protocolo de extracción de células de sangre periferica

PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN SEPARACIÓ Y MARCAJE DE CÉLULAS DE
SANGRE PERIFERICA.
1. Extracción de sangre periférica de los pacientes.
2. Separación de células por gradiente de densidad. Se pone en un tubo Falcon
de 50ml un volumen de 10ml de Ficoll atemperado. En otro falco se ponen
10ml de sangre y se le añaden otros 10ml de solución salina. A continuación se
procede al montaje de de la sangre sobre el Ficoll. Se centrifuga a 2300 rpm
durante 30 minutos. Por último se extrae la banda PBMCs que es la que nos
interesa y se ponen en un Falcon que se rellena hasta 50ml con suero fisiológico
y se centrifuga a 1300 rpm durante 10 minutos, este proceso se vuelve a repetir.
Luego se resuspende el pelet en medio de cultivo, el volumen de medio
dependerá del tamaño del pelet. Hacemos el mismo procedimiento tanto para la
sangre control como para la del paciente de Artritis Reumatoide. Se ofrece un
video explicativo.
3. Conteo de células. Para saber la cantidad de células que tenemos vamos a
contar las células al microscopio con una cámara de Neubauer. Para ello vamos
a realizar una dilución 1/5 de las células con Tripan Blue, de esa dilución de
toman 20μl y se cargan en la cámara. Hacemos el mismo procedimiento tanto
para la sangre control como para la del paciente de Artritis Reumatoide. Se
ofrece un video explicativo.
4. Incubación de las células. Se ponen en placas, de 96 pocillos con fondo en U,
100μl por pocillo, 50000 células. De los pocillos con células de pacientes, a 8 se
les pusieron 100μl con medio completo y a otros 8 pocillos 100μl de PHA. Con
los pacientes se hizo lo mismo. El medio completo se preparó a una dilución
1/10 con RPMI y Suero Fetal Bovino. El PHA se prepara al 0,4% para que al
añadirlo a la placa, quede al 0,2%, la dilución se hace partiendo de una solución
madre de PHA y con medio de cultivo. La disposición de la placa es la
siguiente:
Medio
Completo
PHA
Medio
Completo
PHA
Tubos
1
2
3
4
Paciente
Control
5. Marcaje de células. En tubos Fas se ponen 100μl de células y otros 100 μl de
HEPES. Luego se procedió a marcar los tubos con los anticuerpos para CD3,
CD4, CD8, CD45RO, CD19, CD23 Y CD56, se puso 5μl de anticuerpo en cada
tubo, excepto del anticuerpo para CD8 en PE que se pusieron 3μl. Se prepararon
16 tubos, 8 tubos con células de paciente y otros 8 con células de control para la
situación basal, para 5 días después se prepararon 32, 8 con células en medio
completo y otros 8 con células en PHA, tanto para paciente como para control.
Se recomienda hacer una réplica por tubo y trabajar siempre en hielo. Se incuba
durante 20 minutos en oscuridad y a 4ºC. Después se centrifuga a 1300 rpm
durante 5 minutos, se tira el sobrenadante. Se añaden 100μl de HEPES y se
ponen 6μl de Anexina V, se incuba en la nevera y en oscuridad 15 minutos. 3-5
minutos antes de adquirir en el citómetro se añaden 100μl de 7AAD diluido en
HEPES. El marcaje se hizo en base a la siguiente tabla.
TUBOS
FL1
FL2
FL3
FL4
1
Anexina V
CD4
7-AAD
CD3
2
Anexina V
CD23
7-AAD
CD19
3
Anexina V
CD56
7-AAD
CD3
4
Anexina V
CD8
7-AAD
CD45 RO
FITC
PE
6. Adquirir en el citómetro de flujo.
APC