Extraccion ADN vegetal

EXTRACCIÓN DEL ADN DE UN VEGETAL
Introducción:
La molécula de ADN (que es la que se va a extraer en ésta actividad práctica) está constituida por
dos largas cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Las dos cadenas de
nucleótidos que constituyen una molécula de ADN, se mantienen unidas entre sí porque se forman
enlaces entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que quedan apareadas.
Uno de los más importantes aportes a la biología ha sido el reconocimiento del ADN como “la
molécula de la vida”. El estudio de sus propiedades fisicoquímicas y biológicas ha desarrollado,
en menos de 50 años, un enfoque totalmente novedoso en lo referente al origen, flujo y
almacenamiento de la información genética en todo ser vivo. Debido a que en el ADN se encuentran
cifradas las instrucciones que definen las características propias de cada organismo, diversas
tecnologías y sistemas de análisis se han desarrollado para la caracterización de esta molécula.
Los resultados de tales estudios demuestran que características como la resistencia a
enfermedades, potencialidades de producción, tamaño y color de los frutos, entre otros, son debidas
a la expresión de la información genética y su interacción con el medio ambiente. La aplicación de
este conocimiento se ha convertido en una herramienta fundamental en programas de mejoramiento
genético.
Muchos estudios de Biología Molecular comienzan con la extracción de ácidos nucleicos. La lisis
celular libera las moléculas en una fase acuosa que es separada de los restos celulares por
centrifugación. Las proteínas son removidas de la fase acuosa con solventes orgánicos (fenol,
cloroformo). El ADN, que permanece en la fase acuosa, precipita junto al etanol y posteriormente
es purificado y suspendido en un buffer adecuado.
Fundamento teórico:
La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son
atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la
célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su contenido
molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón
contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras
sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán
fraccionado en cadenas más pequeñas y separadas de él por acción del detergente. Solo queda,
por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza alcohol
etílico.
Precipitación con etanol helado. El ADN es soluble en alcohol, pero se torna insoluble en presencia
de sal (NaCl) porque el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos. El etanol
formará una capa en la superficie por ser menos denso que la solución acuosa.
El zumo de piña contiene un enzima, llamada bromelina, que contribuye a eliminar las proteínas
que puedan contaminar el ADN.
Objetivo:
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Realizar la extracción del ADN de tejidos vegetales y reflexionar sobre la simpleza de su
composición con sencillas técnicas.
Observar la estructura fibrilar del ADN.
Establecer la relación entre el proceso de extracción y propiedades químico – físicas del ADN.
El objetivo de esta práctica es la extracción del material genético de un vegetal utilizando unas
sencillas técnicas, y poder observar así la estructura fibrilar del ADN.
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Material y reactivos:
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Muestra vegetal.
Agua (destilada o mineral).
Sal de mesa.
Detergente líquido o champú.
Alcohol etílico o isopropanol a O°C.
Batidora o licuadora.
Nevera o hielera.
Colador.
Tubo de ensayo.
Vaso de precipitado.
Varilla fina.
Pipeta.
Zumo de piña.
Procedimiento:
Preparar la solución tampón:
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120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral. No usar agua del grifo.
1.5 g de sal de mesa, de preferencia pura.
5 g de bicarbonato sódico.
5 ml de detergente líquido o champú.
Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre los vegetales que pueda haber en la cocina
(fresa, cebolla, ajo, tomates, etc.) y cortarla en cuadraditos.
Triturar la muestra con un poco de agua en la batidora o licuadora accionando las cuchillas a
impulsos de 10 segundos. Así se romperán muchas células y otras quedarán expuestas a la acción
del detergente. Si no se dispone de una licuadora utilizar un mortero.
Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampón frío y agitar
vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar después los restos vegetales más grandes del
caldo molecular haciéndolo pasar por un colador lo más fino posible. Lo ideal es centrifugar a baja
velocidad 5 minutos y después con la pipeta retirar el sobrenadante.
Añadimos una cucharadita de zumo de piña en dicha mezcla y dejamos unos minutos reposar.
Separar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y añadir con pipeta 10 ml de alcohol etílico
enfriado a 0ºC. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente,
teniendo éste inclinado. El alcohol quedará flotando sobre el tampón.
Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separación entre el alcohol y
el tampón. Remover la varilla hacia delante y hacia atrás y poco a poco se irán enrollando los
fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de
alcohol, con lo cual el ADN quedará adherido a su extremo con el aspecto de un copo de algodón
mojado.
NOTA: El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay
fragmentos de ARN. Una extracción «profesional» se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las
moléculas de ARN e impiden que se unan al ADN.
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Resultados de distintas extraciones:
Extracción de ADN de la cebolla.
Extracción de ADN de la col.
Cuestiones:
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¿Para que se utiliza el alcohol?
¿Para qué se utiliza el detergente?
¿Qué función tiene la sal en todo el proceso?
¿Para qué se necesita el zumo de piña?
Investiga la función que tiene la enzima llamada bromelaína o bromelina.
Describe lo que observas en la parte final de la experiencia.
Anota tus ideas acerca de cómo podría mejorarse la experiencia.
Algunas aplicaciones:
En los últimos años los constantes avances científicos y técnicos han tenido un profundo impacto
en el ámbito de la prueba. La dactiloscopia, la balística, la documentoscopia, etc., son ejemplos de
esta proyección de los conocimientos científicos en el campo policial y judicial. Los avances han
sido particularmente espectaculares en el ámbito de la Biología Molecular. En concreto, lo que se
denomina Genética Forense, consistente en el análisis genético de la diversidad humana, ha
marcado un antes y un después en la resolución de ciertos problemas judiciales. Precisamente por
ello, para reflexionar sobre los malentendidos y los problemas que plantea la prueba científica puede
ser útil tomar como referencia una de las pruebas científicas que más fiabilidad y prestigio han
alcanzado: LA PRUEBA DE POLIMORFISMOS ADN.
El rendimiento de la prueba de ADN radica en que los miles de pares de bases que se reparten de
forma secuencial y determinada para cada persona permiten seleccionar a un único individuo entre
todos los de su especie si se conoce esa secuencia. No en vano para referirse a este factor
individualizador se habla hoy de “huella genética”, pues constituye un criterio absolutamente fiable
de identificación de los individuos. La importancia de la prueba de ADN en el ámbito forense reside
en su potencial aplicabilidad para resolver muchos casos que serían difíciles de aclarar por los
procedimientos de investigación convencionales y en la elevadísima fiabilidad de sus resultados.
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El potencial de la huella genética es de tal magnitud que su uso en los tribunales se ha convertido
ya en moneda corriente. Son muchas las posibles aplicaciones forenses de la prueba, aunque los
tipos de pericias más comunes son la investigación biológica de la paternidad, la resolución de
problemas de identificación y la investigación de indicios en criminalística biológica, es decir, el
análisis de muestras biológicas de interés criminal, como manchas de sangre, saliva, esperma o
pelos.
Propuesta:
Se puede extraer el ADN de distintos frutos con distinto índice de maduración y hacer una
comparativa. También es interesante la observación al microscopio del material genético extraído,
que, aunque es a nivel molecular podría distinguirse el aspecto fibrilar del mismo.
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