PROCEDIMIENTO MUESTREO MICROBIOLÓGICO DE AIRE DRA

PROCEDIMIENTO
MUESTREO MICROBIOLÓGICO DE AIRE
DRA. MARÍA TERESA VALENZUELA BRAVO
DIRECTORA
INSTITUTO DE SALUD PÚBLICA DE CHILE
Departamento de Salud Ocupacional
Fecha
-1-
Subdepto. Higiene y Seguridad Industrial
1.-
JUSTIFICACIÓN
Los microorganismos presentes en el aire son un riesgo potencial de contaminación de materias
primas, productos semi terminados, de procesos, de pacientes, y personal que trabaja en áreas
que requieran calidad de aire controlado.
2.-
OBJETIVO
Describir el procedimiento de muestreo microbiológico de aire en áreas biolimpias, salas
blancas, y/o de contaminación controlada, utilizando el equipo MAS – 100 NT™
3.-
CAMPO DE APLICACIÓN
Aplica para los muestreos microbiológicos del aire con recuento de microorganismos aeróbicos,
y hongos o levaduras, en cabinas de seguridad biológicas, áreas biolimpias, salas blancas, y/o
de contaminación controlada.
4.-
TERMINOLOGÍA
Agar: El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de
cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a
40 ºC. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es
atacado por aquellas que crecen en él.
Aire Limpio: es aquél libre de partículas sucias y de microorganismos. Existe una serie de
tratamientos para obtener aire libre de contaminantes.
- El aire de entrada atraviesa un prefiltro (retiene partículas grandes); luego pasa por un
precipitador electrostático (atracción de partículas cargadas eléctricamente); luego
atraviesa un filtro HEPA (retiene microorganismos y partículas en suspensión en el aire
de tamaño superior a 0,3 micrones).
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-
El otro tratamiento es el sistema Kathabar (combustión de superficie) el cual limpia el
aire de entrada por lavado con una solución aséptica y además controla la humedad. El
aire limpio y aséptico se introduce al área aséptica y se mantiene bajo presión positiva.
Área Biolimpia: Se llama área de contaminación controlada o área biolimpia o zona limpia a
aquella área o espacio delimitado en el cual la contaminación ambiental, en términos de
partículas y de microorganismos, así como la carga microbiana en las superficies (murallas,
cielos, pisos, equipos) y la carga microbiana sobre el personal (máscaras, gorros, delantales,
cubre calzados, guantes) se encuentran dentro de los límites especificados para ella.
Colonia: Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un substrato sólido, el
resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia.
Corte de partículas (d50): es el diámetro de las partículas, donde el 50% de las partículas
llegan al agar (es decir pueden formar una colonia). Está determinado por la velocidad de
retención y el tamaño y forma del orificio.
Estufa de Incubación: Es un equipo utilizado en los laboratorios, para incubar los medios de
cultivo en un ambiente de temperatura controlados. Utiliza una resistencia eléctrica que genera
calor al interior de una cámara a manera de un horno. La temperatura generada es controlada
por un termostato. La temperatura a la que se realice este proceso condiciona críticamente la
calidad del medio. Estufa con aire forzado con doble puerta, una de vidrio interna y otra externa,
con termostato preciso y un sistema de circulación interna del calor, son una buena alternativa.
El equipo debe tener:
-Selector de temperatura. Un termostato que mantenga la temperatura en el rango de 0-100 °C,
con una precisión de ± 1 °C o mayor.
-Termómetro preciso, preferentemente con indicador externo que permita controlar la
temperatura interior del equipo sin abrirlo.
Filtros de Alta Eficiencia: Estos filtros denominados HEPA y ULPA por sus iniciales en inglés
(High Efficiency Particulate Air y Ultra Low Penetration Air), son los filtros mas eficientes
conocidos por el hombre, retienen el 99.97 y el 99.999% respectivamente, de partículas tan
pequeñas como 0.3 micrones y fueron desarrollados por la Comisión Atómica de los EE.UU.
durante la segunda guerra mundial, para remover el polvo radioactivo de los ductos de
ventilación de las plantas atómicas. Estos filtros se componen de fibras, compuestas por fibra
de vidrio y con diámetros entre 0.2 y 0.5 micrones, entrelazadas de forma aleatoria y
espaciadas entre sí más de 0.3 µm.
Los filtros HEPA y ULPA evitan la propagación de bacterias y virus a través del aire y, por tanto,
son muy importantes para prevenir infecciones.
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ISO 14698:2003: Establece los principios y la metodología básica de un sistema formal de
control de la contaminación biológica para evaluar y controlar biocontaminantes, cuando la
tecnología de salas blancas se aplica a tal efecto. En él se especifican los métodos requeridos
para vigilancia de las zonas de riesgo en una forma coherente y de aplicación de las medidas
de control adecuadas para el nivel de riesgo. En las zonas donde el riesgo es bajo, puede ser
utilizado para obtener información.
Medios de Cultivos: El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio
de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan
adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son:
temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuada, así como un grado correcto de
acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para
un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el
mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 32,5 ± 2,5ºC para el
caso de aerobios y 22,5 ± 2,5ºC para hongos y levaduras, con tiempos de incubación de 48 y
72 horas respectivamente, proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la
humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.
Unidad Formadora de Colonia (UFC): Se denomina a una célula bacteriana viva y aislada que
si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la producción
de una colonia en un breve lapso de tiempo.
En el caso de los hongos filamentosos que tienen un crecimiento trófico no se producen
colonias aisladas sino formaciones más difusas o miceliares.
Velocidad de retención: Es la velocidad de la partícula cuando llega al agar. Viene
determinada por la velocidad del flujo, el número de orificios y el diámetro del orificio.
5.-
PROCEDIMIENTO
El equipo MAS-100 NT™ es un instrumento de alto rendimiento que está basado en el principio
de muestreador de aire Andersen, el cual aspira aire a través de una placa perforada. El flujo de
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aire resultante es dirigido sobre una placa estándar de agar. Después del ciclo de colección, la
placa Petri es incubada y las unidades formadoras de colonias (UFC) son contadas. El MAS
100 NT™ opera con un dispositivo de succión de alto rendimiento y el volumen aspirado es
continuamente monitoreado. El sistema mide el flujo de aire que ingresa y regula el volumen
aspirado a un valor constante estándar de 100 litros por minuto. Este equipo regula
automáticamente el volumen de acuerdo a la presión y temperatura ambiental arrojando
resultados comparables de forma constante. Para mediciones en área biolimpias y/o de
contaminación controlada, el volumen de muestra recomendado de acuerdo a parámetros
internacionales debe ser de 1000 litros.
Entrada de aire
Placa Petri
Anemómetro
Ventilador
Salida de Aire
5.1.-
Metodología
5.1.1.- Materiales, Insumos y Equipos:
Estufa de Cultivo: Marca JOUAN. Nº Inventario 01683. 32,5 ± 2,5ºC. Ubicada en el Laboratorio
Nacional de Control del Depto. Control Nacional.
Estufa de Cultivo: Marca NAPCO. Nº Inventario 16148. 22,5 ± 2,5ºC. Ubicada en el
Laboratorio Nacional de Control del Depto. Control Nacional.
Placas Petri estériles: estándares con un diámetro de 90 mm. Se pueden usar para determinar
de forma activa los microbios en suspensión en el aire con el sistema MAS-100™. Como estas
placas tienen una triple cobertura y están irradiadas con rayos gamma, ofrecen un alto grado de
fiabilidad para usarse en aisladores y salas blancas, y se pueden almacenar en las
instalaciones a temperatura ambiente. Vida útil de hasta 9 meses.
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Agar Soya Tripticase: Medio de cultivo libre de inhibidores e indicadores, contiene digerido
pacreático de caseina, digerido papaínico de harina de soja, cloruro de sodio y agar.
Incubación : 2 días a 32,5 ±2,5 ºC
Características del medio: medio deshidratado, fino, homogéneo, libre de material extraño.
Color beige claro.
Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
Agar Saboraud: Medio utilizado para el aislamiento, identificación y conservación de hongos
patógenos y saprófitos. En el medio de cultivo, la pluripeptona y la glucosa, son los nutrientes
para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de
cloranfenicol y el pH ácido, favorecen el crecimiento de hongos por sobre el de bacterias.
Además, al medio de cultivo, pueden agregarse otros agentes selectivos de crecimiento.
Incubación: 5 a 7 días, 22,5 ±2,5 ºC.
Características del medio: Medio preparado: ámbar claro, ligeramente opalescente sin
ningún precipitado.
Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
Equipo muestreador microbiológico de aire MAS – 100 NT™:
Especificaciones Técnicas:
Velocidad de Flujo: 100 litros por minuto ± 2,5 %
Volúmenes de muestreo estándares: 50, 100, 250, 500, 1000 litros.
Volúmenes de muestreo elegidos libremente: 1 a 2000 litros.
Cabezal de muestreo:
Diámetro: 10,9 cm
Peso: 190 gramos
Material: aluminio anodizado
Autoclavable: 15 minutos a 121 ºC
MAS – 100 NT™:
Altura: 26 cm
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Diámetro: 11 cm
Peso: 2,38 Kg
Maleta de transporte: Plástico
Información Adicional:
Tornillo del trípode: para uso con tornillo normal de cámara.
Paquete de Baterías: Li-Ion
Motor: 6 V
Cargador de Baterías: 110-240 Volt, 1,5 A 50-60 Hz
Tiempo de carga: tiempo total aproximado de 3,5 horas.
Tiempo de Operación: Total aproximado de 7 horas.
Volumen total de aspiración: aproximado de 42000 litros
Pantalla: Gráfica alfanumérica.
Vida media de las baterías: aproximadamente 10 años.
Condiciones Ambientales:
Altitud: Hasta 2000 m o superior.
Temperatura: -20 ºC a 40 ºC
Humedad Relativa Máxima: 80% para temperatura de hasta 31ºC, disminuyendo
linealmente a 50% de humedad relativa a 40 ºC.
Fuente de Voltaje Principal: Fluctuaciones no deben exceder ± 10% de voltaje nominal.
Componentes Incluidos:
Maleta de traslado
Cargador de baterías y enchufes
Cable de conexión USB de 1,5 m
CD con PC-Software y Manual de Usuario, USB Driver y certificado en Excel para manual
de ajuste y calibraciónLlave de Allen
Cuidados y Mantención:
Debe ser calibrado en forma periódica.
La tapa perforada y la tapa cubre polvo son autoclavables a 121 ºC por 15 minutos.
Asegurarse que los orificios de la tapa perforada no estén tapados.
La suciedad puede ser removida del exterior del MAS-100 NT™ usando un paño
humedecido con mezcla de alcohol/agua al 70% o una solución isopropanol/agua. El
exterior del equipo también puede ser limpiado con una solución alcohol/agua. Evitar
derramar líquido sobre las conexiones eléctricas/electrónicas.
La desinfección de las partes internas del equipo puede ser realizada en un gabinete de
flujo laminar con una solución de etanol al 70% o isopropanol. Dejar que el instrumento
complete al menos 2 ciclos de 100 litros cada uno en el gabinete de flujo laminar. Al
comienzo de cada ciclo, rociar con una solución de etanol al 70% o isopropanol frente a la
cabeza del muestreador con la tapa perforada instalada. Secar el equipo con una toalla
estéril y usar una bolsa plástica para guardar o transportar al área de muestreo. No se
recomienda el uso de gases para la desinfección del equipo.
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Certificado de Calibración y Trazabilidad: Originalmente son calibrados con el anemómetro
DA-100 NT en la SCS (Swiss Calibration Service), que es uno de los servicios autorizados por
la EA Multilateral Agreement (Acuerdos Multilaterales) de reconocimiento de certificados de
calibración.
Tapa perforada: de 300 * 0,6 mm orificios diseñada para placas Petri estándares mejorando la
velocidad de impactación < 20 m/s, anodizada de color azul. Debe ser autoclavada a 121ºC * 15
minutos, para ser esterilizada en autoclave, antes de su uso.
5.1.2.- Desarrollo:
Revisar la carga del equipo. La señal de la batería tiene 4 niveles. Si la señal de la batería
está enteramente de color negro, significa completamente cargada. Cuando la carga de la
batería disminuye, la señal de la batería se muestra transparente. Cuando la transparencia en la
señal de la batería alcanza ¾, la batería debería ser recargada, conectando el cargador a la
corriente y al equipo. Asegurarse que el punto rojo del cargador se enfrente con el punto negro
del brazo del equipo.
Instalación de la Placa de cultivo: Para el primer ciclo se utiliza el agar nutritivo y para el
segundo el agar Saboraud, de la manera siguiente:
Girar la tapa, abrir, e instalar la
placa Petri destapada. Tapar,
y girar para fijar.
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Encendido del MAS-100 NT™: Presionar ambas teclas a la vez ubicadas bajo la pantalla
(START y MENU) durante 2 segundos, hasta que el LED azul (run) se encienda. El programa
ya programado se iniciará.
run
Stop
Programa del proceso de muestreo seleccionado: Se debe elegir el Modo Estándar (STD)
presionando las teclas con las figuras ▲▼ si es necesario.
En la parte superior aparece la fecha y la hora, y en el centro el Programa (Mode) que
corresponde al estándar (STD) y el Volumen (Volume) a muestrear (1000 l).
00.00.2010 00:00
Mode:
STD
Volume:
1000 l
START
Estado de la carga
MENU
Enseguida se presiona START, y comienza el muestreo. Se puede observar el tiempo en la
parte superior indicando el volumen de aire muestreado y el tiempo ocurrido.
Measuring
Volume:
Time rem:
State:
Abort
Presionar si se desea
detener el ciclo
Una vez terminado el ciclo de 10 minutos, retirar la placa Petri con medio de cultivo nutritivo,
tapar, dar vueltas rotular y guardar para incubación. El mismo procedimiento para la placa de
cultivo con agar saboraud para hongos y levaduras.
Apagado: Se debe presionar “Menu”, seleccione “Shut Down” y presionar “select” nuevamente,
aparecerá en la pantalla la consulta “Shut down device?”, presione “ok” y el instrumento se
apagará. Si no hay modificaciones futuras en el instrumento y no se realiza otro muestreo, éste
se apagará automáticamente después de 5 minutos.
Posteriormente se procede a incubar las placas de cultivo en las estufas a las temperaturas
correspondientes.
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5.2.-
Cálculo de resultados:
El número total de microorganismos contados (U.F.C.), se modifica basado en la tabla de
corrección estadística de Feller`s, para convertirlas a partículas contaminantes por metro
cúbico. La Tabla de corrección (Anexo Nº 1) está basada en la posibilidad que varios
microorganismos entren por el mismo orificio en la tapa perforada a medida que existan más
microorganismos en el ambiente a muestrear.
Pr = es el número esperado de partículas viables para producir r orificios positivos.
N = es el número total de orificios de la placa (300)
Una mejor alternativa de cálculo es la siguiente:
N  0 .5
Pr  N

X
1
dX  N ln(( N  0 . 5 ) /( N  r  0 . 5 ))
N  r  0 .5
Donde: r es el número de colonias bacterianas en la placa del instrumento de muestreo.
N es el total de orificios de la tapa, a través de la cual se dispara el aire del área que se
muestrea, en dirección a la Petri con el medio de cultivo.
Los números de orificios suelen ser: 200, 300, 400.
Ejemplo: N= 300
r= 150 colonias
Pr  300 * ln(( 300  0 . 5 ) /( 300  150  0 . 5 ))  207 . 4
La tabla de Feller da el valor: 207 lo cual es obviamente un resultado de redondeo de cifras
pues, como las partículas bacterianas no constituyen una variable continua sino Poissoniana, es
prácticamente imposible que salgan resultados enteros.
5.3.-
Control de Calidad
Se realiza a través de la certificación del equipo, y el control de temperatura de las estufas de
incubación (registros).
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7.-
REFERENCIAS

Feller, Williams (1950) “An introduction to probability theory and its applications” third
edition. Volume I .A Wiley International Edition.

ISO 14698-1: Áreas Limpias y ambientes controlados asociados- Control de
biocontaminantes. Parte 1: Principios y métodos generales.

ISO 14698-2: Áreas Limpias y ambientes controlados asociados- Control de
biocontaminantes. Parte 2: Evaluación e interpretación de los datos de
biocontaminación.

MBV AG. Microbiology and Bioanalytic. Manual de Usuario. MAS-100 NT™
Muestreador Microbiológico de Aire. www.mbv.ch

Microbiological Evaluation of Clean Rooms and other Controlled Environments. USP
29 (1116).

Ministerio de Salud. Norma General Técnica Nº 59. Manipulación de Medicamentos
Estériles en Farmacias de Hospitales. Chile. 2001.

The Journal of American Medical Association. JAMA®. Secondary Aerosolization of
Viable Bacillus anthracis Spores in a Contaminated US Senate Office. Vol 288 Nº 22.
Diciembre 11, 2002.
PARTICIPANTES:
MSc. Ing. Edith Rodríguez Alfaro
8.-
ANEXOS:
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ANEXO Nº 1: Tabla de conversión de Feller para Tapa del orificio.
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ANEXO Nº 2: Vestimenta de Protección Personal: Considera Elementos de Protección
Personal y Ropa de Trabajo, destinados a proteger al trabajador de riesgos laborales, utilizados
con un enfoque preventivo y de adaptación a los riesgos y a los factores personales de los/as
trabajadores/as. Forman parte de las barreras primarias. Se requiere el uso de:
 Antiparras/Gafas: si se trabaja fuera de la Cabina de Seguridad Biológica.
 Barbijos: si existe barba.
 Cubrepelo desechable (opcional, pues si se usa traje Tyvek, no requiere)
 Guantes de látex: No deben utilizarse guantes delgados de cloruro de polivinilo (PVC),
puesto que son permeables a ciertos preparados, ni tampoco guantes empolvados ya
que atraen las partículas de citostáticos.
 Cubrecalzado desechable.
 Mascarilla de alta eficiencia: La protección respiratoria personal (respiradores) es la
última línea de defensa para el personal de salud contra la infección nosocomial.
Resistente a la humedad, protege contra partículas sólidas y líquidas. De forma
convexa, posee una lámina metálica de aluminio para ajuste nasal y elástico, o doble
elástico para ajuste al rostro. Las conocidas mascarillas tipo "cirujano" no ofrecen
protección alguna. La máscara, ya sea media máscara o máscara facial, puede
resultar útil en caso de muestreos de áreas con contaminantes químicos.
Mascarilla con Filtro de Alta
Eficiencia (HEPA) ó Máscara
o Respirador según agente
de riesgo
Traje Tipo Tyvek con
Cubrecabello
Cubrecalzado
Guantes látex
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