GEN MARCADOR.(ES2161245)

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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k
kInt. Cl. : C12N 15/82
11 Número de publicación:
2 161 245
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51
ESPAÑA
C12N 15/54
C12N 1/21
C12N 5/10
A01H 5/00
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 94916234.1
kFecha de presentación: 11.05.1994
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 698 106
kFecha de publicación de la solicitud: 28.02.1996
T3
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k
54 Tı́tulo: Gen marcador.
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73 Titular/es: Aventis CropScience N.V.
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72 Inventor/es: Cornelissen, Marcus;
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74 Agente: Curell Suñol, Marcelino
30 Prioridad: 13.05.1993 EP 93401237
Jozef Plateaustraat 22
9000 Gent, BE
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.12.2001
ES 2 161 245 T3
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
01.12.2001
Aviso:
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k
Reynaerts, Arlette;
Gossele, Véronique y
Aarssen, Roel van
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 161 245 T3
DESCRIPCION
Gen marcador.
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La presente invención se refiere a un gen quimérico marcador seleccionable que comprende: un promotor que puede expresarse en las plantas, ADN que codifica una aminoglicósido-6’-N-acetiltransferasa
“AAC (6’)”), y una región activa de poliadenilación y de formación del extremo 3’ en las células vegetales.
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La presente invención se refiere además a un procedimiento para seleccionar o identificar células vegetales transformadas mediante la expresión del gen quimérico marcador, que codifica AAC(6’), en las
células de la planta. El gen quimérico marcador confiere, en las células de la planta, resistencia a concentraciones normalmente letales o supresoras del desarrollo de un antibiótico, que es detoxificado de forma
eficiente por el AAC (6’) en las células.
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La presente invención se refiere asimismo a una célula vegetal, transformada establemente con el gen
quimérico marcador, que codifica AAC(6’), y a una planta regenerada a partir de esta célula vegetal.
Antecedentes de la invención
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La tecnologı́a de la ingenierı́a genética vegetal ha progresado significativamente durante la década
pasada. Se ha hecho posible introducir de manera estable genes extraños en las plantas. Esto ha proporcionado oportunidades excitantes para la agricultura moderna.
La utilización de genes quiméricos marcadores seleccionables en la transformación de las células vegetales ha simplificado considerablemente la selección de células vegetales transformadas. Por ejemplo,
mediante la expresión de tal gen marcador, las células vegetales transformadas pueden hacerse resistentes
a antibióticos que son citotóxicos o que suprimen el desarrollo de las células no transformadas. Un gen
quimérico marcador utilizado habitualmente contiene la región codificante neomicı́n fosfotransferasa-II
o nptII (Bevan et al (1983) Nature 304, 184-187; Fraley et al (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80,
4803-4807). El gen nptII confiere resistencia a la kanamicina, neomicina y a los antibióticos G-418 en las
células vegetales que expresan el gen (Reynaerts et al (1987) Plant Mol. Biol. Manual, Gelvin , S. B. &
Schilperoort, R. A. (eds), Kluwer, Dordrecht, aptdo. A9, pp. 1-16).
Los genes quiméricos marcadores han contenido tı́picamente: un promotor capaz de expresarse en
las plantas, (con una región 5’ no traducida); ADN (tal como el gen nptII) que codifica un marcador
seleccionable; y una región activa de poliadenilación y formación del extremo 3’ en las células vegetales. Aunque la versatilidad del gen nptII se ha confirmado en los genes quiméricos marcadores en varios
sistemas vegetales en el curso del tiempo, han existido limitaciones en su utilización que han requerido
el desarrollo de genes alternativos de resistencia antibiótica para emplearlos en tales genes quiméricos
marcadores seleccionables (Hayford et al (1988) Plant Physiol. 86, 1216). Además, en muchas situaciones
ha resultado necesario un segundo gen complementario resistente a los antibióticos para introducirlo en
plantas que ya han sido transformadas con un gen resistente a los antibióticos. Tales genes alternativos de
resistencia a los antibióticos existen ya, pero a menudo requieren la utilización de sustancias muy tóxicas
y/o no permiten la selección eficiente en todas las especies de plantas. Ciertamente, para las especies que
son reproducibles vegetativamente de forma rutinaria, como la patata, son necesarios genes de resistencia
a los antibióticos que codifiquen distintos marcadores seleccionables, con diferentes sustratos especı́ficos,
cuando tienen que conseguirse en una planta genes diferentes en distintos tiempos.
Entre los genes conocidos de resistencia a los antibióticos, se incluyen los que codifican los enzimas que
acetilan los antibióticos aminoglicósidos (AAC), cuatro tipos de los cuales se han caracterizado (basándose
en la posición del grupo amino modificado de los aminoglicósidos derivados de la 2-desoxiestreptamina):
AAC (1), AAC (2’), AAC (3) y AAC (6’). Véase Shaw et al (1989) Antimicrob. Agents & Chemotherapy
33, 2052-2062. El análisis mediante cromatografı́a lı́quida de alta presión (HPLC) ha demostrado las
diferencias entre los productgos acetilados de estos cuatro tipos de enzimas y los perfiles de resistencia a
los aminoglicósidos, pueden utilizarse para identificar la presencia de cada uno de estos tipos de enzimas
en una cepa huésped (Shaw et al (1989) supra).
La publicación de patente europea (“EP”) 0 289 478 (Rogers et al (1988), Hayford et al (1988) supra
y Carrer et al (1991) Plant. Mol. Biol. 17, 301-303), describe la selección respecto a la gentamicina de
las plantas transformadas con un gen que codifica la aminoglicósido-3-N-acetiltransferasa (el gen “aac
(3)”). Se encontró que el gen aac (3)-IV confiere resistencia a la kanamicina (en Petunia), pero el nivel
de ésta fue sólo suficiente, como máximo, para la selección marginal (Hayford et al (1988) supra). Estas
publicaciones describen también la supertransformación del tabaco, transformado previamente con el gen
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nptII, con el gen aac(3) mediante selección sobre un medio que contiene gentamicina. EP 0 289 478
describe asimismo la utilización de gentamicina como sustrato en la transformación de petunias, soja,
semillas de aceite de colza y alfalfa transformados con el gen aac(3). Carrer et al (1991) supra describe
también la transformación de plantas del tabaco con un gen aac(3)-I, confiriendo sólo resistencia a la
gentamicina, por lo que las plantas resistentes a la gentamicina conservan su sensibilidad para la kanamicina. Según Carrer et al (1991) supra, puede resultar más ventajoso utilizar en algunos casos un gen
marcador seleccionable con una especificidad limitada de sustrato.
Los genes codificantes AAC(6’) (los “genes aac(6’)”) constituyen un tipo de genes distintos pero
relacionados que acetilan el grupo 6’ amino de varios antibióticos aminoglicósidos. Se han clonado y secuenciado varios genes bacterianos aac(6’). Según Davis (1986) en Antibiotics in Laboratory Medicine, pp.
474-489 (ed.) Lorian V., Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland; y Phillips & Shannon (1984), British
Med. Bull. 40, 28-35, AAC(6’) acetila la tobramicina, kanamicina, amilacina, neomicina, gentamicina
C1A y C2 , sisomicina y netilmicina, aunque con eficiencias distintas, dependiendo del tipo de AAC(6’).
Se han caracterizado dos subtipos de genes aac(6’) por sus perfiles de resistencia a los aminoglicósidos:
aac(6’)-I y aac-(6’)-II; el primero comprende los genes aac(6’)-IV y -4, y el otro tipo comprende el gen
aac(6’)-III (Shaw et al (1989) supra). Sin embargo, se han realizado también otras clasificaciones de estos
genes.
Otra acetiltransferasa, la fosfinotricin acetiltransferasa, se ha encontrado que también es capaz de
conferir un fenotipo seleccionable (es decir, una resistencia a herbicida) a células vegetales (De Block et
al (1987) EMBO J. 6, 2513-2518).
El documento EP 0 248 207 (Wohlleben et al,. 1987) describe un gen de resistencia a la gentamicina
que es activo en Streptomyces y puede obtenerse a partir de una cepa de S.ghanaensis mediante digestión
total con BglII.
La publicación de patente francesa 2 601 965 (Courvalin, 1988) describe un gen bifuncional que codifica las actividades AAC(6’) y APH (2”), la clonación y secuenciación de este gen, y la utilización de
partes del gen como una sonda de ADN para detectar el desarrollo de la resistencia a los antibióticos en
los cultivos bacterianos.
Sumario de la invención
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Según la presente invención, se proporciona un gen quimérico marcador seleccionable (el “gen
quimérico aac(6’)”, que comprende los siguientes elementos unidos operativamente en el mismo locus
genético: un promotor que puede expresarse en plantas; una secuencia de ADN que codifica un AAC(6’)
(el “ADN aac(6’)”), particularmente un ADN aac(6’) con la secuencia de SEC ID NO. 1, bajo el control
del promotor; y una región activa de poliadenilación y formación del extremo 3’ en las células vegetales.
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Asimismo, según la presente invención, se proporciona un procedimiento para seleccionar o identificar
las células vegetales transformadas mediante: transformación de las células con el gen quimérico aac(6’); y
poniendo entonces en contacto las células con concentraciones de un antibiótico aminoglicósido, de forma
que estas concentraciones sean letales para o supriman el desarrollo de las células no transformadas de la
planta.
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Además, según la invención, se proporciona una célula vegetal, transformada establemente con el gen
quimérico aac(6’), un cultivo de células de la planta y una planta regenerada a partir de dicha célula vegetal, y un vector de transformación de la planta, un plásmido y una cepa de Agrobacterium que contiene
el gen quimérico aac(6’).
Descripción detallada de la invención
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El término “ADN aac(6’)”, tal como se utiliza en la presente memoria, significa una secuencia codificante de ADN que codifica una proteı́na (una “AAC(6’)”) que cataliza la acetilación del grupo amino
en posición 6’ de los antibióticos aminoglicósidos. Este término incluye una secuencia de ADN parcial o
completamente sintética, ası́ como una secuencia de ADN que se encuentra de modo natural que codifica
una AAC(6’). Los ADNs aac (6’) preferidos según la presente invención, incluyen el ADN de SEC ID
No.1 y ADN sustancialmente similares, tal como los ADN aac(6’) descritos por Nobuta et al (1988),
J. Bacteriol. 170, 3769), Tolmaski (1990) Plasmid 24, 218-226 y Tran van Nhieu y Collatz (1987), J.
Bacteriol. 169, 5708. Otros ADN AAC(6’) de la presente invención incluyen los descritos por Davies y
Smith (1978), Ann. Rev. Microbiol. 32, 469-518, Morohoshi et al (1984) J. Antibiotics 37, 1687-1691,
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Tenover et al (1988) J. Bacteriol. 170, 471, Ferretti et al (1986) J. Bacteriol. 167, 631, y Shaw et al
(1989) Antimicrob. Agents and Chemotherapy 33, 2052.
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El término “gen quimérico aac(6’) tal como se utiliza en la presente memoria, significa un gen quimérico
marcador seleccionable que comprende el ADN aac(6’), unido operativamente a un promotor que puede
expresarse en una planta (incluyendo una región 5’ no traducida) y una región activa de poliadenilación y
de formación del extremo 3’ en las plantas. El ADN aac(6’) puede también expresarse como una proteı́na
de fusión en una fusión de un gen quimérico con otro ADN transformante, de modo que se potencie la
selección para el genotipo designado. La construcción de esta fusión del gen quimérico puede llevarse a
cabo según las técnicas derivadas de los procedimientos utilizados habitualmente para la construcción de
genes quiméricos que comprenden marcadores conocidos.
El término “gen marcador seleccionable” tal como se utiliza en la presente memoria, significa una
secuencia de ADN, cuya expresión en una célula vegetal confiere un fenotipo seleccionable (por ejemplo,
la resistencia a los antibióticos) para la célula vegetal.
El término “modificaciones traduccionalmente neutras” tal como se utiliza en la presente memoria,
significa modificaciones de un gen o de una secuencia de ADN que no afectan a la secuencia aminoácida
codificada por el gen o la secuencia de ADN. Ejemplos preferidos de tales modificaciones traduccionalmente neutras son cambios, mediante sustituciones nucleótidas, de codones en otros codones que codifican
los mismos aminoácidos.
El término “sustrato apropiado” o “antibiótico sustrato apropiado” tal como se utiliza en la presente
memoria, es un antibiótico aminoglicósido (por ejemplo, kanamicina) que está modificada eficientemente
por AAC(6’), por lo que la expresión del ADN aac(6’) en una célula de la planta confiere resistencia sobre
ésta al antibiótico. Por lo tanto, el término “sustrato de un AAC(6’)” tal como se utiliza en la presente
memoria, significa cualquier antibiótico aminoglicósido que pueda ser modificado, es decir, acetilado, mediante el producto del gen aac(6’).
Un ADN aac(6’) de la presente invención puede ser fácilmente aislado a partir de bacterias mediante
procedimientos de rutina, después de cultivo sobre un sustrato apropiado que contiene niveles normalmente inhibitorios de un antibiótico aminoglicósido, tal como la kanamicina, por ejemplo, tal como se
describe por Nobuta et al (1988) J. Bacteriol. 170, 3769. La actividad de AAC(6’) puede ensayarse
mediante procedimientos convencionales (Davies (1986) supra; Shaw et al (1989) supra).
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Preferentemente, un ADN aac(6’) de la presente invención se inserta en un genoma vegetal, por debajo
(es decir, 3’) de y bajo el control de un promotor que puede dirigir la expresión del gen en las células de la
planta. Promotores preferidos incluyen, pero no se limitan al promotor 35S constitutivo intenso (Odell et
al (1985) Nature 313, 810) o el promotor 35S duplicado (Kay et al (1987), Science 236, 1299) del virus del
mosaico de la coliflor; se han obtenido promotores 35S a partir de distintos aislamientos (Hull & Howell
(1987) Virology 86, 482-493). Otros promotores preferidos incluyen el promotor TR1’ y el promotor TR2’
(Velten et al (1984) EMBO J. 3, 2723). También son preferidos promotores monocotiledóneos, tales como
los promotores descritos en los documentos EP 0 342 926 o EP 0 459 643. Alternativamente, un puede
utilizarse un promotor que no es constitutivo, sino que más bien es especı́fico para uno o más tejidos u
órganos de plantas. Por ejemplo, el ADN aac(6’)puede expresarse selectivamente en los tejidos verdes de
una planta poniéndolos bajo el control de un promotor inducible por la luz tal como el promotor del gen
de la subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bisfosfato-carboxilasa, tal como se describe en el documento
EP 0 193 259. Otra alternativa consiste en utilizar un promotor cuya expresión sea inducible mediante
la temperatura o mediante factores quı́micos, o un promotor que se exprese preferentemente o selectivamente durante el perı́odo de tiempo o en el estadio de desarrollo en el cual las células son seleccionadas,
tal como un promotor especı́fico del callo, que se haya utilizado previamente con otros marcadores. En
cualquier caso, resulta evidente que para utilizar un promotor en la presente invención, debe por lo menos
permitir una expresión suficiente del ADN aac(6’) en las células de las plantas para conferir resistencia
antibiótica a éstas.
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Se prefiere que el ADN aac(6’) se inserte por encima (es decir, 5’) de señales apropiadas de regulación
de la trancripción 3’ (es decir, de señales de poliadenilación y de formación del extremo 3’ del transcrito). Las señales preferidas de regulación de la transcripción de 3’ incluyen las del gen chalcona sintasa
(Sommer & Saedler (1986) Mol. Gen. Genet. 202, 429), el virus del mosaico de la coliflor (Mogen et al
(1990), The Plant Cell 2, 1261), el gen de la octopina sintasa (Gielen et al (1984) EMBO J. 3, 835) o el
gen 7 T-ADN (Velten & Schell (1985) Nucl. Acids Res. 13, 6981).
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Según la presente invención, la totalidad o parte de un ADN aac(6’) de la presente invención puede
insertarse establemente de forma convencional en el genoma nuclear de una célula vegetal, y la célula de
la planta transformada de este modo puede utilizarse para producir una planta transgénica que muestre
resistencia a los antibióticos aminoglicósidos. A este respecto, puede utilizarse un plásmido Ti desarmado
que contiene el gen aac(6’) quimérico en Agrobacterium (por ejemplo, A. tumefaciens) para transformar
una células vegetal utilizando los procedimientos descritos, por ejemplo, en los documentos EP 0 116 718
y EP 0 270 822, publicación PCT WO 84/02913, EP 0 242 246, De Block (1988) Theor. Appl. Genet.
76 767-774, y Gould et al (1991) Plant Physiol. 95, 426 (que se incorporan a la presente memoria como
referencia). Los vectores plasmı́dicos Ti preferidos contienen el gen quimérico aac(6’) entre las secuencias
de los bordes, o al menos se localiza a la izquierda de la secuencia del borde derecho, del T-ADN del
plásmido Ti. Evidentemente pueden utilizarse otros tipos de vectores, para transformar la célula vegetal,
utilizando procedimientos tales como la transferencia génica directa (tal como se describe, por ejemplo, en
el documento EP 0 233 247) la transformación mediada por el polen (tal como se describe, por ejemplo,
en los documentos EP 0 270 356, publicación PCT WO 85/01856, y en la patente US 4.684.611, transformación mediada por virus ARN (tal como se describe, por ejemplo, en el documento EP 0 067 553 y
en la patente US 4.407.956), transformación mediada por liposomas (tal como se describe, por ejemplo,
en patente US 4.536.475) y otros procedimientos tales como los de transformación de monocotiledóneas
(por ejemplo, los cereales importantes que incluyen maı́z, arroz, trigo, cebada y centeno), tal como se
describe en la publicación PCT WO 92/09696. En el caso de que la planta que va a transformarse sea
maı́z, también pueden utilizarse otros procedimientos desarrollados recientemente, como por ejemplo, el
procedimiento descrito para ciertas progenies de maı́z por Fromm et al (1990) Bio/Tech. 8, 833, GordonKamm et al (1990) The Plant Cell 2, 603, y Gould et al (1991) supra. En el caso de que la planta que va
a transformarse sea arroz, pueden utilizarse otros procedimientos desarrollados recientemente tales como,
por ejemplo, los descritos por Shimamoto et al (1989) Nature 338, 274), Datta et al (1990) Bio/Tech. 8,
736 y Hayashimoto et al (1990) Plant Physiol. 93, 857.
Con objeto de mejorar en una planta la expresión del gen quimérico aac(6’) de la presente invención,
el ADN aac(6’) puede modificarse, por ejemplo, cambiando la utilización de sus codones naturales para
formar un equivalente artificial ADN aac(6’). Tales modificaciones pueden incluir la introducción de intrones funcionales y/o modificaciones traduccionalmente neutras en la secuencia ADN aac(6’) con objeto
de eliminar las secuencias deletéreas del ADN que se encuentran en este ADN bacteriano, tal como se
describe en la solicitud de patente PCT PCT/EP92/02547. Esto puede realizarse directamente mediante
modificación (de una forma traduccionalmente neutral) de tales secuencias deletéras del ADN, inhibiendo
la expresión en las células vegetales, o indirectamente, adaptando la utilización de los codones de ADN
aac(6’) a la preferida por la planta, por ejemplo, tal como se describe por Murray et al (1989) Nucleic
Acids Res. 17, 477. Además, para alcanzar una expresión suficiente en las plantas monocotiledóneas
tales como maı́z, puede añadirse un intrón de monocotiledónea eficientemente cortado y empalmado, por
ejemplo, el intrón 1 del gen adh del maı́z, al gen quimérico aac(6’) (Koziel et al (1993) Bio/Tech. 11,
194-200).
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Una planta transformada de la presente invención, regenerada a partir de una célula vegetal transformada con el gen quimérico aac(6’), muestra resistencia contra antibióticos sustrato apropiados, debido
a la producción de actividad AAC(6’) en sus células vegetales. Tal planta puede utilizarse según un
esquema de crı́a convencional para producir más plantas transformadas con las mismas caracterı́sticas de
resistencia a los antibióticos aminoglicósidos, o para introducir el gen quimérico aac(6’) en otras variedades de las mismas especies o relacionadas con la planta mediante técnicas estándar de crı́a. Las semillas,
que se obtienen de las plantas transformadas, contienen el gen quimérico aac(6’) como una inserción
genómica estable.
Debido a que el espectro de los antibióticos que pueden ser modificados quı́micamente mediante la
expresión del ADN aac(6’) de la presente invención es distinto del de la región codificante nptII, el ADN
aac(6’) puede utilizarse con la región codificante nptII en diferentes genes quiméricos marcadores seleccionables en los que dos genes extraños distintos se van a introducir en una planta, estando cada gen extraño
asociado con su propio gen quimérico marcador. Cuando se someten a ingenierı́a genética múltiples genes marcadores quiméricos en una planta, puede resultar ventajoso utilizar un gen quimérico aac6’) que
confiera resistencia sólo a un grupo limitado de antibióticos aminoglicósidos (Carrer et al (1991) supra).
Sin embargo, si sólo va a utilizarse un gen quimérico marcador, se prefiere utilizar un gen quimérico
aac(6’) con kanamicina como el sustrato apropiado para las células de la planta. A este respecto, el
ensayo enzimático para detectar la actividad acetiltransferasa es a menudo más rápido y más conveniente
de utilizar que el ensayo fosfotransferasa utilizado para detectar la actividad nptII.
Para ensayar la transformación exitosa de plantas con un ADN aac(6’), están disponibles diversos
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procedimientos. Por ejemplo, la resistencia antibiótica puede evaluarse en un ensayo de inducción de
un callo o en un ensayo de aplicación puntual; la presencia y la actividad de AAC(6’) también puede
analizarse mediante un ensayo enzimático; la transferencia Western puede proporcionar un fácil ensayo
inmunológico, pero es menos sensible; y la resistencia a la kanamicina puede seguirse en la progenie de
las plantas transgénicas por la siembra de semillas sobre medios que contengan kanamicina.
Los Ejemplos siguientes ilustran la presente invención. Si no se considera de otro modo en los Ejemplos, todos los procedimientos para realizar y manipular el ADN recombinante sse realizan mediante los
procedimientos estandarizados descritos en Sambrook et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual,
segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989), o en Ausubel et al., Current Protocols
in Molecular Biology, volúmenes 1 y 2, Current Protocols, USA (1994).
Listado de secuencias
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SEC ID No. 1 muestra:
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SEC
SEC
SEC
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ID
ID
ID
ID
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No.
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No.
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muestra:
muestra:
muestra:
muestra:
SEC ID No. 6 muestra:
i) la secuencia de ADN de un ADN aac(6’) que proviene de un plásmido
de Shigella, y ii), la correspondiente secuencia aminoácida codificada por el
ADN aac(6’).
la secuencia aminoácida de la proteı́na AAC(6’).
la secuencia nucleótida del iniciador PCR “RVA61”.
la secuencia nucleótida del iniciador PCR “OFD15”.
el plásmido “pTRVA3” que contiene un gen quimérico aac(6’) con un promotor 35S-2, el ADN aac(6’) de SEC ID No. 1, y la región de poliadenilación
y de formación del extremo 3’ del gen ADN-T 7.
la secuencia aminoácida de la proteı́na AAC(6’).
Ejemplos
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Ejemplo 1
Clonación de un ADN aac(6’) y construcción de un gen quimérico aac(6’)
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El ADN aac(6’) se obtuvo a partir del plásmido mini-Sa, pGV1106 (Leemans et al (1982) Gene 19,
361-364). El fragmento PvuII/HindIII de 1,5 Kb de pGV1106, que contiene el ADN aac(6’), se unió al
plásmido pGSC1600 linearizado por ScaI (Cornelissen & Vandewiele (1989), Nucl. Acids Res. 17, 19-29)
después de tratamiento con Klenow. El plásmido resultante, pFD1002A, se utilizó como una matriz para
PCR, utilizando los iniciadores RVA61 y OFD15, de la SEC ID Nos 3 y 4, respectivamente. RVA61
es complementario a la cadena no codificante del ADN aac(6’) y de sus secuencias no traducidas en
pFD1002A. El fragmento PCR SalI/BamHI aac(6’) de pFGD1002A se unió al fragmento SalI/BamHI de
7,2 Kb del plásmido pGSJ290, que contiene el gen quimérico, P35S-nptII-3’g7, para producir el plásmido
PTRVA3, de SEC ID N◦ 5.
pGSJ290 se derivó de pGV825 (Deblaere et al (1985) Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4787), en el cual
un constructo del gen quimérico P35S-nptII-3’g7 se clonó entre las repeticiones del borde del T-ADN. El
extremo 3’ no traducido del gen T-ADN 7 (es decir, 3’g7) era tal como se describió por Velten & Schell
(1985) aac(6’) supra, el gen nptII era de pKM109/90 (Reiss et al (1984) EMBO J. 3, 2217-3322), y el
promotor CaMV 35S (es decir, P35S) era un promotor 35S-2 del virus del mosaico de la coliflor, tal como
se describe en en documento EP 0 193 259 y en Gardner et al (1981) Nucl. Acids Res. 9, 2871-2888. El
constructo del gen quimérico p35S-nptII-3’g7 se clonó entre los sitios HpaI y BglII del T-ADN entre las
repeticiones de los bordes derecho e izquierdo de pGV825.
Debido a la introducción de un sitio de restricción BamHI por debajo de su sitio de iniciación de la
traducción, la secuencia ADN aac(6’) en pTRVA3, tal como se muestra en la SEC ID No 5, contenı́a los
aminoácidos Asp y Pro en las posiciones aminoácidas 2 y 3, respectivamente, y contenı́a el gen quimérico
aac(6’), P35S-aac(6’)-3’g7, incluyendo el ADN aac(6’) con la secuencia de SEC ID N◦ 1.
Ejemplo 2
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Selección de células del tabaco transformadas por aac(6’) sobre la kanamicina
Los plásmidos pTRVA3 y pGSJ290 se movilizaron de E.coli a la cepa C58C1-RifR de A. tumefaciens
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(pGV2260; Deblaere et al (1985) supra) mediante un cruce triparental, tal como se describe por Deblaere
et al (1985) supra y en el documento EP 0 193 259. Los Agrobacteria resultantes se seleccionaron sobre medio A mı́nimo (Miller (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY). Se cocultivaron células SR1 de tabaco y Petit Havana con estas Agrobacteria,
y las células del tabaco transformadas se seleccionaron utilizando la resistencia a los antibióticos, según
De Block et al (1984) EMBO J. 3, 1681-1689. Las cepas de Agrobacterium utilizadas para la infección
de los protoplastos del tabaco fueron : C58C1-RifR (pGV2260) como un control negativo, C58C1-RifR
(pGV2260::pTRVA3) que contiene el ADN aac(6’), y C58C1-RifR (pGV2260::pGSJ290) que contiene el
gen nptII. Una semana después de la infección, los protoplastos se transfirieron a medios selectivos que
contenı́an una de las siguientes concentraciones distintas de sulfato de kanamicina (Km): 0-25-50-100,
6200 µg/ml.
Siete semanas después de la infección, los callos empezaron a crecer a partir de las células cocultivadas
con C58C1-RifR (pGV2260::pTRVA 3) y C58C1-RifR (pGV2260:: pGSJ290) a todas las concentraciones
de Km. Los protoplastos infectados con pGV2260 (control negativo) formaron sólo callos en un medio sin
Km. Después de la transferencia de los callos a un medio que induce brotes que contiene 200 µg/ml de
Km, los brotes se formaron fácilmente. El análisis Southern del ADN extraı́do de las plantas del tabaco
regeneradas de las resistentes a la kanamicina, confirmó la integración estable del ADN aac(6’).
Ejemplo 3
Selección de células de patata transformadas mediante aac(6’) sobre la kanamicina
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35
Discos foliares de la variedad Yesmina de la patata se cocultivaron con cepas C58C1-RifR (pGV
2260::pTRVA3) y C58C1-RifR (pGV2260::pGSJ290) de Agrobacterium tumefaciens, que portan los genes
quiméricos del Ejemplo 2 que contienen el gen ADN aac(6’) ó el nptII, tal como se describe por De
Block (1988), supra. Los discos foliares se transfirieron al medio de inducción de los callos que contenı́a
50 µg/ml de sulfato de kanamicina. Aproximdamente un 30 % de los discos foliares que se cocultivaron
con Agrobacterium C58C1-RifR (pGV2260::pGSJ290) produjeron callos en crecimiento en presencia de
kanamicina, mientras que el 70 % de los discos foliares que se cocultivaron con Agrobacterium C58C1RifR (pGV2260::pRTVA3) produjeron callos en crecimiento después de cultivarlos durante 6 semanas en
un medio de kanamicina. Después de la transferencia de los callos transformados mediante aac(6’) al
medio que regeneraba los brotes, éstos se formaron fácilmente. Se encontró que las plantas de la patata
regeneradas conservan el fenotipo resistente a la kanamicina. El análisis Southern del ADN extraı́do de
las plantas de la patata resistentes a la kanamicina y de su progenie, confirma la integración del ADN
aac(6’).
Ejemplo 4
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Ensayo respecto a la actividad enzimática en las plantas transformadas por aac(6’)
Los callos y los tejidos foliares del tabaco del Ejemplo 2 que contenı́an el gen quimérico aac(6’),
mostraron actividad AAC(6’) cuando se ensayaron en una prueba de la (TLC)-acetiltransferasa (TLC=
cromatografı́a en capa fina) para la kanamicina. Se utilizó el ensayo de la acetiltransferasa para determinar la actividad fosfinotricin-acetiltransferásica según De Block et al (1987) EMBO J. 6, 2513-2518, con
la excepción de que se utilizó el sulfato de kanamicina como sustrato en lugar de la fosfinotricina, a una
concentración doble de la utilizada por De Block et al (supra), añadiéndose 2 µl de 14 C-acetilcoenzima
A en lugar de una mezcla que contenı́a tanto la forma radioactiva como la no radioactiva del enzima.
Después de incubación durante 30 minutos a 37◦ C, la mezcla reactiva se roció sobre placas TLC, separándose los productos de la reacción mediante cromatografı́a en 1-propanol/NH4OH (3/2). Extractos
de los callos que contenı́an el gen quimérico aac(6’) catalizaron la acetilación de la kanamicina, mientras
que no se observó reacción con extractos de callos procedentes de las plantas SR1 no transformadas y de
callos que expresaban nptII. Asimismo, se encontró que los extractos del tejido foliar de las plantas del
tabaco transformadas por aac(6’) y regeneradas, acetilaban eficientemente la kanamicina.
55
Resulta evidente que la presente invención no está limitada a las plantas del tabaco o de la patata
transformadas con el ADN aac(6’). Incluye cualquier planta, tal como tomate, algodón, semillas de colza,
alfalfa, girasol, maı́z, arroz, soja, brassica, remolacha azucarera y otros vegetales, transformados con un
ADN aac(6’).
60
La presente invención no se limita a la utilización del gen quimérico aac(6’) de la SEC ID No 5,
ni al ADN aac(6’) de la SEC ID No 1 para la transformación de las células de la planta de modo que
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5
expresen AAC(6’). Pueden utilizarse otros genes quiméricos naturales y artificiales y otro ADN. A este
respecto, las secuencias del ADN aac(6’) de las SEC ID Nos 1 y 5, pueden modificarse mediante: 1) sustitución de algunos codones por otros que codifican los mismos o distintos, preferentemente los mismos
aminoácidos, y/o 2) eliminando o añadiendo algunos codones; siempre y cuando que tales modificaciones
no alteren sustancialmente las propiedades, especialmente la capacidad para detoxificar los antibióticos
aminoglicósidos de la ACC(6’) codificada.
Todas las publicaciones a las que se alude en la presente solicitud, se incorporan a la presente memoria
como referencia.
10
Listado de secuencias
(1) INFORMACION GENERAL:
15
(i) SOLICITANTE :
(A) NOMBRE: PLANT GENETIC SYSTEMS N.V.
(B) CALLE: Plateaustraat 22
20
(C) CIUDAD: GENT
(E) PAIS: BELGICA
25
(F) CODIGO POSTAL (ZIP) : B-9000
(ii) TITULO DE LA INVENCION : GEN MARCADOR
(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 6
30
(iv) FORMA LEGIBLE DEL ORDENADOR:
(A) TIPO DE MEDIO: disco blando
35
(B) ORDENADOR: IBM PC compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentil Release #1,0, versión #1,25 (EPO)
40
(v) DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
NUMERO DE SOLICITUD: EP 93401237.8
45
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID No:1
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA :
(A) LONGITUD: 612 pares de bases
50
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE FILAMENTO: simple
55
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (sintético)
(ix) CARACTERISTICA:
60
(A) NOMBRE/CLAVE: CDS
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(B) LOCALIZACION:1..612
(D) OTRAS INFORMACIONES: /codon de comienzo=1
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(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 1
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(2) INFORMACION PARA LA SEC ID No:2
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
5
(A) LONGITUD: 203 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGIA: lineal
10
(ii) TIPO DE MOLECULA: proteı́na
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 2
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(2) INFORMACION PARA LA SEC ID No:3
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(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 54 pares de bases
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(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE FILAMENTO: simple
5
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (sintético)
(ix) CARACTERISTICA:
10
(A) NOMBRE/CLAVE:misc caracterı́stica
(B) LOCALIZACION:1..54
15
(D) OTRAS INFORMACIONES: /nota= “iniciador oligonucleótido por encima, denominado
RVA61”.
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 3
20
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID No:4
25
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 31 pares de bases
30
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE FILAMENTO:simple
(D) TOPOLOGIA: lineal
35
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (sintética)
(ix) CARACTERISTICA:
40
(A) NOMBRE/CLAVE: misc caracterı́stica
(B) LOCALIZACION:1..31
(D) OTRAS INFORMACIONES: /nota=“iniciador oligonucleótido, denominado OFD15”
45
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4
50
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID No: 5
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
55
(A) LONGITUD: 7811 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
60
(C) TIPO DE FILAMENTO: doble
(D) TOPOLOGIA: circular
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(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (sintético)
(ix) CARACTERISTICA:
5
(A) NOMBRE/CLAVE: misc recomb
(B) LOCALIZACION:1..7811
(D) OTRAS INFORMACIONES:/marca= vector pTRVA3
10
(ix) CARACTERISTICA:
(A) NOMBRE/CLAVE: misc caracterı́stica
15
(B) LOCALIZACION:194..218
(D) OTRAS INFORMACIONES: /nota= “borde derecho del T-ADN”
(ix) CARACTERISTICA:
20
(A) NOMBRE/CLAVE: misc caracterı́stica
(B) LOCALIZACION:484..684
25
(D) OTRAS INFORMACIONES: /nota= “la región de poliadenilación y formación del extremo
3’ del gen T-ADN”
(ix) CARACTERISTICA:
30
(A) NOMBRE/CLAVE:CDS
(B) LOCALIZACION:complemento (729..1340)
(D) OTRAS INFORMACIONES: /nota= “la secuencia codificante aac(6’)”
35
(ix) CARACTERISTICA:
(A) NOMBRE/CLAVE: promotor
40
(B) LOCALIZACION:1341..1756
(D) OTRAS INFORMACIONES: /marca= promotor 35S
(ix) CARACTERISTICA:
45
(A) NOMBRE/CLAVE: misc caracterı́stica
(B) LOCALIZACION:3001..3023
50
(D) OTRAS INFORMACIONES: /nota= “secuencias del borde izquierdo del T-ADN”.
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID No 5
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(2) INFORMACION PARA LA SEC ID No: 6
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 203 aminoácidos
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(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGIA: lineal
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(ii) TIPO DE MOLECULA: proteı́na
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6
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REIVINDICACIONES
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1. Gen quimérico marcador seleccionable para transformar una célula vegetal o planta, con el fin
de hacerla resistente a un antibiótico aminoglicósido; el cual gen marcador comprende los siguientes
fragmentos de ADN unidos operativamente:
a) un promotor que puede expresarse en plantas;
10
b) un ADN que codifica una aminoglicósido-6’-N-acetiltransferasa capaz de modificar dicho antibiótico
aminoglicósido; y
c) una región activa de poliadenilación y formación del extremo 3’ en las células vegetales;
y en el que dicha aminoglicósido-6’-N-acetiltransferasa es capaz de acetilar por lo menos la kanamicina.
15
2. Gen quimérico marcador seleccionable según la reivindicación 1, en el que dicho ADN que codifica una aminoglicósido-6’-N-acetiltransferasa puede obtenerse mediante amplificación PCR, utilizando
iniciadores en los que por lo menos uno de ellos posea la secuencia ADN de la SEC ID No 3 o de la SEC
ID No 4.
20
3. Gen quimérico marcador seleccionable según la reivindicación 2, en el que dicho ADN que codifica
una aminoglicósido-6’-N-acetiltransferasa posee la secuencia ADN de la SEC ID No. 1.
25
4. Gen quimérico marcador seleccionable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que
dicha aminoglicósido-6’-N-acetiltransferasa posee la secuencia aminoácida de la SEC ID No. 2.
5. Gen quimérico marcador seleccionable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el cual está
integrado en el ADN nuclear de una célula vegetal.
30
6. Vector de transformación de una planta que contiene el gen quimérico marcador seleccionable según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Vector de transformación de la planta según la reivindicación 6, el cual es un plásmido Ti.
35
8. Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector según la reivindicación 7.
9. Célula vegetal, cuyo ADN nuclear contiene el gen quimérico marcador seleccionable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
40
10. Cultivo de células vegetales, que comprende diversas células vegetales según la reivindicación 9.
11. Semilla que comprende el gen quimérico marcador seleccionable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
45
12. Planta que comprende el gen quimérico marcador seleccionable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
13. Procedimiento para seleccionar o identificar las células transformadas de una planta, utilizando
un antibiótico aminoglicósido, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
50
55
transformar las células de la planta con un ADN extraño que comprende el gen quimérico marcador seleccionable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y a continuación dejar crecer a
dichas células transformadas en concentraciones de dicho antibiótico aminoglicósido que son letales
o supresoras del crecimiento para las células no transformadas.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho antibiótico aminoglicósido es kanamicina.
60
15. Procedimiento para hacer que una célula vegetal sea resistente a un antibiótico aminoglicósido;
comprendiendo dicho procedimiento la etapa de transformación del ADN nuclear de dicha célula con el
gen quimérico marcador seleccionable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
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16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho antibiótico aminoglicósido es kanamicina.
5
17. Procedimiento para detoxificar un antibiótico aminoglicósido en una célula vegetal; comprendiendo
dicho procedimiento la etapa de proporcionar el gen quimérico marcador seleccionable según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, al ADN nuclear de la célula.
18. Utilización del gen quimérico marcador seleccionable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4, para producir una aminoglicósido-6’-N-acetiltransferasa en las células de una planta.
10
19. Utilización del gen quimérico marcador seleccionable según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 4, para hacer que una célula vegetal o una planta se convierta en resistente a un antibiótico aminoglicósido.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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