EFECTO ANTITUMORAL DEL GEN SUICIDA HSV-tk Y

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Acta Otorrinolaringol Esp 2002; 53: 448-454
INVESTIGACIÓN BÁSICA
EFECTO ANTITUMORAL DEL GEN SUICIDA HSV-tk
Y GANCICLOVIR EN UN MODELO EXPERIMENTAL DE
CARCINOMA EPIDERMOIDE DE CABEZA Y CUELLO
M. S. BOLEAS AGUIRRE, S. FERNÁNDEZ GONZÁLEZ, M. A. GALLEGO MADRID, R. GARCÍA-TAPIA URRUTIA
DEPARTAMENTO
DE
OTORRINOLARINGOLOGÍA. CLÍNICA UNIVERSITARIA
DE
NAVARRA. PAMPLONA.
RESUMEN
I
ntroducción: Se estudió la transfección por adenovectores y el
efecto antitumoral del gen HVS-tk asociado a ganciclovir
(AdCMVtk/GCV) en células KB de carcinoma epidermoide oral
humano, in vitro e in vivo. Material y métodos: La trasfección por
adenovectores se comprobó al teñir con X-gal cultivos y cortes
tumorales KB tras exponerlos al adenovector AdCMVlacZ. El
efecto antitumoral de AdCMVtk/GCV in vitro se estudió al comparar la supervivencia entre cultivos expuestos a AdCMVtk/GCV y a
AdCMVlacZ/GCV. Para valorar el efecto antitumoral in vivo, se
comparó el volumen de necrosis tumoral con respecto al total,
entre animales tratados con AdCMVtk/GCV y con
AdCMVlacZ/GCV. Se estudió la toxicidad hepática y renal. Resultados: In vitro, la supervivencia con AdCMVtk/GCV es menor que
con AdCMVlacZ/GCV. In vivo, el volumen de necrosis es mayor
con AdCMVtk/GCV que con AdCMVlacZ/GCV. No se constató toxicidad hepática ni renal. Conclusiones: Las células KB se transfectan por adenovectores y son destruidas por AdCMVtk/GCV, in
vitro e in vivo (sin toxicidad en este modelo experimental animal).
PALABRAS CLAVE: Genes suicidas. Cáncer de cabeza y cuello.
ABSTRACT
ANTITUMORAL EFFECT OF HSV-tk SUICIDE GENE ASSOCIATED WITH GANCICLOVIR IN A
EXPERIMENTAL MODEL OF HEAD AND NECK SQUAMOUS CELL CARCINOMA
I
ntroduction: We studied the transfection by adenoviral vectors
and the antitumoral effect of HSV-tk gene associated with ganciclovir (AdCMVtk/GCV) in KB human oral cavity squamous cell
carcinoma, in vitro and in vivo. Materials and methods: Transfection
was assessed by the X-gal stain. It was used in cell cultures and tumoral sections previously exposed to adenoviral vector AdCMVlacZ.
In vitro, in order to study the antitumoral effect of AdCMVtk/GCV,
survival of cell cultures exposed to AdCMVtk/GCV and to AdCMVlacZ/GCV was compared. In vivo, necrotic volume as a percentage
of total tumoral volume, was compared between AdCMVtk/GCV treated group and AdCMVlacZ/GCV exposed group. Hepatic and renal
toxicities were assessed. Results: In vitro, survival of cell cultures
treated with AdCMVtk/GCV was less than AdCMVlacZ/GCV exposed cells. In vivo, necrotic volume was larger in AdCMVtk/GCV treated group than in AdCMVlacZ/GCV exposed group. No toxicity was
found (hepatic, renal). Conclusions: KB cells are transfected by adenoviral vectors and are killed by AdCMVtk/GCV, both in vitro and in
vivo (no toxicity was found in the animal model).
KEY WORDS: Suicide genes. Head and neck cancer.
Correspondencia: Mª Soledad Boleas Aguirre. Dept. de Otorrinolaringología. Clínica Universitaria de Navarra. Pío XII, 36. 31008 Pamplona.
e-mail: [email protected]
Fecha de recepción: 13-12-2001
Fecha de aceptación: 18-4-2002
448
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ACTA OTORRINOLARINGOLÓGICA ESPAÑOLA
INTRODUCCIÓN
El carcinoma epidermoide de cabeza y cuello
es el sexto cáncer de mayor frecuencia a nivel
mundial1. Con el empleo de cirugía, radioterapia y
quimioterapia, la supervivencia media de los pacientes ronda el 50%. Además los defectos funcionales y estéticos derivados de estos tratamientos
son muy importantes. Parece por tanto conveniente
desarrollar nuevas medidas terapéuticas que mejoren la supervivencia y ocasionen menos efectos
secundarios en los pacientes. Una nueva medida
que puede emplearse es la terapia génica (TG).
El objetivo de la terapia génica en oncología es
introducir un material genético nuevo en las células neoplásicas que permita su destrucción selectiva sin ocasionar efectos tóxicos en las células circundantes no malignas 2 . La introducción del
material genético se realiza con vectores virales o
no virales. Los que más se han utilizado son los
adenovirus.
La aplicación de la TG en el cáncer de cabeza
y cuello puede ser interesante, ya que por su localización, estos tumores son relativamente accesibles a la aplicación directa de las estrategias de
TG y a la valoración de la respuesta a su empleo.
Los procedimientos de TG más estudiados y adecuados en los tumores de cabeza y cuello son: a)
la transferencia de genes suicidas o terapia de activación de profármacos (como el gen HSV-tk de la
enzima timidín-kinasa del virus Herpes simplex tipo 1, asociado al profármaco ganciclovir), b) la inmunoterapia, que potencia la respuesta inmune
antitumoral (como los genes de citokinas, como el
gen de la IL-12) y c) la sustitución de genes supresores defectuosos (como el gen p53)2.
En este trabajo se pretendió estudiar la capacidad de los adenovirus recombinantes (vectores
para el transporte de material genético) de transfectar la línea celular tumoral KB de carcinoma
epidermoide bien diferenciado de cavidad oral humano, tanto in vitro como in vivo.
Se quiso valorar el efecto antitumoral de la
transducción del gen HSV-tk asociado a la administración de ganciclovir (GCV) en esta línea celular, in vitro e in vivo.
Se pretendió establecer in vivo un modelo animal para estudiar el efecto terapéutico de los genes suicidas y su viabilidad. En este sentido se seleccionaron ratones inmunodeficientes en los que
desarrollar tumores KB. Para estudiar la viabilidad
del modelo experimental animal se valoraría su
adecuación para efectuar estudios de TG en carcinomas epidermoides, en cuanto a la capacidad de
desarrollar tumores y en cuanto al supuesto efecto
tóxico del tratamiento (hepático y renal, analítico e
histopatológico).
A su vez, se pretendió estudiar el efecto del
tratamiento con el gen suicida HSV-tk y GCV in vivo mediante la estimación de los volúmenes tumorales (total y de necrosis) con técnicas de estereología (método de Cavalieri).
MATERIAL Y MÉTODOS
Los vectores empleados fueron el adenovirus
recombinante portador del gen de la enzima timidín-kinasa del virus Herpes simplex (AdCMVtk) y
el adenovirus recombinante portador del gen marcador lacZ de la bacteria Escherichia coli que codifica la enzima β-D-galactosidasa (AdCMVlacZ). Se
construyeron a partir del adenovirus tipo 5. Ambos
contienen el promotor inmediato temprano y la señal de poliadenilación del citomegalovirus.
En los experimentos in vitro se cultivaron las
células KB en placas de 6 pocillos (0,5x10 5 en 2
ml de medio de cultivo EMEN con 10% de suero
de ternera fetal, 1% de aminoácidos no esenciales
y 2 mM de glutamina por pocillo). (Incubación al
5% de CO2 y a 37ºC).
Para valorar la transfección de los cultivos KB
por un adenovector se realizó lo siguiente. Pasadas 24 h, se infectaron con el AdCMVlacZ cinco
de los seis pocillos de cada placa [titulación adenoviral=105 ufp/ml (unidades formadoras de placa
por ml)]. Debido a la velocidad de crecimiento celular, existían 1,5x105 células en cada pocillo en el
momento de añadir el adenovirus con lo que se alcanzó una MOI de 3,3x105 (MOI=Multiplicity of infection: multiplicidad de infección, que es el número de partículas virales infectivas con respecto al
número de células tumorales que infectar). Se
mantuvieron los cultivos a temperatura ambiente
durante 30 minutos y se retiró el sobrenadante. A
las 48 h, cuando es máxima la expresión del adenovirus, se tiñeron los pocillos con X-gal. El gen
lacZ codifica para la enzima glicosil hidroxilasa o
β-D-galactosidasa. Para detectar la actividad de
esta enzima y por tanto, constatar la expresión del
gen lacZ en las células transfectadas por el adenovirus recombinante, se empleó la tinción de Xgal. La enzima β-gal hidroliza el X-gal generando
indoxyl que al contacto con el aire se transforma
en índigo insoluble que tiene color azul. Por tanto,
las células teñidas de azul con X-gal son las transfectadas por el adenovirus recombinante.
El gen HSV-tk codifica para la enzima timidín-kinasa del virus H. simplex. Esta fosforila el ganciclovir (GCV) que, después de dos nuevas fosforilacio-
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nes, se incorpora en la síntesis del DNA celular, la
bloquea y la célula muere. Con el fin de estudiar el
efecto antitumoral de la transducción del gen suicida HVS-tk asociado a GCV en células KB, se llevó
a cabo el siguiente experimento. Se cultivaron 10 5
células KB en cada pocillo en 14 placas de 6 pocillos. Pasadas 24 horas, en 7 placas se vertieron
0,5 ml por pocillo de AdCMVtk y en las otras siete
0,5 ml por pocillo de AdCMVlacZ. La titulación de
ambos adenovirus era de 108 ufp/ml con lo que se
obtuvo una MOI de 3,3x102. A los 30 minutos se
retiró el sobrenadante y se reemplazó por medio
de cultivo fresco. A las 48 horas de la infección se
añadió GCV a diferentes concentraciones en los diferentes pocillos de cada placa: 500, 50, 5, 0,5 y
0,05 µM. A uno de los pocillos de cada placa no
se le aplicó GCV y sirve como control. Se aplicó
GCV durante 5 días consecutivos retirando el sobrenadante cada 24 h. Se contaron las células supervivientes de cada pocillo con el método de azul
de tripano. En cada placa se calculó el porcentaje
de células supervivientes de cada pocillo tratado
con GCV por comparación con las células contadas en el pocillo control que tienen una supervivencia del 100% por no haber sido expuestas al GCV.
Posteriormente se comparó el porcentaje de supervivencia de las células KB tratadas con
AdCMVtk/GCV entre las diferentes concentraciones
de GCV. En cuanto al análisis estadístico que se
realizó, después de comprobar que las varianzas
de los grupos que se comparaban eran homogéneas (test de homogeneidad de varianzas de Levene
no significativo) y de confirmar que les muestras no
se ajustan a una distribución normal (test de Shapiro-Wilks significativo), se empleó el test de KruskalWallis para la comparación de medias. Posteriormente se quiso estudiar entre qué concentraciones
de GCV existían diferencias. Para ello se realizaron
comparaciones múltiples que contrastaban todas
las concentraciones dos a dos mediante la aplicación del test U de Mann-Whitney (Se consideró el
valor p de significación exacta porque los tamaños
de las muestras son inferiores a 20).
Así mismo, se compararon los porcentajes de
supervivencia de las células tratadas con
AdCMVtk/GCV y las expuestas a AdCMVlacZ/GCV
para cada una de las concentraciones de GCV. El
análisis estadístico realizado fue el test paramétrico Prueba T si las muestras seguían una distribución normal (test Shapiro-Wilks no significativo) o
el test no paramétrico U de Mann-Whitney si las
muestras no seguían una distribución normal (test
Shapiro-Wilks significativo).
La experimentación in vivo se realizó en 40 ratones inmunodeficientes BALB/cByJ-Nude hem-
450
bras de seis semanas (Iffa-Credo, Barcelona) siguiendo las recomendaciones de una Directiva del
Consejo de Europa sobre experimentación animal
y el reglamento del Comité de Ética para la Experimentación animal de la Universidad de Navarra.
Su estabulación y manipulación durante el experimento se realizó en condiciones de esterilidad.
Tras anestesiar a los animales (hidrato de cloral
esterilizado diluido en suero fisiológico al 6%), se
les inyectó, en el suelo de la boca, células KB en
dos viales: uno en el lado derecho con 2x106 células y otro en el lado izquierdo con 1x106 células. Al
cabo de 10 días, los ratones habían desarrollado
dos tumores KB en el espacio celular subcutáneo
del suelo de la boca. Después de anestesiar los ratones y de exponer los tumores, a la mitad de los
animales se inyectó intratumoralmente el AdCMVtk
(5x109 ufp en 100µl) y a la otra mitad el AdCMVlacZ (2x109 ufp en 100µl). En los tumores del lado
derecho se inyectó 60 µl de solución del adenovirus correspondiente y en los del lado izquierdo 40
µl). A los tres días se inició la inyección de GCV
vía intraperitoneal durante 5 días consecutivos
(150/mg/kg/día en 200 µl de suero salino). Se sacrificaron los animales y se les extrajeron los tumores, el hígado, los riñones y la sangre.
Para valorar la transfección de tumores KB por
los adenovectores, a dos de los tumores a los que
se les había inyectado el AdCMVlacZ se incluyeron en OCT Comppound (Tissue-Tek) y se congelaron en nitrógeno líquido. Se cortaron con criostato en secciones de 6 µm y se tiñeron con X-gal.
El resto de tumores se fijaron en formol al 20%,
se incluyeron en parafina, se cortaron (7 µm), se
tiñeron con hematoxilina-eosina y se observaron al
microscopio óptico. Con el fin de objetivar el efecto
antitumoral de HSV-tk/GCV en tumores KB, se
cuantificó el volumen de necrosis y el volumen total, en cada pieza tumoral, con el método estereológico de estimación de volúmenes de Cavalieri.
Para esto, el objeto se secciona en intervalos paralelos, regulares y de grosor despreciable. Se eligen secciones del objeto de modo sistemático y
aleatorio. Se coloca una retícula de puntos sobre
cada sección y se cuentan los puntos incluidos
dentro de la estructura de interés. Como existe un
área asociada a cada punto de la retícula, el número de puntos se puede transformar en un área
de la estructura en la sección que se está estudiando. Así, el número de puntos contados en las
secciones del objeto seleccionadas, se multiplica
por el área asociado al punto y por la distancia
media que existe entre las secciones y de este
modo se estima el volumen3,4,5.
Así se calculó el porcentaje de volumen de ne-
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crosis con respecto al volumen total en cada tumor.
Luego se comparó este porcentaje entre el grupo
tratado con AdCMVtk/GCV y el control (expuesto a
AdCMVlacZ/GCV). Para efectuar este estudio, se
realizó un ANOVA I (análisis de la varianza de un
factor) una vez comprobado que las muestras siguen una distribución normal (test de Shapiro-Wilks
no significativo) y que existe homogeneidad de varianzas (test de Levene no significativo).
Para estudiar la toxicidad histopatológica hepática y renal, los hígados y riñones extraídos a los
ratones se fijaron en formol, se incluyeron en parafina, se seccionaron, se tiñeron con hematoxilinaeosina y se examinaron al microscopio óptico.
Para valorar la toxicidad hepática y renal desde
el punto de vista analítico, la sangre que se extrajo
se centrifugó (a 2500 rpm durante 15 minutos) en
tubos de laboratorio que contenían EDTA (ácido
edético). Como no se encontraron equipos específicos para ratones con los que realizar los análisis
bioquímicos que nos interesaban, se emplearon
las técnicas y aparatos que se utilizan en la clínica
diaria. Se determinaron los valores plasmáticos de
aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT), (basándose en técnicas de espectrofotometría) con el analizador BM/Hitachi 717
(Boehringer Mannhein Systems, Kenilworth, NJ,
USA). Los resultados se compararon con los valores de referencia en el ratón6.
También se hallaron los valores de urea en
plasma con el empleo del autoanalizador Synchron
CX3 (Beckman, Fullerton, CA, USA). Los valores
obtenidos se compararon con los valores de referencia en ratas7. (No se hallaron descritos valores de referencia de la urea en plasma de ratón).
Figura 1. Tinción de X-gal de los cultivos KB expuestos al
adenovirus recombinante portador del gen marcador lacZ
(AdCMVlacZ). Las células teñidas de azul expresan el gen lacZ
(presentan actividad β-galactosidasa), (X-gal x 20).
50-0,05, 5-0,05 (p=0,001) y en la comparación 505 (p=0,004). Sin embargo no se detectaron diferencias estadísticamente significativas en las comparaciones de 500-50 (p=1), 5-0,5 (p=0,073) y
0,5-0,05 (p=0,038). La supervivencia de las células
KB tratadas con AdCMVtk/GCV es inversamente
proporcional a la dosis de GCV (Fig. 2).
Según los resultados de los tests empleados
para la comparación de la supervivencia de los
cultivos tratados con AdCMVtk/GCV y con
AdCMVlacZ/GCV para las distintas concentraciones de GCV existen diferencias estadísticamente
significativas entre las distintas concentraciones
(p<0,05) excepto para las concentraciones 500 y
0,05 µM. La supervivencia de los cultivos tratados
%
100
RESULTADOS
Experimentos in vitro. Se constató la transfección de las células KB por los adenovirus mediante la tinción de X-gal que tiñe de azul las células
que tienen actividad β-galactosidasa, de lo que se
deduce que son células transducidas con el gen
marcador β-gal transportado por el adenovirus recombinante AdCMVlacZ (Fig.1).
Tras comprobar por el test de Kruskal-Wallis
que existían diferencias estadísticamente significativas (p=0,0001) en la supervivencia de las células
expuestas a AdCMVtk entre las diferentes concentraciones de GCV, se comparó la supervivencia
celular entre las diferentes concentraciones de
GCV (µM) dos a dos y se comprobó que existen
diferencias estadísticamente significativas en las
comparaciones 500-5, 500-0,5, 500-0,05, 50-0,5,
80
60
AdCMVtk
40
20
0
500 50
5
0,5 0,05
Concentraciones de GCV (µM)
Figura 2. Porcentaje de supervivencia de las células KB tratadas
con AdCMVtk asociado a diferentes dosis de GCV (500, 50, 5, 0,5,
0,05 µM). La supervivencia de los cultivos tratados con
AdCMVtk/GCV es inversamente proporcional a la dosis de GCV.
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con AdCMVtk/GCV es menor que la de los expuestos a AdCMVlacZ/GCV (excepto en 500 y
0,05 µM) (Fig. 3).
Experimentos in vivo. Se comprobó la transfección de los tumores KB por los adenovirus recombinantes con el empleo de la tinción de X-gal. Esta
identifica de color azul las áreas tumorales con actividad β-gal, es decir las transfectadas por el
AdCMVlacZ (Fig. 4).
En cuanto a la eficacia de la eliminación tumoral de la transfección del gen suicida HSV-tk y
GCV, el resultado del ANOVA I resultó significativo
(valor de P= 0,047). Por tanto, existen diferencias
estadísticamente significativas en cuanto al volumen de necrosis con respecto al volumen total,
entre el grupo de ratones tratado con
AdCMVtk/GCV y el que recibió AdCMVlacZ/GCV.
El volumen de necrosis tumoral con respecto al
volumen total es mayor en el grupo tratado con
AdCMVtk/GCV que en el expuesto a AdCMVlacZ/GCV (Fig. 5).
El estudio histológico de los cortes hepáticos y
renales de los ratones inmunodeficientes tratados
con AdCMVtk/GCV y los expuestos a AdCMVlacZ/GCV no reveló alteraciones. No se detectó
elevación de los niveles de AST, de ALT ni de
urea en el plasma de los ratones inmunodeficientes tratados con AdCMVtk/GCV y con AdCMVlacZ/GCV6-8.
DISCUSIÓN
%
100
80
60
AdCMVtk
AdCMVlacZ
20
0
500
50
5
0,5 0,05
Concentraciones de GCV (µM)
Figura 3. Porcentaje de supervivencia de las células KB tratadas
con AdCMVtk/GCV y expuestas a AdCMVlacZ/GCV para las
diferentes concentraciones de GCV (500, 50, 5, 0.5, 0,05 µM).
452
%
70
65
60
55
50
45
40
AdCMVtk
AdCMVlacZ
35
30
Se ha demostrado en diversos trabajos que los
adenovirus recombinates transfectan in vitro diferen-
40
Figura 4. Tinción con X-gal de un corte histológico de un tumor
KB al que se le inyectó el AdCMVlacZ. Las áreas transfectadas
por el adenovector son las teñidas de azul (X-gal x 4).
Figura 5. Gráfica que expresa la comparación de las medias de
los porcentajes de volumen de necrosis con respecto al volumen
tumoral total entre el grupo de tumores KB de los ratones
tratados con AdCMVtk/GCV y el expuesto al AdCMVlacZ/GCV.
tes líneas de carcinoma epidermoide de cabeza y
cuello. La transfección depende de la concentración
del adenovirus, de la línea celular9,10 y del grado de
diferenciación tumoral11. Por tanto nos propusimos
valorar la transfección adenoviral in vitro en la línea
celular KB de carcinoma epidermoide bien diferenciado de cavidad oral humano. Los resultados de
este estudio demostraron que los adenovirus recombinantes transfectan in vitro las células KB.
Así mismo se ha visto que la transferencia mediante vectores adenovirales del gen HSV-tk asociado a GCV en diferentes líneas de carcinoma
epidermoide de cabeza y cuello tiene efecto antineoplásico9,10,12. Con el fin de valorar este mismo efecto en cultivos celulares KB, comparamos el porcen-
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taje de supervivencia celular de los cultivos tratados con AdCMVtk y diferentes concentraciones de
GCV con el de los cultivos expuestos al adenovirus
recombinante marcador AdCMVlacZ y las mismas
concentraciones de GCV. La supervivencia fue menor en los cultivos KB tratados con AdCMVtk/GCV
que en los expuestos al AdCMVlacZ/GCV, excepto
en las concentraciones de GCV de 500 y 0,05 µM.
(En la concentración de GCV de 500 µM la falta de
diferencia significativa en la supervivencia puede
deberse a que, como la dosis de GCV es muy alta,
éste ejerza un efecto tóxico directo sobre los cultivos celulares independientemente de que se active
el profármaco (cultivos expuestos al AdCMVtk) o
no (cultivos expuestos al AdCMVlacZ). (En la concentración de 0,05 µM la falta de diferencias significativas en la supervivencia probablemente se deba a que es demasiado baja y la expresión del gen
HSV-tk no activa una cantidad de GCV suficiente
como para ocasionar una destrucción celular estadísticamente significativa).
Existen descritos diversos trabajos en los que se
demuestra la capacidad de los adenovectores de
transfectar tumores de carcinoma epidermoide de
cabeza y cuello desarrollados en ratones inmunodeficientes9,10,12-17. Como habíamos objetivado con anterioridad que la capacidad de los adenovectores de
transfectar in vitro células tumorales de carcinoma
epidermoide de cabeza y cuello depende del grado
de diferenciación celular 11, quisimos estudiar la
transfección por adenovectores in vivo de tumores
KB bien diferenciados (efectivamente se comprobó).
Los métodos que se emplean para la cuantificación de los cambios en el volumen tumoral después de la aplicación de tratamientos experimentales se basan en la medición tumoral con calibre y
en la aplicación de fórmulas matemáticas que representan la forma tumoral18,19. La exactitud de estos procedimientos está limitada por la escasa precisión de las mediciones con calibre y porque los
tumores no se ajustan a una forma geométrica
concreta. Por tanto, debido a nuestra experiencia
previa en técnicas de estereología, decidimos valorar el efecto antitumoral del tratamiento mediante
el método estereológico de estimación de volúmenes de Cavalieri. Consideramos que, para cuantificar el efecto antineoplásico de la inyección intratumoral del AdCMVtk asociada a GCV, se debía
valorar el porcentaje de volumen de necrosis con
respecto al volumen total en los tumores KB tratados con AdCMVtk/GCV y, seguidamente, compararlo con el porcentaje de volumen de necrosis
con respecto al total en los tumores KB expuestos
a AdCMVlacZ/GCV. De hecho se demostró que la
inyección en tumores KB del AdCMVtk, asociado a
GCV intraperitoneal, aumenta la proporción de necrosis intratumoral en comparación con la que se
observa en tumores KB a los que se les inyectó el
AdCMVlacZ asociado a GCV. Estos resultados
concuerdan con los de estudios similares10,16.
Hay que tener en cuenta que el procesamiento
histológico de las piezas tumorales ocasiona una
deshidratación y una disminución del volumen de
necrosis y total. Sin embargo, esto no afecta a los
resultados porque lo que consideramos es el volumen de necrosis con respecto al total en cada pieza tumoral. Además, este fenómeno afecta por
igual a los tumores del grupo tratado (con
AdCMVtk/GCV) y a los del grupo control (expuestos a AdCMVlacZ/GCV). Por tanto, la deshidratación no falsea los resultados.
Consideramos que tanto la inyección intratumoral de los adenovectores con genes suicidas como
la evaluación de la respuesta al tratamiento en los
carcinomas epidermoides de cabeza y cuello, son
relativamente asequibles debido a la localización
anatómica de los tumores. A la luz de los resultados de este experimento y teniendo en cuenta las
consideraciones previas, podría ser interesante
realizar ensayos clínicos en humanos con genes
suicidas para el tratamiento del carcinoma epidermoide de cabeza y cuello con el fin de evaluar su
toxicidad y efectividad.
En nuestro trabajo se valoró la toxicidad que
ocasiona la aplicación de AdCMVtk/GCV y
AdCMVlacZ/GCV en el modelo animal experimental. No detectamos alteraciones tóxicas hepáticas
ni histopatológicas ni analíticas. Sin embargo, hay
autores que han demostrado alteraciones hepáticas con el empleo de adenovectores que transportan el gen HSV-tk asociado a GCV en ratones inmumodeficientes e inmunocompetentes8,20-22. Se ha
visto que la toxicidad hepática depende de la vía
de administración20. De hecho en un estudio se detectó toxicidad analítica e histopatológica tras la
administración de AdCMVtk por vía portal e intravenosa. En este caso emplearon una dosis de
GCV más alta que la que hemos utilizado nosotros8. Nuestros resultados difieren de los de este
trabajo probablemente porque nosotros inyectamos el adenovector intratumoralmente (con lo que
se difunde menos por el organismo) y la dosis de
GCV administrada era más baja.
Quisimos valorar la toxicidad renal del tratamiento (histopatológico y analítico) porque el GCV
se elimina por el riñón. No detectamos alteraciones renales (ni histopatológicas ni analíticas) en
los ratones. Las cuantificaciones de los niveles de
AST, ALT y urea en el plasma de los ratones se
realizaron con las técnicas de análisis que se utili-
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zan en la práctica clínica porque no hallamos equipos específicos para ratones. Además, como los
volúmenes de plasma necesarios para realizar estos análisis son excesivos en comparación con el
volumen sanguíneo total del ratón, no era posible
extraer un volumen de sangre suficiente sin ocasionar su muerte, por lo que no se pudo valorar la
evolución de la toxicidad.
CONCLUSIONES
Según los resultados de este trabajo, se puede
concluir que las células KB de carcinoma epidermoide bien diferenciado de cavidad oral humano
son transfectadas por un vector adenoviral
(AdCMVlacZ) tanto si se mantienen en cultivo como
si forman tumores en ratones inmunodeficientes.
La activación del profármaco GCV por el gen
HSV-tk introducido en los cultivos celulares KB por
el vector adenoviral AdCMVtk, ocasiona una destrucción celular.
En función de los resultados de la fase experimental in vivo de este estudio, la inyección en tumores KB del adenovector que contiene el gen
HSV-tk asociada a la administración intraperitoneal
de GCV aumenta la proporción de volumen de necrosis con respecto al volumen total. Por tanto, la
transducción del gen HSV-tk en los tumores KB
asociada a GCV tiene un efecto antitumoral en la
línea celular KB.
Según los estudios de toxicidad llevados a cabo, el tratamiento con AdCMVtk/GCV y con
AdCMVlacZ/GCV en ratones inmunodeficientes con
tumores KB no genera toxicidad hepática ni renal
desde el punto de vista analítico ni histopatológico.
El modelo animal inmunodeficiente desarrollado
es viable y válido para el estudio de estrategias de
terapia génica con genes suicidas.
También podemos concluir que el método estereológico de estimación de volúmenes de Cavalieri
es válido, preciso y objetivo para la determinación
del efecto terapéutico de la terapia génica con genes suicidas en tumores desarrollados en ratones.
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