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SVANOVIR® BVDV-Ab Kit
Test de ELISA para la detección de anticuerpos contra la Diarrea Vírica Bovina
(BVDV) en suero y leche.
INFORMACIÓN GENERAL
El virus de la Diarrea Vírica Bovina (BVDV) es un pestivirus asociado con un rango de
enfermedades que afectan al tracto digestivo del ganado bovino. Los signos clínicos de
la enfermedad incluyen paresia, diarrea y reducción en la producción de leche, la
enfermedad cursa con una alta morbilidad y baja mortalidad, lo cual conlleva elevadas
pérdidas económicas.
En animales gestantes el virus tiene la capacidad de atravesar la barrera transplacentaria
provocando infección fetal con el resultado final de abortos, momificación, nacimientos
prematuros ó anomalías en el recién nacido. Sin embargo en algunos casos los animales
recién nacidos, si son inmunotolerantes al virus, no presentan síntomas clínicos, de
manera que quedan persistentemente infectados y son un foco de transmisión de la
enfermedad.
En animales jóvenes la infección puede cursar de forma aguda, en estos casos el virus
afecta principalmente a la mucosa nasal y digestiva, en ésta situación la enfermedad
cursa con una alta mortalidad y baja morbilidad provocando erosiones extensivas sobre
la mucosa oral y gastrointestinal. La Diarrea Vírica Bovina (BVDV) a menudo produce
inmunosupresión favoreciendo infecciones bacterianas secundarias en los animales
afectados.
PRINCIPIO DE TRABAJO
SVANOVIR® BVDV-Ab está diseñado para detectar Anticuerpos específicos contra el
virus de la Diarrea Vírica Bovina en muestras de suero y/o leche de animales infectados.
El test se basa en la técnica del enzima-inmuno ensayo (ELISA) indirecto en fase
sólida.
El ensayo consiste en que las muestras problema son expuestas al antígeno (BVDV) no
infeccioso que se encuentra tapizando las placas microtiter. Si la muestra problema
contiene anticuerpos contra el virus se unirán al antígeno en el pocillo. Al añadir el
Conjugado éste formará un complejo con los anticuerpos anti BVDV. La aparición de
color en el pocillo se debe a la conversión del sustrato por el conjugado. La densidad
óptica (OD) es medida en un fotómetro para microtiter a 450 nm.
Oficina Central Calle José Echegaray 8 – P.A.E Casablanca I, local 1-3 – 28100 Alcobendas. Madrid.
España – Teléfono: 902 103 578 – Fax: 902 102 459 – e-mail: ventas @tdi.es
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FORMATO DEL KIT
SVANOVIR® BVDV-Ab contiene todos los reactivos y controles necesarios para la
realización del ensayo.
Existiendo en la actualidad dos formatos del Test.
1.- Artículo numero: 10-2200-02
Test de 2 placas microtiter.
Número de muestras: 96
2.- Artículo numero: 10-2200-10
Test de 10 placas microtiter.
Número de muestras: 480
CONTENIDO DEL KIT
Placas microtiter tapizadas con el antígeno BVDV inactivado y con el control de
antígeno. Columnas impares tapizadas con el antígeno y columnas pares tapizadas con
el control de antígeno.
HRP Conjugado Liofilizado
(Horseradish Preoxidase Conjugated Anti-Bovine IgG). Listo para usar !
20x PBS-Tween
Solución Sustrato (Tetramethylbenzidine conteniendo H2O2). Mantener en oscuridad !
Solución de Frenado (Contiene ácido sulfúrico). Corrosivo !
A.
B.
C.
D.
Control Positivo de Suero-0,005% Mertiolato.
Control Negativo de Suero-0,005% Mertiolato.
Control Positivo de Leche-0,005% Mertiolato.
Control Negativo de Leche-0,005% Mertiolato.
Área de la aplicación:
Diagnóstico así como programas de erradicación de la Diarrea Vírica Bovina (BVDV).
Screening / Confirmación para muestras de suero o de leche.
Características:
ELISA indirecto.
Rápido (menos que tres horas)
Ensayo adaptado para muestras de suero así como muestras individuales de leche o
tanques de leche.
Sensibilidad relativa: 100 % (Relativa a SNT)
Especificidad relativa: 89,2 %.(Relativa a SNT)
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Sensibilidad en muestras de Leche: 95,2 %
Especificidad en muestras de Leche: 100 %
Material Necesario no suministrado:
1.- Micropipetas. (4-200µl)
2.- Tips.
3.- Agua Destilada.
4.- Contenedor de 1ó 2 litros de capacidad para preparar PBS-Tween.
5.- Fotómetro para placas microtiter con filtro de 450 nm.
MUESTRAS
Suero.- 4 µl. de suero sanguíneo o plasma por pocillo. Las muestras puede ser suero o
plasma fresco, refrigerado o previamente congelado.
Leche.- 100 µl. de leche por pocillo. Las muestras de leche deben ser previamente
centrifugadas 15 minutos a 2000 x g para extraer la fase lipídica.
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
PBS-Tween.
Diluir la solución 20X de PBS a una concentración 1/20 en agua destilada.
Preparar 500 ml. por placa diluyendo 25 ml en 475 ml de agua destilada.
Asegurarse de que no se han formado cristales de precipitado en el fondo, en tal caso
calentar la solución con agitación.
Solución mAb
Reconstituir la solución liofilizada del Conjugado HRP en 10,5 ml de Buffer PBSTween, añadiendo el buffer lentamente, dejar la solución un minuto antes de mezclarla,
agitar lo suficiente para obtener una mezcla homogénea. Preparar inmediatamente antes
de usar.
PRECAUCIONES
1.- Leer detenidamente todas las instrucciones del Kit antes de ser utilizado.
2.- Mantener el Kit y sus componentes entre + 2º C y + 8º C.
3.- Todos los reactivos deben ser preparados a temperatura ambiente: 18-25º C.
4.- No mezclar componentes, reactivos o libros de instrucciones entre distintos Kits.
5.- Evitar cualquier tipo de contaminación al preparar los reactivos.
6.- Antes de proceder con el ensayo, revisar la fecha de caducidad.
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7.- Utilizar tips distintos para cada muestra a ensayar.
8.- Incluir en todos los ensayos controles positivos, negativos y los respectivos controles
en muestras de leche. Se recomienda incluir duplicados de los controles.
9.- Usar siempre agua destilada para preparar los reactivos.
10.- La solución de frenado contiene ácido sulfúrico y es corrosivo, usar guantes.
PROCEDIMIENTO
1.- Todos los reactivos deben ser preparados a temperatura ambiente: 18-25º C antes de
ser usados.
2.- Muestras de Suero:
A. Añadir 100 µl. de PBS-Tween a cada pocillo que va a ser usado y a los pocillos
asignados como controles.
B. Añadir 4 µl. del control Positivo para Suero (Ractivo A) y 4 µl. de control
Negativo para Suero (Reactivo B) respectivamente, a los pocillos seleccionados
para los controles y a los pocillos correspondientes con el control de antígeno.
Se recomienda poner duplicados de los controles.
C. Añadir 4 µl. de muestra de suero a cada pocillo tapizado con el antígeno y al
pocillo correspondiente tapizado con el control de antígeno. Se recomienda
poner duplicados de las muestras.
3.- Muestras de Leche:
A. Añadir 100 µl. del control Positivo para Leche (Reactivo C) y 100 µl. de control
Negativo para Leche (Reactivo D) respectivamente, a los pocillos seleccionados
para los controles y a los pocillos correspondientes con el control de antígeno.
Se recomienda poner duplicados de los controles.
B. Añadir 100 µl. de cada muestra de leche a cada pocillo previamente
seleccionado, tapizado con el antígeno y al pocillo correspondiente tapizado con
el control de antígeno. Se recomienda poner duplicados de las muestras.
4.- Agitar la placa suavemente a temperatura ambiente, para asegurar una mezcla
homogénea en los pocillos de la placa. Incubar a 37º C durante una hora.
5.- Lavar los pocillos tres veces con PBS-Teewn.
6.- Añadir 100 µl de Conjugado en cada pocillo. Agitar e incubar a 37º C durante 60
minutos.
7.- Lavar tres veces cada pocillo con PBS-Teewn.
8.- Añadir 100 µl Solución Sustrato a cada pocillo e incubar 10 minutos a temperatura
ambiente (+18-25ºC).
9.- Parar la reacción añadiendo 50 µl de Solución de Frenado a cada pocillo, agitar la
placa. Añadir la Solución de Frenado en el mismo orden que la solución Sustrato.
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10.- Medir la densidad óptica (OD) en un fotómetro para placas microtiter a 450 nm
(usar una placa vacia como el control blanco). Se recomienda medir las OD quince
minutos después de añadir la solución de frenado para evitar fluctuaciones en los
valores.
CÁLCULOS
Todos los valores OD de los controles y de las muestras deben ser corregidos con el
valor de OD del correspondiente control de antígeno de la siguiente forma:
ODBVDV - OD CONTROL = VALOR CORREGIDO
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Muestras de Suero
Se consideran muestras positivas si el valor corregido de OD es 2 veces mayor que el
valor OD corregido del Control Negativo. Muestras con un valor OD corregido menor
que 0,25 son consideradas negativas.
Para validar el test el Suero Control Positivo debe tener un valor de OD mayor que 1,0 y
el Suero Control Negativo debe tener un valor de OD menor que 0,15. Si el test es
invalidado el ensayo debe repetirse.
Muestras de Leche
Se consideran muestras de leche positivas si el valor corregido de OD es 2 veces mayor
que el valor OD corregido del Control Negativo. Muestras con un valor OD corregido
menor que 0,1 son consideradas negativas.
Para validar el test el Suero Control Positivo debe tener un valor de OD mayor que 1,0 y
el Suero Control Negativo debe tener un valor de OD menor que 0,1. Si el test es
invalidado el ensayo debe repetirse.
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