricos de su
unión con las proteínas por la acción del ácido
clorhídrico; dichos iones férricos al reaccionar con
el ferrocianuro potásico dan un precipitado azul
verdoso de ferrocianuro férrico.
 Por esta reacción se detecta el Fe hemosiderínico, que
es insoluble, pero no el Fe contenido en la ferritina que
es hidrosoluble.
Sideroblastos en anillo
Reflejando una anormalidad
en la acumulación de Fe en
las mitocondrias
(azul de Prusia)
HEMOSIDENURIA: hierro liberado en orina en una HPN
En el estudio del Fe medular hay que valorar
conjuntamente 3 parámetros:
nº de sideroblastos, tipo de los mismos y Fe
macrofágico.
Básicamente se presentas 3 patrones:
1) nº sideroblastos alto y Fe de depósito aumentado: es
frecuente hallarlo en estados anémicos que cursan con
sobrecarga férrica.
2) nº sideroblastos bajo y Fe de depósito disminuido o
ausente: es el patrón característico de la anemia
ferropénica pura; de aparición muy precoz en un balance
férrico negativo.
3) nº sideroblastos bajo con acúmulo de Fe en los
macrófagos medulares. Este patrón disociado es propio de
entidades que condicionan un bloqueo del Fe a nivel de los
macrófagos, por lo que el Fe no puede ser cedido a los
eritroblastos, suele observarse en anemias secundarias.
Hemocromatosis
(cortes histológicos de
hígado)
HEMOGLOBINA FETAL
Test de Kleihauer-Betke
 La hemoglobina fetal (HbF o 22) es ácido y álcali
resistente. Por consiguiente, sometiendo un
preparado fresco de sangre a una elución ácida
será arrastrada la hemoglobina A y retenida la
fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce
por la coloración de estos últimos.
 Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean con
eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina
A han sido reducidos a sus membranas vacías y
aparecen como sombras.
Esta prueba se usa para determinar si hay GR
del feto en una mujer embarazada con un
grupo sanguíneo Rh(-).
SUDAN BLACK / RED OIL
Ambas se utilizan para la detección de lípidos,
en el caso del Sudan Black este tiñe los
fosfolípidos y esteroles de membrana de los
gránulos.
 Es un colorante lipofilo que se une de forma
irreversible a un componente granular indefinido
en los granulocitos, en los eosinofilos y en algunos
monocitos.
El producto de
la reacción es
negro y
granular
Tiñe tanto los gránulos azurófilos
inespecíficos como los específicos
de los neutrofilos
LMA2 (con eosinofilia t(8;21): intensa tinción de
las células en maduración y de los gránulos de
los eosinofilos anormales.
2) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS
ENZIMATICOS
MIELOPEROXIDASA
La demostración citoquímica de esta enzima se
basa en la acción oxidante de la peroxidasa sobre
un sustrato (bencidina) en presencia de peróxido
de hidrógeno, apareciendo un precipitado azul en
el lugar del citoplasma en donde se ha producido
la reacción.
BENCIDINA
H2O2
MPO
Resultados….
siempre patrones granulares!
 ERITROCITOS Y SU PROGENIE : NEGATIVOS (etanol)
 GRANULOCITOS Y SU PROGENIE : (+) patrón granular intenso en
toda la serie granulocítica mieloide y en menos del 3% de los blastos en
MO. Los blastos mieloides dan un patrón característico polar, en casquete.
 EOSINÓFILO (+) en la membrana granular, el fondo del granulo
conserva la coloración parda.
 BASÓFILO (+) en 50%
 LINFOCITOS Y SU PROGENIE: NEGATIVOS
 MONOCITOS: (+) patrón granular escaso o disperso
NORMALES..
PATOLOGICOS…
“ESTRES OXIDATIVO”
Scorificación de MPO en granulocitos:
 Se categorizaron los neutrófilos de acuerdo al contenido de
gránulos presente en el citoplasma, en scores que van de 0 a 4,
en orden creciente.
Grado 0: Sin granulaciones teñidas. (fig. 1 y
2)
Grado 1: Escasas granulaciones teñidas
dispersas (fig.3 y 4)
Grado 2: Regulares granulaciones sin
cubrir el núcleo (fig. 5)
Grado 3: abundantes granulaciones teñidas en
todo su citoplasma sin llegar a cubrir
completamente el núcleo.
(fig.6 )
Grado 4: granulaciones que cubren la célula completamente dándoles un
aspecto de casquete. (fig.8 y 9)
FOSFATASA ALCALINA
 La FA es una fosfomonoesterasa que es activa francamente a
ph alcalino y actúa sobre grupos esteres fosforados liberando
el ion fosfato.
 La actividad de la FA granulocítica es marcadora de la
granulación especifica de los neutrófilos.
 Inicialmente se pensó que la FA estaba localizada en gránulos
específicos (secundarios), pero se demostró que esta asociada
con un componente membranoso del citoplasma identificado
como una estructura tubular de forma irregular distinta de los
gránulos 1 o 2 y de otras organelas citoplasmáticas.
Alfa-naftil fostato
ph alcalino
FAL
naftilo
Colorante
diazoico
Compuesto diazotado
fosfato
Cuidados:
 Efectuar la reacción en frotis de no mas de 24 hs.
 Conservar los preparados en heladera envueltos en
papel absorbente con un desecador.
 Ph de la reacción
.
La actividad granulocitica de la FA se
manifiesta en forma de un
precipitado de color pardo negruzco
localizado en el citoplasma
Se encuentran actividad FA en
algunas células maduras y
semimaduras de la
granulopoyesis neutrofilica
(segmentados y bandas)
Índice de actividad de FAL
Es la suma de los grados de positividad de 100
neutrófilos.
Score: 95+/-20
 Grado 0: sin reacción
 Grado I: coloración difusa o con pequeños puntos coloreados
 Grado II: mayor densidad cromática, por lo general en la zona del hilio nuclear.
 Grado III: mayor granulación oscura, tiñe todo el citoplasma.
 Grado IV: completamente oscuro
 Su máximo interés se centra en el estudiode
los síndromes mieloproliferativos: LMC valores
muy bajos o nulos. Su determinación es muy útil
para establecer el diagnóstico diferencial
entre LMC y reacciones neutrofílicas
secundarias que cursan con valores
elevadísimos.
 Hemoglobinuria Paroxística Nocturna
 Hipofosfatemia hereditaria.
FOSFATASA ACIDA
Se basa en la hidrólisis del substrato
naftol-AS-Bi-fosfato.
La aplicación práctica del estudio de la FA se refiere sobre
todo al estudio de los síndromes linfoproliferativos
crónicos (LPC) y leucemia aguda linfoblástica (LAL), dónde
existe una buena correlación entre el tipo de positividad y
el fenotipo de membrana.
FAC LT(+) Y LB (-)
El 90% de las LAL de origen T dan una reacción + intensa de localización
centrosómica. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores
elevados de FAC que es tartrato sensible. La LLC-B presenta muy escasa
actividad al igual que ocurre con otras proliferaciones de linfocitos B.
Tricoleucemia: Tinción fosfatasa ácida (+) tartrato resistente
LLA-T: INTENSA ACTIVIDAD CENTROSOMICA DE FOSFATASA ACIDA EN
MAS DEL 70 % DE LOS BLASTOS.
ESTEARASAS
 Son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar




una variedad de esteres alifáticos u aromáticos
en condiciones neutras o ácidas.
Se distinguen tres tipos:
Esterasa específica para línea granulocítica
Esterasa monocítica
Esterasas comunes: son expresadas por varias
células hematopoyéticas
La demostración citoquímica de las esterasas
leucocitarias se basa generalmente en la habilidad de
reaccionar con el grupo ester del Naftol AS.
Los sustratos para las esterasas de uso común en
hematología incluyen:
• Naftol AS-D Cloroacetato
• Naftol AS-D acetato ( NASDA)
• α-Naftil acetato
• α-Naftil butirato
Estos sustratos al ser hidrolizados en presencia de una
sal diazoica dan un precipitado insoluble en el lugar de
la reacción.
CLOROACETOESTEARASA (CEA)
 SUSTRATO ESPECIFICO: Naftol AS-D Cloroacetato
Es una esterasa que muestra una actividad específica
para la línea granulocítica.
 Aparece ontogénicamente posterior a
mieloperoxidasa por lo que es menos sensible para
los blastos muy inmaduros.
 Los eosinoblastos que son positivos para peroxidasa
no muestran actividad para esta reacción.
 Las líneas monocítica, eritroide, linfoide y
megacariocítica son negativa.
NAFTOL AS-D ACETATO ( NASDA)
• Detecta las 3 esterasa: granulocíticas: N, Eo, Ba
Monocítica comunes
La esterasa granulocítica es resistente a la inhibición con
Fna mientras la monocítica es sensible al FNa.
Las esterasas comunes tienen un comportamiento variable
frente al FNA.
Los precursores de la línea eosinofila son normalmente
negativos sin embargo la LMA M4 Eo es consistentemente
positiva a esta reacción ( inv 16).
α-NAFTIL ACETOESTERASA (ANAE)
Detecta las esterasas monocítica y esterasas
comunes.
• Las esterasas granulocíticas son normalmente no
reactivas.
• El patrón observado en las esterasas monocíticas es
difuso moderado a intenso y sensible a la inhibición
con
FNa.
• Las esterasas comunes muestran diferentes grados
de sensibilidad al FNa y presentan patrones de
reacción granular o focal.
α-Naftil butirato
Es el sustrato específico para las esterasas
monocítica pero a pesar de su aparente
especificidad no es recomendado por el Comité
Internacional de Hematología por su costo
EN RESUMEN…..
Granulocitos
Mb
PAS
Fe
MPO
FAL
FAC
ANAE
NCAE
Sudan
Black

Seg
Linfocitos
Monocitos
Plaquetas
Lbl 
Lin
Mbl 
Mon
Mg
 Pq
Eritrocitos
PEbl 
GR
Progenie linfoide normales (-)
Hasta llegar al linfocito donde un
30% es (+) en corona de
gránulos
Linfoblastos leucémicos (+)
Positividad en mazacotes
Serie roja normal (-)
Serie roja anormal (+) [LMA6]
Serie granulocitica (+) difusa
PAS en neutrofilos con un
patrón difuso
 Reacción de PAS, médula
ósea. Gránulos gruesos en el
citoplasma de los
linfoblastos.
LMA6 (eritroide) MO “PAS”: todos los precursores eritroide
contienen glucógeno, nunca los normales.
 La demostración citoquímica se basa en la hidrólisis
de ciertos substratos, de los cuales se liberan unos
productos intermedios que combinados con una sal
diazoica dan un precipitado coloreado.