gen de resistencia a una enfermedad del maiz utilizado como

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
2 129 626
kInt. Cl. : C12N 15/53, C12N 15/82
11 Número de publicación:
6
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ESPAÑA
C12N 15/29, C12N 5/10
C12N 1/21, A01H 4/00
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 94904441.6
kFecha de presentación : 14.12.93
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 674 713
kFecha de publicación de la solicitud: 04.10.95
T3
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k
54 Tı́tulo: Gen de resistencia a una enfermedad del maı́z utilizado como marcador seleccionable.
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73 Titular/es: PIONEER HI-BRED
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72 Inventor/es: Briggs, Steven P. y
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74 Agente: Ungrı́a López, Javier
30 Prioridad: 15.12.92 US 995658
INTERNATIONAL, INC.
800 Capital Square, 400 Locust Street
Des Moines, Iowa 50309, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.06.99
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 129 626 T3
16.06.99
Aviso:
k
k
Johal, Gurmukh S.
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 129 626 T3
DESCRIPCION
Gen de resistencia a una enfermedad del maı́z utilizado como marcador seleccionable.
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Campo técnico
Esta invención se refiere al aislamiento de un gen que controla la resistencia a un hongo y a una toxina
de una enfermedad fúngica y a su utilización como marcador seleccionable.
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Antecedentes de la invención
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Los genes de resistencia a enfermedades se definen como factores Mendelianos que cosegregan con el
rasgo de resistencia. El gen HM1, que controla la resistencia a Cochliobolus carbonum estirpe 1 de Nelson
estaba entre los primeros genes de resistencia a enfermedades descrito. La enfermedad causada por C.
carbonum estirpe 1 puede ser devastadora, teniendo como resultado pérdidas de producción del 80 % o
más debido a la muerte de las plantas y a los mohos del grano. El alelo dominante, Hm1, y el factor
duplicado Hm2, son los únicos genes de resistencia a una enfermedad que se sabe que están fijados con
una frecuencia elevada en el plasma germinal del maı́z.
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Desde el descubrimiento de un factor de compatibilidad especı́fico de la estirpe que es producido por
el hongo, la enfermedad causada por C. carbonum estirpe 1 ha sido el sujeto de un estudio detallado. Este
factor de compatibilidad permite a los hongos infectar ciertos genotipos de maı́z que de otro modo serı́an
resistentes. El papel de HM1 proporcionando resistencia al hongo es una función de su capacidad para
causar una sensibilidad reducida al factor de compatibilidad. Estudios posteriores establecieron que la
presencia del factor de compatibilidad confiere la misma especificidad de estirpe (para el grano hm1/hm1)
al patógeno de la avena, Cochliobolus victoriae. La estructura de este factor de compatibilidad, toxina
HC, es conocida pero el modo de acción permanece sin ser elucidado. Recientemente, se ha identificado
un enzima que inactiva la toxina HC en extractos de maı́z. El enzima, reductasa de la toxina HC (RTHC),
es detectable solamente en extractos de genotipos resistentes (Hm1). Esto establece la actividad RTHC
como el fenotipo bioquı́mico de Hm1.
Descripción de la invención
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Se ha determinado actualmente que el gen Hm1 puede ser utilizado junto con la toxina HC en un
sistema de marcadores seleccionables para ser utilizados en la transformación del maı́z. Cuando el gen
clonado es unido a secuencias reguladoras apropiadas para la expresión en células vegetales y cotransformado en células de maı́z junto con otro rasgo cuantitativo o cualitativo que no es seleccionable, confiere
a los transformantes una resistencia a la toxina HC en virtud de la producción de RTHC. Las células
pueden continuar creciendo en medio que contenga la toxina HC aislada. Las células no transformadas
no expresan la RTHC y son destruidas rápidamente por la toxina que produce el patógeno. El efecto
neto es un cultivo de tejido que contiene solamente células transformadas que pueden ser regeneradas
posteriormente por métodos conocidos para formar vástagos transformados e incluso plantas completas
transformadas.
Por consiguiente, la invención proporciona un método para identificar transformación de plantas
utilizando C. carbonum o la toxina producida por C. carbonum como marcador fitotóxico, que comprende
las etapas de:
a) cultivo de células o tejidos de una planta diana seleccionada,
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b) introducción en el cultivo de células o tejidos de al menos una copia de un casete de expresión
que contiene una secuencia de ADN que codifica sustancialmente únicamente el gen Hm1 del maı́z,
unida operativamente a secuencias reguladoras vegetales que causan la expresión de la secuencia de
ADN en las células de la planta,
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c) introducción de C. carbonum o de la toxina que produce en el cultivo de células o tejidos y
d) identificación de las células transformadas como las células supervivientes en el cultivo de células o
tejidos.
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Preferiblemente, en el casete de expresión, la secuencia de ADN que codifica sustancialmente
únicamente el gen Hm1 del maı́z tiene al menos un 90 % de homologı́a traduccional con la secuencia
de SECUENCIA I.D. N◦ 1 o de SECUENCIA I.D. N◦ 2.
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Materiales Genéticos y Propagación
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Las cepas de Mutador utilizadas en este trabajo fueron obtenidas del Dr. D. Robertson, Iowa State
University. Las cepas Ac/Ds utilizadas fueron obtenidas de D.I. Greenblatt, University of Connecticut.
La metodologı́a del aislamiento del mutante HM1 fue realizada de la manera publicada previamente por
uno de nosotros [S.P. Briggs, Curr. Top. Plant Biochem. Physiol., 6:59 (1987)].
Las denominaciones de los alelos de HM1 endógamos son: Pr, hm1-1; K61, hm1-2; P8, Hm1-A; Pr1,
Hm1-Pr1; B79, Hm1-B79; 4Co63, Hm1-4CO63; Pioneer PHV12, Hm1-PVH12.
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Aproximación Experimental
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Se sabe que el marcaje de transposones es una herramienta segura para aislar genes del maı́z. El
principio básico del marcaje de transposones es que las reordenaciones del ADN (esto es, inserciones o
escisiones) que son concomitantes con cambios genéticos (fenotı́picos) definen una relación causal que
identifica al ADN reordenado como el gen cambiado. Varios acontecimientos independientes de esta naturaleza son aceptados como prueba de identidad. Según se describe en la presente, hemos observado
que 5 alelos mutantes de HM1 están asociados con inserciones en una región transcrita (hm1-656::Mu1,
hm1-1369::Mu3, hm1-1062::dHbr, hm1-2355, hm1-1040::Spm), y 1 alelo con deleción Def(HM1)-1790
está asociado con la pérdida de la región transcrita. Finalmente, sólo el alelo de tipo salvaje (Hm1-Pr1)
producı́a un ARNm de 1,3 kb.
El Mutador de la familia de elementos transposables es particularmente eficaz para generar mutaciones directas. La reversión germinal de mutantes hacia el tipo salvaje es rara con alelos inducidos por el
Mutador. Se ha observado reversión somática, pero los pequeños sectores somáticos tı́picos del Mutador
no pueden ser identificados para rasgos que no son autónomos de la célula o que son complejos, tal como
el desarrollo de las lesiones de la enfermedad. Por tanto, para obtener acontecimientos genéticos múltiples
que fueran coincidentes con reordenaciones de HM1, se utilizó una estrategia basada en mutaciones directas independientes en lugar de reversiones.
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Para identificar la cosegregación entre HM1 y un fragmento de restricción, la progenie segregante
fue clasificada primeramente examinando su ADN en transferencias Southern. Las transferencias fueron
hibridadas con sondas para los loci RFLP que flanquean el locus; PIO200644 y PIO2000044 (obtenidas de
D. Grant, Pioneer Hi-Bred International, Inc.) mapean 5 cM proximal y distal a HM1, respectivamente
(2; observaciones no publicadas). Solamente la progenie que heredaba los alelos en ambos loci del mismo
parental fueron utilizados en el análisis. Esta aproximación permitió la identificación de la progenie que
heredaba el bloque de 10 cM del cromosoma 1 acotado por los loci RFLP. Agrupando la progenie que
heredaba el alelo mutante, o el alelo comprobador recesivo con el que el alelo mutante estaba apareado,
y comparando posteriormente las dos clases entre sı́, se identificaron fragmentos de restricción que eran
comunes a una clase de la progenie y que estaban ausentes en la otra. Este método estableció una unión
entre los fragmentos de restricción y el bloque de 10 cM que contiene HM1.
Para determinar directamente la unión entre HM1 y un fragmento de restricción, los fragmentos
ligados fueron clonados y utilizados para preparar sondas de hibridación de ADN. Las sondas fueron
hibridadas posteriormente a una transferencia Southern de ADN de una progenie de 60 del retrocruzamiento K61/Pr1 X K61. La progenie del retrocruzamiento fue evaluada por la herencia de los alelos de
HM1 inoculándoles con conidios de C. carbonum estirpe 1 cepa SB111, y por la herencia de los alelos
alternos detectados por las sondas de ADN. La comparación de los patrones de herencia reveló las relaciones de unión entre las sondas y HM1.
50
Los loci RFLP descritos anteriormente, más un locus RFLP que es detectado por la sonda NPI429,
se utilizaron para identificar el progenitor de los alelos mutantes. Obtuvimos NPI429 de T. Helentjaris,
Native Plants, Inc.
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Aislamiento de ADN e Hibridación de las Transferencias
Se aisló ADN total del tejido de la hoja de maı́z, Sorghum (endógama de Pioneer P285), y Coix (Lachrymae jobi) y de tejido de plántulas de Arabidopsis thaliana L. (Landsberg erecta) por el método de la
extracción con urea según está descrito en S.L. Dellaporta, J. Wood, J.B. Hicks, Plant Mol. Biol. Rep.,
1, 18 (1983). Se prepararon transferencias Southern según está descrito por Athma y col., Genetics, 128,
163 (1991). Para el análisis de RFLP, se transfirió ADN a membranas de nailon (MSI de Fisher) y las
hibridaciones se realizaron según se describió anteriormente pero sin la adición de formamida. Las sondas
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se construyeron a partir de fragmentos de ADN purificados en gel y se marcaron mediante cebado aleatorio (Amersham). La sonda especı́fica de Mu1 era un fragmento interno AvaI/BstEII de 650 pb aislado
de pA/B5; el plásmido fue proporcionado por L. Taylor, Stanford University. La sonda especı́fica de Mu3
era el fragmento interno HindIII/XbaI de un clon que se obtuvo de V. Chandler, University of Oregon.
La sondas de Spm fueron pBx1 y pXS2.3 obtenidas de K. Cone, Brookhaven National Laboratory.
Aislamiento de ARN y Transferencia Northern
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Se aisló ARN total de plántulas etioladas de 5 a 6 dı́as de edad, mediante el método del tiocianato
de guanidina [P. Chomczynski y N. Sacchi, Anal. Biochem., 162, 156 (1987)]. El ARN poly(A)+ fue
enriquecido utilizando el sistema de aislamiento de ARNm polyATtract de Promega. Muestras (∼15 µg)
de ARN poly(A)+ fueron desnaturalizadas utilizando formaldehı́do, fraccionadas en un gel de agarosa
al 1,3 % y transferidas a Hybond-N por técnicas estándar. Las sondas de ADN fueron radiomarcadas
mediante cebado aleatorio y las transferencias fueron hibridadas y lavadas según está descrito.
15
Clonaje Genómico
20
ADN aislado de plántulas mutantes homocigotas fue digerido con SstI o con XhoI y los fragmentos de
ADN apropiados (según se estimó de las transferencias Southern) fueron purificados por electroforesis en
gel preparativa y electroelución en un tubo de diálisis. Este ADN purificado fue ligado a brazos prehibridados cortados con SstI o con XhoI del vector bacteriófago λ sep6-lac5 obtenido de R. Martienssen, Cold
Spring Harbor Laboratory. El empaquetamiento en Gigapack Gold (Stratagene) y la selección de las
bibliotecas se llevaron a cabo según las instrucciones del fabricante. Todos los clones fueron subclonados
en Bluescript SK+ (Stratagene) y mantenidos en la cepa SURE (Stratagene) de E. coli.
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PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) y Análisis de la Secuencia
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Para el análisis del ADN de la progenie resistente del heterocigoto hm1-656::Mu1/hm1-1369::Mu3, se
utilizaron cebadores homólogos a las secuencias de cada lado de los sitios de inserción para amplificación
por PCR. Las secuencias de los cebadores fueron: 5’ CTG CTC ATG ACT CAT ATC AGG CGG TAG
C 3’ y 5’ GAC CAG CCG ACG CAG CAG CCC CGC CTT C 3’. Las condiciones de la PCR fueron
como las descritas por Perkin Elmer-Cetus, excepto en que las reacciones se llevaron a cabo en glicerol
al 20 %. Las reacciones fueron calentadas a 94◦C durante 3 minutos, después repetidas 40 veces durante
1 minuto a 94◦C, 2 minutos a 65◦ C y 2 minutos a 72◦C; y finalmente extendidas durante 15 minutos
a 72◦C. Los productos de la PCR purificados en gel fueron reamplificados y secuenciados directamente
utilizando cebadores sintéticos para la secuenciación.
Mutantes de HM1 Derivados de Cepas del Mutador
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Varios alelos mutantes de HM1 fueron recuperados de cepas del elemento Mutador, 4 de los cuales fueron seleccionados para un estudio posterior. Los criterios para la selección incluı́an datos de hibridación
del ADN que descartaban la contaminación con polen como fuente de los alelos mutantes y una baja
frecuencia de progenie susceptible apareciendo dentro de una familia. Los loci RFLP fueron utilizados
para distinguir entre los alelos mutantes y los alelos recesivos estándar con los que se habı́an apareado.
La progenie segregante fue clasificada por la herencia de alelos mutantes mediante la utilización de las
sondas de RFLP.
hm1-656::Mu1
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La progenie producida por la fertilización de plantas del genotipo y wx gl1 Hm1-B79 Mutador (denominadas 81-82-9537 Mu2 per se por D. Robertson) con polen del hı́brido, K61/Pr, tuvo como resultado
la recuperación de 2 plantas susceptibles de la progenie de 253. Se encontró que ambas plantas susceptibles llevaban el alelo mutante, hm1-656::Mu1, indicando que fueron producidas como resultado de un
pequeño sector somático en la espiga. El polen de ambas plantas fue utilizado para fertilizar espigas de
la endógama de Pioneer, PHV12.
Cuando se clasificó la progenie del cruzamiento hm1-656::Mu1/hm1-1 x Hm1-PVH12/Hm1-PHV12
según la herencia del alelo hm1-656::Mu1 (utilizando los loci RFLP), se observó un patrón de hibridación
con el ADN de la sonda procedente del elemento Mu1. Un fragmento de SstI de 3,2 kb cosegregaba con
el alelo hm1-656::Mu1. No se encontraron excepciones a esto en una muestra de la progenie de 92. El
fragmento de 3,2 kb, que contenı́a Mu1 más algo de ADN flanqueante, fue escindido de un gel, clonado
en el sitio de SstI de λ sep6-lac5, subclonado en Bluescript SK+, mapeado por restricción y utilizado
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para preparar una sonda del ADN que flanquea la inserción de Mu1 (denominada ∗ 656).
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La sonda ∗ 656 fue hibridada a una transferencia Southern de ADN de 4 mutantes homocigotos diferentes. La clasificación utilizando los loci RFLP indicaba que cada uno de los alelos mutantes derivaba
del parental endógamo B79 (Hm1-B79). La observación de polimorfismos mostraba que tuvo lugar un
reordenamiento de ADN en la región clonada concomitante con la generación de las mutaciones. Con el
enzima utilizado, hm1-1062::dHbr produce un fragmento idéntico a B79. Sin embargo, pueden detectarse
polimorfismos entre hm1-1062::dHbr y B79 utilizando otros enzimas.
hm1-1369::Mu3
El alelo hm1-1369::Mu3 fue recuperado como una única planta susceptible de la progenie de 230. La
progenie fue producida mediante polinización de plantas de genotipo y wx gl1 Hm1-B79 Mutador (denominadas 81-82-9537 Mu3 per se por el Dr. Robertson) con el hı́brido K61/Pr (hm1-2/hm1-1).
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El heterocigoto, hm1-1369::Mu3/hm1-2, fue autopolinizado y la progenie fue clasificada utilizando los
loci RFLP. La hibridación de una sonda de Mu3 revelaba una banda de cosegregación. Un fragmento
de SstI de 4,6 kb cosegregaba con el alelo hm1-1369::Mu3. La diferencia de la intensidad de las señales
causada por 2 dosis del alelo, cuando era homocigoto, permitı́a evaluar a hm1-1369::Mu3 como marcador codominante, lo que incrementaba la resolución del mapeo. No se observaron recombinantes en un
muestra de una progenie de 60. El fragmento de 4,6 kb que contenı́a Mu3 más ADN flanqueante, fue
escindido del gel y clonado en el sitio de SstI de λ sep6-lac5, subclonado en Bluescript SK+, mapeado por
restricción y utilizado para preparar una sonda (denominada ∗ 1369) del ADN que flanqueaba la inserción
de Mu3.
La sonda ∗ 1369 detectaba los mismos polimorfismos que habı́an sido revelados por la sonda ∗ 656,
indicando que los elementos Mu1 y Mu3 se habı́an insertado en el mismo fragmento de restricción. Esta
conclusión fue confirmada por comparación de los mapas de restricción de los 2 clones. Se reveló una
anomalı́a con SstI en la que el ADN de hm1-656::Mu1 daba un fragmento de 3,2 kb cuando hibridaba con
la sonda ∗ 656, pero un fragmento de 1,0 kb cuando se utilizó la sonda ∗ 1369; otros enzimas no detectaron
esta anomalı́a. El análisis de la secuencia de ADN mostró que el elemento Mu1 habı́a creado un sitio de
SstI después de la inserción en HM1.
Se hizo un esfuerzo para recuperar la progenie resistente de los alelos Mu. El heterocigoto hm1656::Mu1/hm1-1369::Mu3 fue fertilizado utilizando polen de la endógama Pr (hm1-1). De una progenie
de 500, se recuperó 1 planta resistente. El examen de ADN de 10 descendientes susceptibles de la planta
resistente confirmó que los tres alelos parentales estaban segregándose según se esperaba. El examen del
ADN de la planta resistente reveló un fragmento del tamaño del progenitor de B79 (denominado Hm1B79R) más el alelo hm1-1 de Pr. Esta planta fue autopolinizada. El ADN de su progenie fue examinado
utilizando las sondas ∗ 1369, PIO200644, PIO200044 y NPI429. La misma progenie fue analizada para
determinar la susceptibilidad a la infección mediante inoculación con SB111. Los resultados confirmaron
que la resistencia estaba conferida por el alelo Hm1-B79R. Se identificó la progenie homocigota Hm1B79R. El sitio de inserción de Mu1/Mu3 fue amplificado por PCR y secuenciado, sin ninguna diferencia
observada entre el nuevo alelo y el progenitor B79.
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hm1-1062::dHbr
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La progenie producida mediante polinización del hı́brido, K61/Pr (hm1-2/hm1-1) con plantas del
genotipo y wx gl1 Hm1-B79 Mutador (denominadas 81-82-9539 Mu2 per se por el Dr. Robertson) tuvo
como resultado la recuperación del alelo hm1-1062::dHbr de 1 de 2 plantas susceptibles de una progenie
de 483.
La hibridación con sondas especı́ficas para Mu1, Mu3, Mu7 y Mu8 no consiguió identificar un fragmento que cosegregara con hm1-1062::dHbr. La hibridación con la sonda ∗ 656 detectó un polimorfismo
entre hm1-1062::dHbr y el alelo del progenitor, Hm1-B79. Clonamos un fragmento de XhoI de 3,1 kb del
mutante hm1-1062::dHbr en λ sep6-lac5, utilizando ∗ 656 como sonda. El mapeo de restricción confirmó la
estructura de B79 con la excepción de una pequeña inserción (400 pb aproximadamente) en el fragmento
SstI-XhoI en el extremo 3’ del clon. La identidad de este elemento de inserción no ha sido determinada,
pero carece de homologı́a con las sondas de secuencias internas de Ac, Ds1, Ds2 y Spm/En y con la
repetición invertida terminal de Mu.
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Def(HM1)-1790
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La progenie producida polinizando plantas del genotipo y wx gl1 Hm1-B79 Mutador (denominadas
81-82-9536 Mu2 per se por D. Robertson) con el hı́brido, K61/Pr (hm1-2/hm1-1), tuvo como resultado
la recuperación del alelo Def(HM1)-1790 de una única planta susceptible de una progenie de 345.
El alelo Def(HM1)-1790 muestra un patrón de transmisión aberrante. Un heterocigoto Def(HM1)1790/hm1-1 fue autopolinizado y la progenie fue caracterizada utilizando los loci RFLP flanqueantes.
Se encontró que solamente 14 de una progenie de 56 habı́an heredado el cromosoma Def(HM1)-1790.
Cuando se fertilizó un heterocigoto utilizando polen de una cepa de tipo salvaje (SB509), 8 de una progenie de 25 heredaron el cromosoma Def(HM1)-1790. Cuando se utilizó el heterocigoto como fuente
de polen para fertilizar una endógama de tipo salvaje (W23), ninguno de la progenie de 32 heredó el
cromosoma Def(HM1)-1790. Los resultados muestran que el alelo (o cromosoma) Def(HM1)-1790 no se
transmitı́a a través del polen y que se transmitı́a sólo pobremente a través del huevo. Tal patrón de
transmisión es tı́pico de una deficiencia cromosómica. La sonda ∗ 1369 no hibridaba con el ADN del alelo
Def(HM1)-1790, confirmando la presencia de una deleción y mostrando que la región clonada está dentro
de la deleción. Cruzamientos prueba con br2, que mapea en 0,1 cM de HM1, producı́an sólo progenie
de tipo salvaje. De igual modo, PIO200644 y PIO200044 detectaron ambas 2 alelos en la progenie que
habı́an heredado Def(HM1)-1790. Por tanto, la deleción no puede abarcar más de 5 cM del cromosoma,
estando acotada por br2 y uno de los loci RFLP.
Un mutante de HM1 derivado de una cepa Ac/Ds
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Se recuperó un alelo, Hm1-1040::Spm, de la endógama 4Co63; el alelo P-VV (Ac insertado en el gen
P1) habı́a sido retrocruzado en esta versión de 4Co63. Este alelo fue seleccionado para estudio porque
parecı́a producirse como un sector grande de la espiga macho. El hı́brido K61/Pr (hm1-2/hm1-1) fue fertilizado utilizando polen de la endógama 4Co63 (P-VV/P-WW) (Hm1-4Co63/Hm1-4Co63), denominada
610417(X) por I. Greenblatt (comunicación personal). Se utilizaron 17 machos para producir 32 espigas.
Sólo 2 espigas llevaban progenie susceptible y ambas derivaban de la planta macho número 16. El cruce
741-11 X 741-9 planta 16 produjo 47 descendientes susceptibles de 323. El cruce 741-13 X 741-9 planta
16 produjo 16 descendientes susceptibles de 323. Los resultados se explican mejor por un único evento
mutagénico que tuvo lugar durante el desarrollo de la espiga macho, dando lugar a muchos gametos que
llevaban la misma mutación.
Los análisis genéticos mostraban que Ac no se habı́a transpuesto en el mutante hm1-1040::dSpm;
las sondas de Ac, Ds1 y Ds2 no identificaron un fragmento de restricción que cosegregaba con hm11040::dSpm. El examen del ADN del mutante hm1-1040::dSpm por hibridación con la sonda ∗ 1369
reveló un fragmento de restricción de SstI de 11,0 kb que era 6 kb más grande que el alelo progenitor
Hm1-4Co63. Este fragmento fue clonado en λ sep6-lac5. La hibridación de varias sondas al ADN del
clon identificó la inserción como un elemento homólogo de Spm/En.
Variación Natural
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50
Los alelos parentales Hm1 de los que derivaban los mutantes descritos en este informe proporcionan
una resistencia completa a C. carbonum estirpe 1 a lo largo del desarrollo de la planta. En contraste,
el alelo Hm1-A, encontrado en la endógama P8, proporciona una resistencia parcial que incrementa a
medida que la planta se desarrolla. El examen del ADN de P8 por hibridación con la sonda ∗ 1369 mostró
que la región clonada está duplicada. El locus duplicado segrega independientemente de HM1. La relación
entre el patrón de expresión y la duplicación no ha sido establecida. La sonda ∗ 1369 hibridaba bien con
el ADN de las hierbas Sorghum y Coix pero pobremente con el ADN de Arabidopsis. El ARN poli(A)+
de nuestros mutantes y de las endógamas K61 (hm1-2) y Pr1 (Hm1-Pr1) fue transferido e hibridado con
la sonda ∗ 1062. Una banda de ARNm de 1,3 kb estaba presente solamente en las calles de Pr1. Los
genotipos susceptibles no tenı́an ARNm que hibridaba detectable o bien el tamaño era aberrante. En
todos los casos, la señal era extremadamente débil.
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Estos resultados establecen que todo o una parte suficiente del gen HM1 ha sido clonado y secuenciado,
con secuencias genómicas y de ADNc mostradas en la SECUENCIA I.D. N◦ 1 y en la SECUENCIA I.D.
N◦ 2, respectivamente. Los alelos recesivos del gen contienen claramente ADN homólogo (por ejemplo,
hm1-1 y hm1-2). Esto contrasta con los 2 genes del patógeno fúngico de las plantas que han sido clonados,
los cuales controlan la especificidad de estirpe: TOX2 confiere patogeneicidad de tipo estirpe 1 a C. carbonum (Walton, comunicación personal) y avr9 confiere avirulencia especı́fica de estirpe a Cladosporium
fulvum; ambos genes están ausentes en cepas que carecen de sus funciones correspondientes.
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5
La resistencia parece diferir de la susceptibilidad a nivel transcripcional, al menos entre las pequeñas
muestras de alelos que fueron examinadas. Esto indica que los genotipos susceptibles no poseen una forma
alternativa de HM1 con especificidad para un sustrato distinto de la toxina HC. Este resultado sugiere
también que la única función de HM1 en tejido de hojas jóvenes es proporcionar resistencia, debido a que
las mutaciones de HM1 no son pleiotrópicas.
Listado de secuencias
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
(i) SOLICITANTE: Briggs, Steven P.; Johal, Gurmukh S.
15
(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Un Gen de Resistencia a la Enfermedad del Maı́z como Marcador
Seleccionable
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
(iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
20
(A) DESTINATARIO: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
(B) CALLE: 700 Capital Square, 400 Locust Street
25
(C) CIUDAD: Des Moines
(D) ESTADO: Iowa
(E) PAÍS: Estados Unidos
30
(F) ZIP: 50309
(v) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
35
(A) TIPO DE MEDIO: Disquete, 3,5 pulgadas, 1,44 Mb de capacidad
(B) ORDENADOR: IBM Compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
40
(D) PROGRAMA: Microsoft Windows Notepad
(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
45
(A) NÚMERO DE SOLICITUD:
(B) FECHA DE REGISTRO:
(C) CLASIFICACIÓN:
50
(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
(A) NÚMERO DE SOLICITUD:
55
(B) FECHA DE REGISTRO:
(viii) INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:
(A) NOMBRE: Roth, Michael J.
60
(B) NÚMERO DE REGISTRO: 29.342
7
ES 2 129 626 T3
(C) NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 0212 US
(ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACÓN:
5
(A) TELÉFONO: (515) 245-3594
(B) TELEFAX: (515) 245-3634
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N◦ : 1:
10
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 5198 pares de bases
15
(B) TIPO: nucleótido
(C) TIPO DE HEBRA: doble
(D) TOPOLOGÍA: lineal
20
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
(A) DESCRIPCIÓN:
25
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv) ANTISENTIDO: NO
(v) TIPO DE FRAGMENTO:
30
(vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Zea mays
35
(B) CEPA:
(C) AISLADO INDIVIDUAL:
(D) ESTADIO DE DESARROLLO:
40
(E) HAPLOTIPO:
(F) TIPO DE TEJIDO:
45
(G) TIPO DE CÉLULA:
(H) LÍNEA CELULAR:
(I) ORGÁNULO:
50
(vii) FUENTE INMEDIATA:
(A) BIBLIOTECA:
55
(B) CLON:
(viii) POSICIÓN EN EL GENOMA:
(A) CROMOSOMA/SEGMENTO:
60
(B) POSICIÓN EN EL MAPA:
8
ES 2 129 626 T3
(C) UNIDADES:
(ix) CARACTERÍSTICA:
5
(A) NOMBRE/CLAVE:
(B) LOCALIZACIÓN:
(C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:
10
(D) OTRA INFORMACIÓN:
(x) INFORMACIÓN SOBRE LA PUBLICACIÓN:
15
(A) AUTORES:
(B) TÍTULO:
(C) REVISTA:
20
(D) VOLUMEN:
(E) NÚMERO:
25
(F) PÁGINAS:
(G) FECHA:
(H) NÚMERO DE DOCUMENTO:
30
(I) FECHA DE REGISTRO:
(J) FECHA DE PUBLICACIÓN:
35
(K) RESIDUOS RELEVANTES EN LA SEC ID N◦ :
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID N◦ : 1:
40
45
50
55
60
GAATTCGTAT ATCAGTTTAC TGCATGTATA TTTTTTGCAT GCACATTGGA
50
AAGACAATTC CTTGATTTAT GTTGTTCGTA ATTACCAAAA AATCAAATCA
100
TTTATGTTCG TAATTGCTAG ATTTTTACGT CTTCCATAAA ACTGTCCCTA
150
ATTCTCGCCT GTTCTTAATT ACCATAAAAA ATCAAATCAA ATCACTTATA
200
GTCTTAACTG CCAAATTTTT ATATCTGCCA TAAAATTGTC CCTAATTTCC
250
GTCGGCGTTC TTAGTTGGAC CGATATTAGG TTTTTTCAAT TATGCTACAC
300
TGTCTAAATA TTTATGCGAC GTTGTATAAG AATTTGTGCT TTGTGTGACT
350
CATGTCATCC AATTTTTTGT GCGCGTGCAG TGGAAAGGAC ATATAATCTA
400
AAATTTGCGT GCATGCAATG GAAACTCCTA CAATTTGCCT TAATTTTTAG
450
ATGTGCATAA AAATAGAAAT TGCATGCATA CGACTCCCAT ATTTTTCAGA
500
TCTGCCATAA AAATAGGATC GTAAATACAA CCCACCAAAC TATCAACCTC
550
TCATATTGGC TCGATATTTA TGTTTATAAC TGAGAGGTTT TATGCCTAAA
600
ACTTAAGGTA TTTACGCTCG AACCTGTAGA TGCATCCACC AGTGAACCAC
650
9
ES 2 129 626 T3
5
ATGCCAGATT TTTTACGTAG TATACCACAT TGCATATATA ACTACACCAT
700
GTTGCATAAT TTGTATAAGT ATATATCATA AACTGGTGCT AACGAGCCTA
750
GTTGCATGTC TGTTGAAGCG ATCATATATT TATACACGAA ATAAAGCATT
800
TAAATAATTT TTTTTTGTTT TCATGCATGC CAATCCATTT CCTTTCATCG
850
CACATCCTGC CATCCTAAAT TTGTGTGCAT GCATCAAGAA ACAGATTTTT
900
ACACAGTATA CTGAATTGAA TAAATACCTA CACCTTGTAA CATAATTAAT
950
ATCAGTATAT TATAAACTAG TCCTAACGAA TTTAGTTGTA TGGCTGTTGG
1000
AGCGATCCTA TATTTATGGA GAAAATAAAG TATTAAATAT TTTTTTTTGT
1050
TTCCATGCAT GCCAATCCAT TTCCTTTCAT CGCATATTCT TGTCATCTTA
1100
AATTTGTGCT CATGCAACAG GAAACAAATT TTTACGCAGT GTACCAAATT
1150
GCATAAACAC CTACACCGTG TTGCATAATT AGTATCGTTA TATAACATAA
1200
ACTAGTCTTG ACAAGCCTAT CTAAATGGGT TTTAGAGTGA TCTTATATTT
1250
ATGGAGGAAA TAAAGCATTA AATATGAATA TTTGTTTTCA TACATGACAA
1300
TTCATTTCCT TTTATCGTAC AAATTTTGCC ATCCTAATTT TGTGCACATG
1350
CAGCAGGTAA AAAACTTTTA CGTAGTGTAC CAAATTGCAT AAATATCTAC
1400
ACCGTGTAGC ATATTTAGTA TTAGTATATA TATCATAAAC TGGTCCTAAC
1450
GAGCCTAGCT GCATAGCTGT TGCAGCGATC CTATATTTAT GGAGAAAATG
1500
AATCATTTAA AAATAGAAAA AGTCAGAATC TTTTTTTTAA AACTTTACGC
1550
GTATGCAGGG ACACATGTTT GACTTATGCA TCCATTCTTT TTTTGCGAGC
1600
ATAAACGTGG GGTGGGGAGC GCACCCGACA AACTGGCTTG GGGAGTGAGT
1650
GGGCGCGCCG GCCTGGACCA GGTCGCAGGG GTGGTCGGCC TGGGCTTCCT
1700
CTAACTATTT GAAGCCCAGG GTTCCTAATA TACCTTTCCC TATATATATA
1750
TGGCTTCTTT GGAAGCTTTA CTTAAAAAAC TTTAGCTTTA GCTTTTGAGC
1800
TTCACCATAA AACAACTCCA GCAAATTGTT AAGGTGGGTT TCAGAAGCGT
1850
TTGACTTCCA CATGAACTCC AGCTTCTATA GTACAATTGA TTTGTGTGAG
1900
TTTCCTTGAT TACCCTTTAT GATTAGTGGG TTGTCGCGAG AGAAAACGTA
1950
AGTTATATAT TGCGTAACCA GTGGCATGGT GGGTAATTTT TGTACAACTT
2000
CATGAGGAGA TATAAAAACG GTGTTTTTGT AGCACCCTCT AAGAGTTTCA
2050
TGAATTTCAT GAAATTGACC TCTAGTTTCG ATTTTTTTAA AGCTAGAGCT
2100
CGTGGAGCTG GACCAGTTTA GGTGGAAGAA GTTGGAATGA AGTTGAAATT
2150
TTTGAAGTGA AGCTCTCTCA AATAGAGCGT TAATCTACAT TATTAATATT
2200
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
10
ES 2 129 626 T3
5
TGACTTCTAG ATAAGCGAGA ATGGCACTCT TTAGAATGGA GCAACTGGGC
2250
TTAGCTACAT TTATGATATG GAGGTTCTTA GTTGTATTAT GTAGTTTCTT
2300
AGCTACCTTT TATATTTGGA AAACCGAACC AGACTCTGGA TTGTACATAG
2350
CCTTTGAAGA ATTATTCAAG AGTTAATTAA GCTGTAATGC CACTAATATT
2400
AAGGTTTAAT TTACCCTTGT ATTCAATACT TAACGTTATA TATTCTCTAT
2450
AATTAAACAT AGTCCAACTT AAAAAATGAT TTTTGCAAAG ATAGAATTAT
2500
ATGTTTTTTG TGAGGGCTAA TAGTTTAATG AAGTTATCGA TGTTTGTATA
2550
TTTCACGACT ATAACCTTCA CCTCTGACCG CTAATGCTTG TTTAGACCAT
2600
ATTTGGATGT TGTTGTATTA AAATATTATG TTATTAAGGA ACCATTGTTT
2650
TAGCATTGTA TTCAAAATTA TGAAGTTTTT ATATGCAAAT GATTCACTCG
2700
AAAAAACAAA AGTATCAAAA TCATAGTATT TTCTCTCTCT AAAATTCCAA
2750
AAATATTTTA CATCTAAAGT TGATGTCTTG GCCTCCCGCG CTGTTTTACC
2800
TTCCTCCTCT GGACACCAAC CACAGGCCGA CAACCGAGTA AGCCGGTCAA
2850
TTTTGGTATC CTGCTCATGA CTCATATCAG GCGGTAGCCG AGCAGCCGCC
2900
CAGCTTTCTC ATGCCAGAGC AAACCCATAG GTCCAGTCCA AATCCAATCC
2950
CTGTTGCCAT CAGAATTTCA GGGGCAGCCA TGGCCGAAAA GGAGAGCAAC
3000
GGAGTGCGGG TGTGCGTCAC CGGAGGAGCC GGGTTCATCG GCTCCTGGCT
3050
CGTCAGGAAG CTCCTCGAGA AAGGCTACAC CGTCCACGCC ACCCTGCGGA
3100
ACACCGGTGC GTCTGATGGC GGCTCCTCAG CTCGATCCGC GCGTCGCGAA
3150
AGGCGAAACA CGCCAAAGGC GAAAGGAGTG GGTCGGGTCT CGTGTGTGGC
3200
TGCCTGATGA TTCGGGAATC TTAGCCGGAT TCGTGTGCTG GTGGGTGTGC
3250
AGGGGACGAG GCGAAGGCGG GGCTGCTGCG TCGGCTGGTC CCCGGCGCGG
3300
CGGAGCGGCT GCGGTTGTTC CAGGCCGACC TCTTCGACGC CGCCACCTTC
3350
GCGCCGGCGA TCGCTGGGTG CCAGTTCGTC TTCCTCGTCG CCACGCCATT
3400
CGGGCTCGAT AGCGCCGGCT CCCAGGTGAA GCTTGCCGTC GCGTTCGCTC
3450
CCTTCACTGT TTTACTAGTC AACGAGTGGT CAGGCGGCGA CGCGCCGTGC
3500
TGTCTCTTCT TAATTTTAAG TTGTGGAAAA TTACTGTCCT TGCAAAGGAA
3550
AAATTTGATC AGACTGAGTA TGAGTAAAGA CCAGTAAGAC AGCACAAGGA
3600
TTGCGAGCTG CGACTGCGAG CAGAGGAAAC GTCTTCACAG TTATTCTTGT
3650
CTGCCTTGTT TTTCTCTATC TGAAGCAAAA TCTTGTGGTG CCCATCGACC
3700
GCGTATAGCA GTATAAGAGC ACGGCGGAAG CTGTGGTGGA CGCGGTGCGC
3750
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
11
ES 2 129 626 T3
5
GCGATCCTCC GGCAATGCGA GGAGTCCCGG ACGGTGAAGC GAGTGATCCA
3800
CACAGCCTCC GTAGCGGCCG CCTCGCCGTT GCTGGAGGAG GAGGTCTCCG
3850
CCTCCGGCGT CGGGTACAGA GACTTCATCG ACGAATCTTG TTGGACTTCG
3900
CTCAACGTTG ACTATCCTCT CCGAAGCGCA CACTTCGACG TAAGTAGTAT
3950
ACAAGCGAAG CTTCTTCTGA TTTCTGAACT GGAACGCCTG ATCACATTAA
4000
TATTTTTTAG CTGACGGCCA TTTGATTTGC AGAAGTACAT ACTGTCGAAG
4050
CTGCGGTCAG AGCAGGAGCT CCTGAGCTAC AACGGCGGCG AGAGCCCGGC
4100
GTTCGAGGTG GTGACCCTGC CGCTGGGGCT CGTGGCGGGC GACACGGTCC
4150
TCGGCCGCGC CCCGGAGACG GTGGAGAGCG CCGTGGCGCC CGTGTCCCGC
4200
AGCGAGCCCT GCTTCGGCCT CCTGCGCATA CTGCAGCAGC TCCTGGGGTC
4250
GCTGCCGCTG GTGCACGTGG ACGACGTCTG CGACGCGCTC GTCTTCTGCA
4300
TGGAGCGGCG CCCCTCCGTC GCCGGCCGCT TCCTCTGCGC CGCCGCGTAC
4350
CCGACGATCC ACGACGTGGT CGCCCACTAC GCCAGCAAGT TCCCTCACCT
4400
CGACATCTTG AAAGAGTAAG ATCAAAAGCG TCCACAGCGA CAGCATCACC
4450
CTGCACACAA GAACTGACTG CCGATTTACG TTTCTGTTGC GATTGGTTGG
4500
ATTGATCTGC GTCAGGACGG AGGCGGTGGC GACGGTGCGG CCTGCCCGGG
4550
ACAGGTTGGG CGAGCTGGGC TTCAAGTACA AGTACGGCAT GGAAGAGATT
4600
CTGGATAGCA GCGTTGCCTG TGCGGCGAGA TTAGGTTCCC TTGACGCATC
4650
CAAGCTCGGC CTACAGAAAG GATAAAAGCT CGAAGCTTAC TCATAAGCAC
4700
CATGGGGAAC TTGGATTGTT CGCTGTCCAC TATACGCGTT CGAAATTTGG
4750
AAACTAGACA TACTCCAATA AAACAAGAGG TAAAGAAACG TGGGCTAACT
4800
GATACGCGTT GAGCAGTTGA GCTAGCCTAG TTTAGTCCAC CTGTGTGCAG
4850
GGTTTAAAAC TTCGACGAAA TTTTATGACT TGCGATAATT TTAGGCCTCT
4900
AAATATCAAC CATACACTCT AAATTGTATA TGTGCATACA CATATAGCCA
4950
TATGGACGCT CTGATCTAGC ATCCTACACC TATGCACCTC TCTAAGAACA
5000
ACTCCAACAG CCTCACTAAA TATATCAGAT TCGGTAAAAA AAAACCCAGT
5050
TAAAATTGTA TCCAATAGTC TCGTTTTATT CTTATCTTCT CTATCCAACT
5100
CGTCATATGG TCCCTTTCGC TAGACATCTT TGCCAAGGCG TACGGCTCGC
5150
CATATCCCTC GTCATGCCCA ACTGTCCTCC CGCCGTCGCA GAGAATTC
5198
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
◦
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N : 2:
60
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 1374 pares de bases
12
ES 2 129 626 T3
(B) TIPO: nucleótido
(C) TIPO DE HEBRA: doble
5
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
10
(A) DESCRIPCIÓN:
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv) ANTISENTIDO: NO
15
(v) TIPO DE FRAGMENTO:
(vi) FUENTE ORIGINAL:
20
(A) ORGANISMO: Zea mays
(B) CEPA:
(C) AISLADO INDIVIDUAL:
25
(D) ESTADIO DE DESARROLLO:
(E) HAPLOTIPO:
30
(F) TIPO DE TEJIDO:
(G) TIPO DE CÉLULA:
(H) LÍNEA CELULAR:
35
(I) ORGÁNULO:
(vii) FUENTE INMEDIATA:
40
(A) BIBLIOTECA:
(B) CLON:
(viii) POSICIÓN EN EL GENOMA:
45
(A) CROMOSOMA/SEGMENTO:
(B) POSICIÓN EN EL MAPA:
50
(C) UNIDADES:
(ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOMBRE/CLAVE:
55
(B) LOCALIZACIÓN:
(C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:
60
(D) OTRA INFORMACIÓN:
(x) INFORMACIÓN SOBRE LA PUBLICACIÓN:
13
ES 2 129 626 T3
(A) AUTORES:
(B) TÍTULO:
5
(C) REVISTA:
(D) VOLUMEN:
10
(E) NÚMERO:
(F) PÁGINAS:
(G) FECHA:
15
(H) NÚMERO DE DOCUMENTO:
(I) FECHA DE REGISTRO:
20
(J) FECHA DE PUBLICACIÓN:
(K) RESIDUOS RELEVANTES EN LA SEC ID N◦ :
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID N◦ : 2:
25
30
35
40
45
50
55
60
GAATTCGGCA CGAGTGCCAT CAGAATTTCA GGGGCAGCCA TGGCCGAAAA
50
GGAGAGCAAC GGAGTGCGGG TGTGCGTCAC CGGAGGAGCC GGGTTCATCG
100
GCTCCTGGCT CGTCAGGAAG CTCCTCGAGA AAGGCTACAC CGTCCACGCC
150
ACCCTGCGGA ACACCGGGGA CGAGGCGAAG GCGGGGCTGC TGCGTCGGCT
200
GGTCCCCGGC GCGGCGGAGC GGCTGCGGTT GTTCCAGGCC GACCTCTTCG
250
ACGCCGCCAC CTTCGCGCCG GCGATCGCTG GGTGCCAGTT CGTCTTCCTC
300
GTCGCCACGC CATTCGGGCT CGATAGCGCC GGCTCCCAGT ATAAGAGCAC
350
GGCGGAAGCT GTGGTGGACG CGGTGCGCGC GATCCTCCGG CAATGCGAGG
400
AGTCCCGGAC GGTGAAGCGA GTGATCCACA CAGCCTCCGT AGCGGCCGCC
450
TCGCCGTTGC TGGAGGAGGA GGTCTCCGCC TCCGGCGTCG GGTACAGAGA
500
CTTCATCGAC GAATCTTGTT GGACTTCGCT CAACGTTGAC TATCCTCTCC
550
GAAGCGCACA CTTCGACAAG TACATACTGT CGAAGCTGCG GTCAGAGCAG
600
GAGCTCCTGA GCTACAACGG CGGCGAGAGC CCGGCGTTCG AGGTGGTGAC
650
CCTGCCGCTG GGGCTCGTGG CGGGCGACAC GGTCCTCGGC CGCGCCCCGG
700
AGACGGTGGA GAGCGCCGTG GCGCCCGTGT CCCGCAGCGA GCCCTGCTTC
750
GGCCTCCTGC GCATACTGCA GCAGCTCCTG GGGTCGCTGC CGCTGGTGCA
800
CGTGGACGAC GTCTGCGACG CGCTCGTCTT CTGCATGGAG CGGCGCCCCT
850
CCGTCGCCGG CCGCTTCCTC TGCGCCGCCG CGTACCCGAC GATCCACGAC
900
GTGGTCGCCC ACTACGCCAG CAAGTTCCCT CACCTCGACA TCTTGAAAGA
950
14
ES 2 129 626 T3
5
GACGGAGGCG GTGGCGACGG TGCGGCCTGC CCGGGACAGG TTGGGCGAGC
1000
TGGGCTTCCA AGTACCAAGT ACGGCATGGG AAGAGATTCT GGATAGCAGC
1050
GTTGCCTGTG CGGCGAGATT AGGTTCCCTT GACGCATCCA AGCTCGGCCT
1100
ACAGAAAGGA TAAAAGCTCG AAGCTTACTC ATAAGCACCA TGGGGAACTT
1150
GGATTGTTCG CTGTCCACTA AACGCGTTCG AAATTTGGAA ACTAGACATA
1200
CTCCAATAAA ACAAGAGGTA AAGAAACGTG GGCTAACTGA TACGCGTTGA
1250
GCAGTTGAGC TAGCCTAGTT TAGTCCACCT GTGTGCAGGG TTTAAAACTT
1300
CGACGAAATT TTATGACTTG CGATAATTTT AGGCCTCTAA AAAAAAAAAA
1350
AAAAAAAAAA AAAAAAAACT CGAG
1374
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
15
ES 2 129 626 T3
REIVINDICACIONES
1. Un método para identificar transformación de plantas utilizando la resistencia a C. carbonum o a
la toxina producida por C. carbonum como marcador fitotóxico, que comprende las etapas de:
5
10
a) cultivo de células o tejidos de una planta diana seleccionada,
b) introducción en el cultivo de células o tejidos de al menos una copia de un casete de expresión
que contiene una secuencia de ADN que codifica sustancialmente únicamente el gen Hm1 del maı́z,
unida operativamente a secuencias reguladoras vegetales que causan la expresión de la secuencia de
ADN en las células de la planta,
c) introducción de C. carbonum o de la toxina que produce en el cultivo de células o tejidos y
15
d) identificación de las células transformadas como las células supervivientes en el cultivo de células o
tejidos.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que en el casete de expresión, la secuencia de
ADN que codifica sustancialmente únicamente el gen Hm1 del maı́z tiene al menos un 90 % de homologı́a
traduccional con la secuencia de la SECUENCIA I.D. N◦ 1 o de la SECUENCIA I.D. N◦ 2.
20
25
30
35
40
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
16