Práctica 1 CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE BARRIDO

Físico-Química de Biomoléculas
Lic. en Biotecnología
Práctica 1
CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE BARRIDO
1. Objetivo
Simular un diagrama de calorimetría diferencial de barrido (DSC) del
plegamiento/desplegamiento de una proteina y, por otra parte, extraer de un diagrama
experimental la entalpía del proceso de desplegamiento.
La práctica consta de varios pasos:
-
Utilización de un modelo muy simplificado que da lugar a un diagrama de DSC
Perfeccionamiento del modelo inicial que da lugar a un diagrama de DSC más realista.
Independientemente de cualquier consideración de modelo, obtener H y T1/2 de la
transición del estado nativo de la proteina al estado desnaturalizado.
Como alternativa al paso 3, se ajustan los parámetros del modelo 2 al espectro
experimental, obteniendose los valores de H y T1/2.
La utilización de modelos permite entender a qué se deben los diferentes rasgos
(features) que se observan en el diagrama.
Figura 1: Principio de la DSC. Una muestra (S) y
una referencia (R) se calientan de manera
controlada por los sensores de temperatura.
Figura 2: Ejemplo de termograma DSC. Muestra del
péptido ubiquitina 5 g/l en búfer de glicina-HCl a pH 2.45.
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2. Fundamento
La calorimetría diferencial de barrido (DSC) consiste en calentar una muestra (S en la
Figura 1) así como un compuesto de referencia (R) de tal manera que la temperatura es en
todo momento igual en R y en S. Esto se consigue midiendo las temperaturas con sensores y
ajustando las potencias de calentamiento. Se aplican velocidades de calentamiento (en
grados/s) uniformes a la muestra y a la referencia para realizar el barrido de temperaturas. La
representación de la potencia de calentamiento frente a la temperatura es lo que se denomina
diagrama DSC o, dado que se realiza frente a la temperatura, termograma. Un ejemplo de
termograma se encuentra en la Figura 2. La DSC detecta transiciones que implican
intercambio de energía, sea almacenamiento de calor (procesos endotérmicos) o liberación de
calor (procesos exotérmicos). Ejemplos de estos procesos son las transiciones de fase (sólidosólido o sólido-líquido por ejemplo), procesos de cristalización, oxidaciones irreversibles,
deshidrataciones, etc… Esta técnica también resulta muy adecuada para comprobar la pureza
de un material, examinando la forma y la anchura del pico obtenido.
Para muestras biológicas, esta técnica está considerada hoy en día como la más
adecuada para estudiar la energética de las transiciones plegamiento-desplegamiento de las
proteinas. Permite la caracterización termodinámica de los cambios conformacionales
inducidos por cambios de temperatura en proteinas, ácidos nucléicos y biomembranas.
Un aspecto fundamental para la modelización que efectuaremos en esta práctica es que
supondremos que el sistema se encuentra en todo momento en equilibrio termodinámico, lo
que correspondería a una velocidad de barrido infinitamente lenta. Consideremos una proteína
que puede estar en uno de dos estados: Nativo (N) y Desnaturalizado (U). Estos estados están
en equilibrio. Sea la fracción molar de proteina desnaturalizada.
N
↔
U
C
(1- )C
La constante de equilibrio de esta reacción es:
[U ]
K =
(1)
[N ]
αC
α
K =
=
(2)
(1 − α)C
1 −α
La Ecuación (2) puede escribirse para expresar
K
α =
(3)
1 + K
en función de K:
Dado que medimos el calor que se le proporciona a la muestra comparandolo con una
muestra de referencia que no contiene la proteína, el primer principio de la termodinámica
dicta que:
Q = ∆H R = (1 − α)CV C pN dT + αCV∆H + αCV C pU dT − CV C p0dT
(4)
En esta ecuación, Q es la cantidad de calor que se le proporciona a la muestra, HR es
la variación de entalpía del sistema, C la concentración de la proteína, V el volumen de la
muestra, H la entalpía molar para pasar de la proteína nativa a la desnaturalizada a una
temperatura de referencia Tm (luego veremos qué valor de Tm es oportuno elegir), CpN, CpU y
Cp0 serían la capacidad calorífica de la proteína nativa, desnaturalizada, y de una cantidad de
agua que ocupe el mismo volumen que la proteina. Las integrales se realizan entre Tm y T.
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Puesto que el número de moles de proteínas es
n = CV ,
(5)
la Ec. 4 puede escribirse como:
Q = n α ∆H + (C pU − C pN )dT + (C pN − C p 0 )dT ,
(
((
)
)
)
(6)
donde ∆H + (C pU − C pN )dT es una entalpía molar corregida por la temperatura, que se
conoce como relación de Kirchoff:
∆H(T) = ∆H(Tm ) +
T
∆C p(T')dT'
(7)
Tm
donde Cp(T´)= CpU(T´)- CpN(T´).
Se supone que CpN y Cp0 no varían mucho con la temperatura por lo que se pueden
“sacar” de la integral.
Q = (α∆H(T) + (C pN − C p0)∆T )n
(8)
T es la diferencia (T-Tm).
Ahora derivamos la ec. (4) con respecto al tiempo:
dQ
d(α∆H)
dT
(9)
=
+ (C pN − C p0)
n
dt
dt
dt
Sabiendo que
d(α∆H)
d(α∆H) dT
=
,
dt
dT dt
Podemos sacar factor común de dT/dt en la ec. (9).
Para entender la ec. 9, recordemos que dT/dt= es la velocidad constante a la que se efectúa el
calentamiento en K/s y dQ/dt=P(T) es la potencia que suministra el calorímetro.
En consecuencia, la ec. (9) se transforma en:
P(T)
d(α∆H)
=
+ C pN − C p0
(10)
nσ
dT
El diagrama consta de un “cero” al que se llamara base (y de unas desviaciones del
cero (picos).
Pbase(T)
(11)
= C pN − C p0
nσ
Pxs(T)
d(α∆H)
=
(12)
nσ
dT
Los términos a la derecha de la igualdad en la ec. 12 son formalmente capacidades
caloríficas. El término de la izquierda corresponde entonces a una capacidad calorífica
aparente de exceso Cp,xs
d(α∆H)
C p,xs(T) =
(13)
dT
La Ec. 12 expresa que la parte que resulta de interés en el diagrama, las desviaciones
de la base, es proporcional a la capacidad calorífica de exceso de la proteína. Nuestro
cometido es, por tanto, obtener una representación de Cp,xs(T).
Para conocer K, que se necesita en la ec. (3), se utiliza la relación de van´t Hoff:
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d(ln K )
∆H
=
dT
RT 2
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(14)
A continuación vamos a suponer que CpU=CpN de modo que H(T) es independiente
de la temperatura= H.
Ec. (14) puede integrarse:
2
2
∆H
d(ln K ) =
dT
RT 2
1
1
ln
K(T2)
∆H 1
1
=
−
K(T1)
R T1
T2
∆H 1 1
−
R T1 T2
K(T2) = K(T1)e
(15)
Por definición, la temperatura T1/2 es aquella para la que =0.5 (es decir K(T1/2)=1, ec.
(2)). Usaremos esta temperatura como referencia en la ec. (14) y T2=T. Nota, T1/2 es
normalmente identico a Tm, el máximo de la capacidad calorífica de exceso en el diagrama de
DSC. Ec (14) se simplifica:
K(T) = e
∆H 1 1
−
R Tm T
Volvamos a la ec. (12). En el caso de este primer modelo, se reduce a:
d(α∆H)
C p,xs(T) =
dT
d(α)
= ∆H
dT
Las derivadas se obtienen de forma numérica:
dα
α(T + δT) − α(T − δT)
=
dT
(T + δT) − (T − δT)
α(T + δT) − α(T − δT)
=
2δT
Sustitución de (17) en (16):
C p,xs(T) =
α(T + δT) − α(T − δT)
∆H
2δT
(16)
(17)
(18)
(19)
3. Procedimiento práctico
Primero se crea una carpeta de trabajo en el Escritorio en la que se guardarán todos los
ficheros.
1)
En una hoja de cálculo de Excel, se dedican unas celdas a los datos de entrada. Introducir los
datos en las unidades indicadas:
H /kJmol-1, T1/2 /K, T /K, y a la constante R=0.008314 kJ/mol.
Para todos los casos se usará
T=10-6 K
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En la hoja de cálculo, por debajo de las celdas de datos, se usarán las columnas A-H para los
datos siguientes:
A
B
Temperaturas T+ T
T /K
273
274
…
373
C
T- T
D
K(T+ T)
E
K(T- T)
F
(T+ T)
G
H
(T- T) Cp,xs
La columna de las temperaturas es una columna de datos que hay que generar: se quieren
calcular las temperaturas de 273 a 373 K cada Kelvin. Las columnas D y E se obtienen con la
ec. (16); las columnas F y G a partir de la ec. (3); la columna H finalmente a partir de la ec.
(19).
a) Caso 1: T1/2=300 K, H=200 kJ/mol
Obtener los valores de Cp,xs, copiarlos en una columna distinta. Sugerencia: se puede usar
copiar y “ pegado especial” convirtiendo las fórmulas a Valores. De esta manera, los datos no
se actualizarán si se modifica el contenido de la celda que contiene H.
b) Caso 2: T1/2=300 K, H=100 kJ/mol
Representar los datos en una gráfica XY de dispersión en una Hoja aparte. Elegir una escala
adecuada (250-400 K). Comparar los diagramas entre sí. Compararlos también con el
diagrama DSC de la ubiquitina (Figura 2).
2) Obtención de H y Tm de un registro de DSC experimental
Tm es la temperatura a la que la capacidad calorífica de exceso es máxima. H se obtiene por
integración por trapecios del pico asumiendo que la línea base es una recta.
Abrir una nueva hoja que llamaremos Hoja 3.
Conectarse
a
la
página
web
de
la
asignatura
(http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/quimbiotec_FQbiomol.html).
Junto a la práctica de la DSC, se encuentra un fichero de datos DSCexp.dat. Descargar este
fichero y guardarlo en la carpeta de trabajo. Abrir este fichero con Excel. Copiar los datos a
columnas seleccionadas de la Hoja 3. Representar los datos en una gráfica XY de dispersión
en una Hoja nueva que llamaremos Gráfico 3. Seleccionar a ojo dos puntos de la curva por los
que pasará también la línea base (un punto de principio (X0,Y0) y uno de fin del pico
(X1,Y1)). En una columna obtener para cada temperatura la ordenada de la línea base.
Integrar el pico entre X0 e X1 según el método de los trapecios para obtener H.
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3) Obtención de H y Tm de un registro de DSC experimental ajustandolo al Modelo 1
En este caso vamos a determinar los parámetros de tal manera que el Modelo 1 se ajuste lo
mejor posible a los datos experimentales. Estos datos comportan dos columnas, las
temperaturas en K y las capacidades caloríficas de exceso en kJ/mol.
Copiar la Hoja 1 a una nueva Hoja de cálculo que llamaremos Hoja 4. Ahora, H y Tm no se
considerarán datos sino estimaciones iniciales y dejaremos que Excel los modifique durante el
ajuste. Del fichero de datos copiado de la página web y que se trata de ajustar, copiar la
columna de temperaturas a la columna A (de manera que el Modelo proporcione los datos de
Cp,xs a los intervalos en los que se dispone también de datos experimentales). En otra
columna, copiamos los Cp,xs experimentales. Construiriamos entonces la función de la suma
de los cuadrados de la diferencia entre Cp,xs experimental y calculado:
R =
(C p,xs exp − C p,xscalc)2
No obstante, el Modelo 1 presenta ciertas deficiencias, así que optamos por dotarlo de una
linea base ajustable de forma que la nueva función calculada queda como:
C p , xscalcnuevo = C p , xscalc + c 1 + arctan(
T − Tm
)
d
Con la herramienta “ solver” de Excel (comprobar que su versión de Excel haya sido instalada
con este módulo), se minimiza esta función utilizando las casillas
H, Tm, c y d. Es
importante que las estimaciones iniciales se encuentren razonablemente cerca de la solución.
De no ser así, el programa puede converger hacia una solución que no es la correcta. Este es
un problema muy general en la minimización de funciones de varias variables. Es muy fácil
encontrar un “ mínimo local” pero de forma general, no existe ningún método para encontrar
con fiabilidad el mínimo absoluto de la función. Opcionalmente se puede representar la
función ajustada frente al diagrama experimental. Probar por ejemplo el conjunto de valores
iniciales:
H=150 kJ/mol , Tm= 290 K, c=1 y d=1, cuya minimización debería dar un R
"pequeño" y una muy buena adecuación a la curva. Cambiar ahora el valor de la temperatura
inicial a 280 K y observar la nueva solución.
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Figura 3: Problemática de encontrar el mínimo global de una función de varias
variables
Nota: Los valores “ reales” de la curva DSC son H=200 kJ/mol y Tm=300 K.
7. Bibliografía
Michael E. Brown, Introduction to Thermal Analysis, 2nd ed., Techniques and Applications,
Secaucus, NJ USA: Kluwer Acad., 2001; libro electrónico
Babur Chowdhry y Stephen Leharne, Simulation and Analysis of Differential Scanning
Calorimetry Output: Protein Unfolding Studies 1, J. Chem. Edu., 74, 236 (1997)
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