Agrobiotecnología Clonación y transgénesis animal
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Agrobiotecnología Curso 2009 Clonación y transgénesis animal Lino Barañao Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires Sumario Clonación Clonación en distintas especies Animales transgénicos Recombinación homóloga Aplicaciones Agrobiotecnología Animales transgénicos Referencias Clonación Agrobiotecnología Animales transgénicos La clonación consiste en la producción de individuos genéticamente idénticos • En los animales, la clonación se basa en el uso de la técnica de transplante nuclear. • Mediante esta técnica, una célula donante . del individuo a clonar se transfiere a un . ovocito previamente enucleado. célula donante ovocito Agrobiotecnología embrión sintético Enucleación Electrofusión Animales transgénicos TRANSPLANTE NUCLEAR Clonación reproductiva de bovinos Para la clonación de bovinos suele partirse de células fetales como donantes del material genético. Los ovocitos pueden provenir de animales sacrificados para consumo ya que sólo aportan el ADN mitocondrial. El embrión obtenido en cultivo debe ser luego transferido a una hembra receptora para completar su desarrollo. Células donantes • Células adultas - La vida media es de 20 divisiones celulares. - La tasa de divisiones de 0,8 divisiones por día. - Son muy sensibles a la inhibición por contacto. - Se desarrollan en menor proporción. • Células fetales - La vida media es de 35 divisiones celulares. Ello permite su manipulación genética. - La tasa de divisiones de 1,3 divisiones por día. - Son muy sensibles a la inhibición por contacto. - Se desarrollan en mayor proporción. cortar el tejido explanto Ovocito recipiente 24 hs Expansión de las células del cúmulus OVOCITOS INMADUROS Primer cuerpo polar Agrobiotecnología Animales transgénicos OVOCITOS MADUROS • Los ovocitos obtenidos de ovarios de animales sacrificados para consumo deben ser madurados in vitro. • La maduración consiste en el avance de la división meiótica hasta la metafase II. • En este estadío se observa la extrusión del primer cuerpo polar. Transplante nuclear Para implementar la técnica de transplante nuclear se requiere disponer de micromanipuladores y de un microscopio con accesorios para visualizar fluorescencia. Agrobiotecnología Animales transgénicos Gentileza de Biosidus S.A. Transplante nuclear Gentileza de Biosidus S.A. Ovocito en MII Enucleación Célula donante Transplante nuclear Fusión celular Gentileza de Biosidus S.A. Activación Post-fusión Post-activación Desarrollo embrionario y preñez Aplicaciones de la clonación • La clonación reproductiva tiene distintas aplicaciones en biotecnología animal. - Clonado con fines agropecuarios - Clonado de animales de zoológicos y mascotas - Clonado para introducir modificaciones genéticas Agrobiotecnología Animales transgénicos • La clonación terapéutica se aplica en medicina humana. Clonación en distintas especies Agrobiotecnología Animales transgénicos Clonación en ovinos El primer mamífero clonado a partir de una célula somática fue una oveja, la ahora mundialmente conocida Dolly. Tomado de: http://www.roslin.ac.uk/imagelibrary/ Clonación de bovinos Uno de los primeros bovinos clonados fue “Second chance” Agrobiotecnología Animales transgénicos Tomado de: Hill et al., Biol. Reprod., 2000. Clonación de bovinos “Pampa” fue la primera ternera nacida por clonación a partir de fibroblastos fetales en Argentina Agrobiotecnología Animales transgénicos Gentileza de Biosidus S.A. Clonación de mascotas A pesar de que su dueño invirtió más de 3 millones de dólares en ello, “Missy” murió en 2002 sin haber sido clonada. Agrobiotecnología Animales transgénicos http://www.missyplicity.com Clonación de mascotas Clon de Little Gizmo Clon de Rainbow Agrobiotecnología Animales transgénicos http://www.savingsandclone.com/clients/our_latest_clones.html Cerdos clonados obtenidos por transferencia nuclear de células somáticas de un animal adulto El clonado de cerdos requirió modificar la técnica habitual de transplante nuclear. Tomado de: Poleiaeva et al., Nature, 2000. Clonación de primates ”Neti” y “Ditto” Agrobiotecnología Animales transgénicos Tomado de: Meng et al., Biol. Reprod.,1997. ¿Clonación de humanos? • La clonación reproductiva carece de justificación médica. • Su aplicación masiva es totalmente improbable en las condiciones actuales Agrobiotecnología Animales transgénicos Clonación terapéutica • La denominada clonación terapéutica permite generar tejidos de reemplazo a partir de células del paciente. Autotransplante Tejido normal (ej. fibroblastos) Factores de crecimiento Transplante nuclear Matriz extracelular Embrión (?) sintético Células precursoras del Ovocito (donado) Células embrionarias (pluri o totipotenciales) tejido dañado Animales transgénicos Agrobiotecnología Animales transgénicos Animales transgénicos • Un animal transgénico es aquel que tiene una porción de ADN foráneo en su genoma. - Los primeros animales transgénicos producidos fueron . ratones, obtenidos mediante microinyección de cigotas Macho fértil Hembra superovulada X Colecta de embriones Inyección con ADN foráneo Promotor Implantación de los embriones en hembras seudopreñadas Crías Agrobiotecnología Animales transgénicos Extracción del ADN y detección de la presencia del transgen Elementos requeridos en una construcción genética Promotor original del gen a expresar exones ADN genómico intrones ARN mensajero ADN copia Agrobiotecnología Animales transgénicos Gen recombinante Promotor regulable o tejido específico intrón La técnica de microinyección de cigotas resulta muy poco eficiente en bovinos Microinyección de cigotas bovinos Eficiencia Eficiencia en en la la producción producción de de animales animales Transgénicos Transgénicos por por microinyección microinyección Agrobiotecnología Animales transgénicos Cigotas microinyectadas 2.800 Sobreviven la microinyección 2.500 Embriones transferidos a receptoras Preñeces Terneros transgénicos 250 50 1 Clonación y transgénesis La introducción de genes por transfección y posterior selección de células totipotenciales permite producir animales transgénicos con muy alta eficiencia. Agrobiotecnología Animales transgénicos Gentileza de Biosidus S.A. Recombinación homóloga Agrobiotecnología Animales transgénicos Recombinación homóloga gen endógeno promotor exones contrucción conteniendo un gen de resistencia a antibiótico flanqueado por secuencias homólogas al exón a eliminar secuencias homólogas Neo intrones gen de resistencia a antibiotico recombinación Neo Neo el alelo en el que se ha producido la recombinación homologa no produce proteína activa Recombinación homóloga • La recombinación homóloga elimina un alelo por vez. • Los animales resultantes son heterocigotas. linea celular de partida recombinación homóloga Neo se ha eliminado uno de los alelos del gen transferencia nuclear el animal resultante posee todavía una copia activa del gen Recombinación homóloga Para obtener homocigotas (que no expresen la proteína) es necesario el cruzamiento de machos y hembras genéticamente modificados. X Neo Neo Neo Neo Neo Neo Homocigota Recombinación homóloga “Cupido” y “Diana”, primeros corderos producidos por la técnica de “gene targeting” Agrobiotecnología Animales transgénicos Tomado de: McCreath et al., Nature, 2000. Estrategias alternativas para la supresión de una proteína Proteína a suprimir Traducción Silenciamiento por RNAi X Transcripción Recombinación homóloga Agrobiotecnología Animales transgénicos ARNm X ADN Silenciamiento génico La introducción de secuencias cortas (22pb) de ARNs homólogos de doble cadena desencadena un proceso que degrada al ARNm blanco y conduce a la supresión de la proteína respectiva Degradación del ARNm ARN doble cadena Agrobiotecnología Animales transgénicos Transcripción ADN Características de los métodos usados para suprimir proteínas Recombinación homóloga Silenciamiento por ARNi - Afecta al ADN (suprime el gen) - Afecta al ARN (suprime al mensajero) - Requiere dos generaciones para obtener el fenotipo deseado - El fenotipo deseado se obtiene en la primera generación - La supresión es total - Pueden obtenerse niveles intermedios - Proteínas candidatas: PrP, lactoglobulina - Proteínas candidatas: lactoglobulina, proteínas de la leche, miostatina Aplicaciones Agrobiotecnología Animales transgénicos Aplicaciones •• •• •• •• •• Producción Producción de de alimentos: alimentos: -- Incremento Incremento en en la la velocidad velocidad de de crecimiento crecimiento y/o y/o masa masa muscular muscular en en cerdos cerdos yy peces peces -- Introducción de genes de resistencia a enfermedades Introducción de genes de resistencia a enfermedades Producción Producción de de órganos órganos para para xenotransplante: xenotransplante: -- Producción Producción proteínas proteínas humanas humanas que que bloquean bloquean la la acción acción del del complemento complemento en en cerdos cerdos (ejemplo, CD59) (ejemplo, CD59) -- Transplantes Transplantes temporaríos temporaríos de de corazón corazón oo hígado hígado hasta hasta la la obtener obtener donantes donantes compatibles compatibles Fines Fines ornamentales: ornamentales: -- Peces Peces que que expresan expresan proteinas proteinas fluorescentes fluorescentes Producción Producción de de fármacos fármacos (“molecular (“molecular pharming”) pharming”) -- Producción Producción de de proteínas proteínas recombinantes recombinantes humanas humanas en en leche leche yy suero suero Modelos Modelos animales animales para para patologías patologías humanas humanas -- Efectos Efectos de de sobreexpresión sobreexpresión de de genes genes -- Eliminación de genes (“knock out”) Eliminación de genes (“knock out”) Transgénesis en bovinos. Producción de alimentos •• Cambios Cambios cualitativos cualitativos en en la la producción producción de de leche: leche: -- Producción Producción de de lactoferrina lactoferrina en en leche leche bovina bovina -- Producción Producción de de leches leches “humanizadas” “humanizadas” -- Modificación Modificación de de las las caseínas caseínas para para la la producción producción de de .. quesos quesos especiales especiales •• Cambios Cambios cualitativos cualitativos en en la la producción producción de de carne: carne: Agrobiotecnología Animales transgénicos -- Producción Producción de de carne carne bovina bovina libre libre de de riesgo riesgo de de BSE BSE -- Modificaciones Modificaciones cualitativas cualitativas Transgénesis en bovinos. Producción de alimentos Bovinos genéticamente modificados para mejorar la producción láctea Agrobiotecnología Animales transgénicos Transgénesis en peces. Producción de alimentos La introducción de copias extra del gen de hormona de crecimiento aumenta notablemente la velocidad de desarrollo de truchas y salmones. Agrobiotecnología Animales transgénicos Tomado de: Devlin et al., Nature, 2001. Transgénesis en peces. Fines ornamentales Expresión de proteínas fluorescentes en peces cebra Agrobiotecnología Animales transgénicos http://www.glofish.com/photos.asp Transgénesis en peces. Modelos experimentales El uso de promotores específicos permite detectar patrones de expresión durante el desarrollo Agrobiotecnología Animales transgénicos Tomado de: Wittbrodt et al., Nat. Rev. Genet., 2002. Transgénesis en insectos: transformación de gusanos de seda Agrobiotecnología Animales transgénicos Tomado de: Tomita et al., Nat. Biotechnol., 2003. Transgénesis en insectos: mosquitos • Se está intentando producir mosquitos resistentes al parásito de la malaria. Tomado de: Catteruccia et al., Nature, 2000. Agrobiotecnología Animales transgénicos Larvas de mosquitos transgénicos (izquierde y centro) que expresan el gen de la proteína GFP. Panel de la izquierda: luz UV; panel de la derecha: luz blanca Transgénesis en aves • La expresión de proteínas en la clara de huevo tiene un enorme potencial. • La transgénesis en aves se enfrenta todavía con notables dificultades técnicas derivadas de los problemas del aislamiento de ovocitos y cigotas y el posterior cultivo embrionario. • Se ha logrado expresar enzimas en la clara del huevo y se obtuvieron quimeras que expresan genes marcadores. La heredabilidad de estos caracteres es baja. Agrobiotecnología Animales transgénicos Transgénesis en cabras La empresa Nexia (Canadá) ha logrado producir cabras que expresan fibroína (proteína de la tela de araña) en su leche. Agrobiotecnología Tomado de: Keefer et al., Biol. Reprod., 2001. Animales transgénicos Transgénesis en cerdos • Se han transformado cerdos con el gen de la Green Fluorescent Protein mediante transfección de células somáticas en cultivo y posterior clonado. • Xenotransplante: - La eliminación de genes para la alfa 1-3 galactosil transferasa permitiría obtener cerdos que no posean el residuo galactosa en su endotelio y, por lo tanto, sean menos proclives al rechazo agudo. Agrobiotecnología Animales transgénicos Universidad de Missouri-Colombia Immerge BioTherapeutics Inc Aplicaciones Producción de proteínas recombinantes humanas en la leche animal Agrobiotecnología Animales transgénicos Capacidad Capacidad de de producción producción de de proteínas proteínas recombinantes recombinantes en en la la leche leche en en distintas distintas especies especies Litros/año Proteína Cerdo 250 250 Cabra 400 400 Oveja 500 500 Vaca 10.000 10.000 Aplicaciones. Producción de fármacos Volumen Volumen del del mercado mercado mundial mundial en en proteínas proteínas humanas: humanas: -- U$S U$S 20.000 20.000 millones millones Ejemplos: Ejemplos: -- Antitrombina Antitrombina 3: 3: U$S U$S 200 200 millones millones -- Albúmina Albúmina sérica: sérica: U$S U$S 1.500 1.500 millones millones Requerimientos mundiales de proteínas humanas y número de animales transgénicos necesarios para satisfacerlo Factor VIII Alfa-1-antitripsina Factor IX Agrobiotecnología Animales transgénicos Albúmina sérica Activador tisular del plasminógeno 120 g 2 vacas 10-25 ovejas 5.000 kg 33.000 ovejas 42.000 cabras 2 kg 1000 kg 75 kg 13 ovejas 22 cerdos 300 vacas 8.300 cabras 600 cabras Aplicaciones Producción de proteínas recombinantes humanas en la leche animal 1 huevo de oro (1,3 kg) por día Vaca transgénica 2 g/L hTPA 10.000 U$S/g 30 L por día U$S 15.000/día U$S 600.000/día Agrobiotecnología Animales transgénicos Aplicaciones • El uso de animales transgénicos como bioreactores permitiría suplir la demanda de proteínas recombinantes, en particular de aquellas que requieren producción masiva. Demanda de capacidad productiva instalada (datos a nivel mundial) Agrobiotecnología Animales transgénicos Aplicaciones • Producción de proteínas recombinantes en leche de animales transgénicos: Productividad de 1 animal transgénico: 1,5 kg de proteína terapéutica/año = equivalente a 200.000 L de fermentación o sea 1 animal transgénico = 4 fermentadores de 500 L Agrobiotecnología Animales transgénicos • Demanda anual de hormona de crecimiento (hGH): - Mercado latinoamericano: producción de 2 animales transgénicos - Mercado mundial: producción de 40 animales transgénicos Referencias 1. Palma, G.A. Biotecnología de la Reproducción. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA, Argentina), 2001. 2. Hwang, W.S., Ryu, Y.J., Park, J.H., Park, E.S., Lee, E.G., Koo, J.M., Jeon, H.Y., Lee, B.C., Kang, S.K., Kim, S.J., Ahn, C., Hwang, J.H., Park, K.Y., Cibelli, J.B., Moon, S.Y. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science, 303:1669-74, 2004. 3. Cristophides, G.K. Transgenic mosquitoes and malaria transmission. Cellular Microbiology, 7:325-333, 2005. 4. Wilmut, I. Cloning for Medicine. Scientific American, 279:58-63, 1998. 5. Sitios relacionados con clonación animal: Agrobiotecnología Animales transgénicos http://ag.arizona.edu/ANS/courses/cloning2/ http://www.infigen.com/ http://www.advancedcell.com/ http://www.emtran.com/ http://gslc.genetics.utah.edu/units/cloning/whyclone
