triquinelosis

CAPÍTULO 2.1.16.
TRIQUINELOSIS
RESUMEN
La triquinelosis del hombre está causada por el consumo de carne cruda o poco cocinada de
animales domésticos o de caza infectados por Trichinella. Los adultos sobreviven menos de dos
meses en el intestino delgado de la especie hospedadora, incluyendo al hombre, los cerdos, las
ratas, los osos, las morsas, ocasionalmente los caballos y en cualquier otro mamífero carnívoro, y
en las aves y los reptiles. Las larvas de Trichinella se localizan en los tejidos musculares de sus
hospedadores y los individuos susceptibles se infectan mediante la ingestión de tejidos que
contengan dichas larvas.
Identificación del agente: Las pruebas de diagnóstico para la triquinelosis se agrupan en dos:
1) la detección directa de la primera etapa de la larva enquistada o libre en tejido de músculo
estriado, y 2) la detección indirecta de la infección mediante pruebas para anticuerpos específicos.
Para detectar directamente la infección por Trichinella en los tejidos, se utilizan el método de
compresión y el método de digestión del tejido muscular. Las larvas de Trichinella normalmente se
localizan en los lugares preferidos de los músculos, sobre todo en las infecciones moderadas, y
esos lugares varían según la especie hospedadora. Es importante muestrear dichos lugares para
maximizar la sensibilidad. Por ejemplo, en los cerdos, son el diafragma, la lengua y los músculos
maseteros y abdominales, mientras que, en los caballos, los músculos de la lengua y los
maseteros hospedan la mayoría de los parásitos, seguidos por el diafragma y los músculos del
cuello.
Los métodos de digestión artificial incluyen la digestión enzimática de muestras de tejido muscular
individuales o agrupadas, y utilizan la homogeneización o trituración mecánica, la agitación y la
incubación. A continuación se aplican los procedimientos de filtración y sedimentación. Las
muestras procesadas con estos métodos se someten a un examen estéreomicroscópico para
comprobar la presencia de larvas. Mediante los métodos de digestión se puede detectar < 1 larva
por gramo (lpg) de tejido, pero en estos niveles de infección moderada la desigual distribución de
las larvas dentro de los tejidos constituye un factor limitativo. Eso se compensa mediante el ensayo
de muestras más amplias de las canales, tales como un mínimo de 1–5 g para cerdos y 10 g para
animales de caza y caballos. Estos métodos se recomiendan en la inspección individual de las
canales de los animales de abasto como los cerdos, los caballos y los animales de caza.
El método de compresión es menos sensible que la digestión artificial y no es recomendable como
prueba fiable para la inspección de las canales. Aunque actualmente está obsoleto, se utilizó
ampliamente en el pasado y aquí lo mencionamos por estudiarlos exhaustivamente. Consiste en
una inspección visual de piezas comprimidas de tejido muscular para comprobar la presencia de
las larvas “in situ”. Este método se puede llevar a cabo con un estéreomicroscopio o con un
microcopio especializado como el triquinoscopio, que tiene una eficacia estimada de detección de
como mínimo de tres larvas por gramo de tejido. Este método tiene la desventaja de que requiere
mucho tiempo para la inspección de múltiples muestras de cada canal. También es muy difícil
detectar las larvas de Trichinella sin cápsula (T. pseudospiralis, T. papuae y T. zimbabwensis). Las
técnicas de compresión solo son útiles para detectar medianas o grandes infecciones cuando se
necesita examinar unos pocos animales y las instalaciones no están preparadas para la prueba de
digestión artificial.
Pruebas serológicas: Las pruebas serológicas son las que con mayor frecuencia se utilizan para
la detección indirecta. La sensibilidad y la especificidad de los métodos serológicos dependen
sobre todo del tipo de la calidad del antígeno utilizado. La mayoría de los datos relativos a la
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realización (validación) de las pruebas serológicas provienen de su aplicación a los cerdos. Se
pueden producir resultados serológicos falsos negativos de tipo serológico hasta 3 semanas o más
después de que las larvas de los músculos se hacen infectivas en cerdos con una infección leve o
moderada. También se ha descrito un índice bajo de resultados positivos falsos en las pruebas
serológicas. Para efectuar una inspección individual de la canal, solo pueden recomendarse los
métodos directos. Para un seguimiento o verificación de las regiones libres de triquinas, son
aceptables los métodos serológicos. En los cerdos se han detectado niveles de 1 larva/100 g de
tejido. La especificidad del enzimoinmunoensayo (ELISA) para detectar la infección por Trichinella
está directamente relacionada con el tipo y la calidad del antígeno empleado en la prueba. Los
antígenos secretores que se han recogido manteniendo in vitro por breve tiempo (18–20 horas) las
larvas T. spiralis del músculo y los antígenos carbohidratados sintéticos, proporcionan actualmente
la fuente más específica y económica, aunque en algunos estudios se han obtenido índices bajos
de positivos falsos. Es de suma importancia la utilización de sueros control positivo y negativo
adecuados para asegurarse de que los ELISA se realicen con un grado de sensibilidad y
especificidad mínimamente aceptable. Se recomienda la digestión de 100 g o más de tejido como
prueba confirmativa para los animales serológicamente positivos.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: No existen vacunas adecuadas para
la infección por Trichinella en los animales de abasto. En los métodos (serológicos) directos de
detección, deben utilizarse antígenos adecuados a fin de lograr una correcta especificidad y
sensibilidad de la prueba. Estos antígenos pueden obtenerse a partir de productos secretores de
las larvas del músculo mantenidas in-vitro. Hay una necesidad perentoria de un banco internacional
de sueros de referencia para poder dotar de un estándar común a las pruebas serológicas para
Trichinella.
A. INTRODUCCIÓN
La triquinelosis del hombre está causada por la ingestión de carne cruda o poco cocinada de animales de abasto
o de caza (10. Los parásitosadultos, de breve vida, viven en el intestino delgado de las especies hospedadoras,
incluyendo al hombre, los cerdos, las ratas, los osos, las morsas, los caballos, muchos otros mamíferos
carnívoros, y algunos pájaros y reptiles. El parásito tiene un ciclo de vida directo. A las pocas horas de la
ingestión del músculo infectado por un hospedador adecuado, las primeras larvas del músculo son liberadas por
la digestión y comienzan a excavar surcos en las vellosidades del intestino delgado. Se convierten rápidamente
en adultas (hay machos que alcanzan hasta 1,8 mm de longitud y las hembras hasta 3,7 mm) y sobreviven
menos de 2 meses. Durante ese tiempo tiene lugar la cópula y las hembras, ovo-vivíparas, liberan las larvas
recién nacidas (LRN), que emigran por las vénulas y el sistema linfático hacia el sistema circulatorio general. Las
LRN se extienden por el cuerpo, invadiendo los músculos estriados y mostrando predilección por grupos
específicos de músculos. Por ejemplo, en los cerdos la lengua contiene la mayor concentración de larvas,
seguida por el diafragma; en los caballos, la mayor concentración se da en la lengua y en segundo lugar en los
músculos maseteros. Los sitios preferidos varían de una especie hospedadora a otra, pero, en general, la lengua,
los músculos maseteros y el diafragma son los lugares óptimos para el muestreo. Actualmente se dispone de
información sobre la localización preferida de varias especies de hospedadores (22). En los casos de infección
grave, la mayor parte de los músculos voluntarios contienen cantidades elevadas de larvas. Las larvas de casi
todas las especies de Trichinella se envuelven en colágeno dentro de la musculatura del hospedador, donde
permanecen infectivas durante años.
Dentro del género Trichinella, se han identificado once genotipos, a ocho de los cuales se les ha asignado la
categoría de especie (10, 21, 27). Trichinella spiralis (T-1) se distribuye en zonas templadas de todo el mundo y
se asocia comúnmente con los cerdos domésticos. Es muy infecciosa para los cerdos domésticos y los salvajes,
ratones y ratas, pero también puede detectarse en otros mamíferos carnívoros. Trichinella nativa (T-2) se
presenta en los mamíferos carnívoros del ártico y de las regiones árticas de Norteamérica, Europa y Asia.
Trichinella britovi (T-3) se encuentra principalmente en los animales salvajes y ocasionalmente en los cerdos o
los caballos. Se da en regiones templadas de Europa y Asia y en el norte y occidente de África. Trichinella
pseudospiralis (T-4) tiene una distribución cosmopolita y ha sido recuperada de las aves de rapiña, de los
carnívoros salvajes y de los omnívoros, ratas y marsupiales, en Asia, Norteamérica, Europa y Australia. A
diferencia del resto de los genotipos de Trichinella, la T-4 no aparece envuelta en una cápsula de colágeno en el
músculo. Trichinella murrelli (T-5) se encuentra en los mamíferos carnívoros de Norteamérica. Tiene una
infectividad baja en los cerdos domésticos, pero representa un riesgo para los humanos que consumen carne de
animales de caza. La Trichinella T-6 está adaptada a los climas fríos y parece que está estrechamente asociada
con T. nativa en el norte de Norteamérica (27). T. nativa y T-6 son muy resistentes a la congelación. Tienen una
infectividad limitada en los cerdos. Trichinella nelsoni (T-7) se ha aislado de los mamíferos carnívoros y, de forma
esporádica, de los cerdos salvajes en el éste de África. Se ha detectado Trichinella T-8 en mamíferos carnívoros
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de Namibia y Sudáfrica, y Trichinella T-9 en mamíferos carnívoros de Japón (27). T-8 y T-9 tienen rasgos
intermedios con T. britovi y T. murrelli, respectivamente. Al igual que ocurre con T. pseudospiralis, T. papuae (T10) y T. zimbabwensis (T-11) son parásitos no encapsulados del músculo. Se ha informado sobre la presencia de
Trichinella papuae en los cerdos domésticos y salvajes, en cocodrilos de granja y en el hombre en Papúa Nueva
Guinea. Se ha descrito Trichinella zimbabwensis en cocodrilos salvajes y de granja en Zimbabwe, Etiopía y
Mozambique, y en el lagarto monitor de Zimbabwe. Según los experimentos realizados, muestra una gran
infectividad en un amplio espectro de hospedadores mamíferos, incluidos los cerdos y las ratas (27). Todas las
especies y los genotipos de Trichinella causan la enfermedad en el hombre.
La triquinelosis en los humanos puede ser una enfermedad debilitadora que puede ocasionar la muerte. Los
parásitos adultos, de vida corta, en el intestino delgado, pueden causar gastroenteritis temporal, pero las señales
y síntomas más graves se producen como resultado de la migración y presencia de las larvas en los músculos
voluntarios. La enfermedad se transmite por comer carne infectada que no ha sido suficientemente cocinada (o
con cualquier procedimiento seguro). Para prevenir la infección en el hombre es necesario inspeccionar la carne
procesándola (bien sea cocinándola, congelándola o curándola) y evitando el contacto de los animales
comestibles con carne infectada, incluyendo los desperdicios de la comida sin cocinar, con roedores y con otros
animales salvajes (10, 12 y 13). La carne procedente de la caza debería considerarse siempre como una fuente
potencial de infección y, por tanto, dicha carne debe ser controlada o cocinada cuidadosamente. La Trichinella
que se encuentra en la carne procedente de la caza (principalmente T. nativa, T-6 y, en menor grado, T. britovi)
puede ser resistente a la congelación y, por lo tanto, la carne de animales de caza congelada que no se haya
sometido a análisis puede también representar un riesgo para la Salud pública.
Los métodos de prueba para la detección de la infección por Trichinella en los cerdos y otras especies o bien
sirven (a) para detectar directamente el parásito en las muestras de tejido o (b) o para demostrar de forma
indirecta, la presencia del parásito mediante el uso de métodos inmunológicos para detectar anticuerpos
específicos frente a Trichinella spp. en las muestras de sangre, suero o líquido tisula.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente (prueba prescrita para el comercio internacional)
Los únicos procedimientos recomendados para la detección de las larvas de Trichinella en la carne son las
pruebas de digestión. En varios países se reconoce oficialmente un cierto número de pruebas de digestión con
fines comerciales. La Comisión Internacional para Triquinelosis (CIT) recomienda varias de estas pruebas, que
constituyen estándares documentados en la UE, Canadá y EE. UU. Sin embargo, otros métodos oficiales no
utilizados de forma rutinaria en la actualidad no se recomiendan debido a su nula eficacia o fiabilidad. Las
pruebas de diagnóstico modernas deben cumplir con las normas internacionales sobre garantía de calidad, que
incluyen datos de validación con una base científica y un diseño que permita el control rutinario y la
documentación de los principales puntos de control. Aunque generalmente se considera que la prueba de la
digestión es el mejor procedimiento, aún se carece de un protocolo para dicha prueba universalmente aceptado
para fines comerciales y de seguridad alimentaria. La prueba de la digestión aquí recomendada se basa en las
interesantes innovaciones inherentes a algunas pruebas de digestión que se han adoptado para el comercio
internacional.
a)
Procedimiento directo recomendado para analizar la carne
Sensibilidad: La sensibilidad de los métodos de prueba directos depende de la cantidad de tejido examinado
y del lugar del que se ha obtenido la muestra. Los métodos directos permitirán la identificación de cerdos,
caballos u otros animales infectados por T. spiralis en un plazo mínimo de 17 días después de la exposición
al parásito, intervalo que coincide con el tiempo necesario para que las larvas alojadas en los músculos,
adquieran la capacidad de infectar a un nuevo hospedador. Los métodos directos continúan siendo
efectivos siempre y cuando las larvas permanezcan viables. Con el fin de asegurar la viabilidad de las
triquinas, las muestras de tejido no deben guardarse durante largos periodos de tiempo ni congelarse antes
de ensayarse. Los métodos actuales para la prueba de la digestión artificial mediante el empleo de una
muestra de 1 g tienen una sensibilidad de aproximadamente tres larvas/g de tejido, y el ensayo de una
muestra de 5 g aumenta la sensibilidad a 1 larva por g de tejido (13, 22). La sensibilidad de esta prueba
aumenta considerablemente cuando grandes cantidades de tejido (hasta 100 g) están disponibles para la
digestión
Muestreo: Las pruebas se realizan normalmente en muestras de las canales recogidas post mórtem. Las
muestras de los músculos se toman de los sitios predilectos, normalmente de los pilares del diafragma o de
la lengua de los cerdos, o de la lengua o los músculos maseteros de los caballos. El tamaño de la muestra
puede variar; se pueden tomar muestras individuales de 100 g de un animal, o se pueden tomar varias
muestras de menor tamaño de varios animales para hacer un agrupamiento de 100 g. El tamaño de las
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Capítulo 2.1.16. — Triquinelosis
muestras que componen este agrupamiento determinará la sensibilidad del método. La CIT recomienda
muestras de 5 g por cerdo para las pruebas en áreas endémicas. Para analizar la carne de caballo, se
requiere un mínimo de 5 g por canal. Para los caballos procedentes de áreas endémicas, se recomienda
utilizar una muestra de 10 g.
•
Digestión y detección
i)
Se determina el volumen de la solución digestiva requerida para la digestión (2.000 ml de la solución
para 100 g de carne y 1.000 ml para 50 g o menos).
ii)
Solución de digestión: Se prepara un volumen apropiado de una solución de HCl al 37% /agua (0,55%
v/v HCl al 37%) combinando el HCl con agua del grifo (p.ej. 11 ml de HCl al 37% con 1.989 ml de
agua). No se añade pepsina a la solución en ese momento. Se debe precalentar esa solución a 45°C
antes de su uso.
iii)
Se retira tanta grasa y fascia como sea posible de cada muestra de carne.
iv)
Se pesa la cantidad adecuada de carne magra de cada muestra. Se corta cada muestra en trocitos de
1–2 g y se mezclan con otras muestras hasta lograr una cantidad de 100-g.
v)
Se coloca la muestra de carne agrupada en un triturador. Se añaden 50–100 ml de la solución
agua/HCl para la mezcla de una muestra de 100 g.
vi)
Se pica la carne en el triturador hasta que esté homogeneizada (no deben quedar trocitos enteros de
carne; la muestra debe tener la consistencia de un puré para bebés). Esto se logra normalmente con
varias pulsaciones de 1–3-segundos. Se añaden aproximadamente 100 ml de la solución preparada de
agua/HCl y se mezcla hasta que la mezcla tenga una textura líquida uniforme. Eso puede requerir 5–
10 segundos (es posible que sea necesario añadir más solución).
vii)
Se esparcen 10 g de pepsina (1:10.000 NF/1:12.500 BP/2.000 FIP; a ser posible en forma granular)
sobre el homogeneizado, se añaden unos 200 ml de solución agua/HCl, y se mezcla durante unos
5 segundos.
viii) Se transfiere la muestra homogeneizada a una cubeta de 3 litros que contenga un agitador. Se añade
el resto de los 2 litros de solución agua/HCl vertiéndolos en el triturador y se aclara todo el
homogeneizado residual introduciéndolo en la cubeta de 3 litros. Se aclara cualquier material adherido
a la tapa del triturador y se introduce el agua con los restos del aclarado en la cubeta utilizando 10–
20 ml de solución digestiva mediante un frasco con eyector.
ix)
Se coloca la cubeta en la plancha precalentada de un agitador magnético o en una cámara de
incubación dispuesta a 45±2°C. Se cubre la cubeta con papel de aluminio. Se activa el agitador a una
velocidad lo bastante alta para crear un vórtex potente que no salpique. Nota: Si la temperatura de
digestión al comienzo de la digestión no es 45±2°C, debe permitirse que la muestra se caliente a esa
temperatura antes de iniciar el cronometraje de la digestión.
x)
Se deja que continúe la digestión durante 30 minutos. Si la temperatura de digestión desciende por
debajo de 45±2°C, puede que sea necesario un tiempo adicional para completar la digestión. Eso se
puede decidir previa observación de la mezcla de la digestión. Si se observan trozos de tejido
muscular, no digeridos, la digestión debe prolongarse otros 30 minutos o hasta que esos trozos se
digieran. Hay que asegurarse de no sobrepasar la temperatura de digestión. Como alternativa, puede
realizarse la digestión a 37°C durante un mayor periodo de tiempo.
xi)
No más tarde de 5 minutos después de retirar el líquido de digestión de la plancha del agitador
magnético, se vierte aquel, a través de un filtro de malla de 177–180 µm, en un embudo de separación
de dos litros. Se aclara la cubeta con agua del grifo a temperatura ambiente utilizando una frasco con
eyector y se introducen los restos aclarados en un embudo de separación de 2 litros a través del tamiz.
xii)
Se aclara el tamiz sobre el embudo de separación de 2 litros, con un chorro de agua del grifo a
temperatura ambiente vertido sobre el tamiz. No deberían quedar trozos de músculo no digeridos
sobre el tamiz, aunque pueden quedar restos de grasa, fascia y otros tejidos. Se deja que el líquido del
embudo de separación se sedimente durante 30 minutos.
xiii) Se escurren 40 ml del líquido de la digestión del embudo separador en un tubo cónico o en un cilindro
medidor (frasco Pilsner) de 50 ml y se deja durante 10 minutos.
xiv) Transcurridos los 10 minutos, se usa una pipeta para retirar 30 ml de la parte superior del líquido (o
sobrenadante), dejando en el tubo los 10 ml del fondo (no se deben derramar los 30 ml del
sobrenadante, ya que eso puede remover el sedimento).
xv)
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Se remueven con suavidad los 10 ml de líquido restantes y se transfieren rápidamente a una placa de
Petri con una rejilla o a una bandeja para recuento de larvas. Se aclara el tubo o cilindro sobre una
placa de Petri dos veces usando 5ml de agua del grifo cada vez. La capa líquida de la placa de Petri
debe tener una profundidad de solo unos pocos milímetros.
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xvi) Ha de esperarse un mínimo de 1 minuto para que las larvas se depositen en el fondo, luego se utiliza
un estéreomicroscopio a 10–16 aumentos a fin de examinar de forma sistemática cada rejilla de la
placa de Petri para detectar la presencia de larvas de Trichinella. La detección de larvas sospechosas
en ese examen sistemático debe confirmarse mediante la identificación de detalles morfológicos
utilizando un aumento mayor, por ejemplo 40 aumentos. Si el sedimento está turbio o es difícil de
analizar, se procederá a una clarificación adicional como se describe más adelante.
xvii) Los productos de la digestión deben analizarse tan pronto como estén listos. En ningún caso debe
posponerse el análisis de los productos digeridos para el día siguiente.
xviii) Si los productos de la digestión no se examinan antes de que transcurran 30 minutos después de su
preparación, es posible que haya que clarificarlos cono se describe más adelante.
xix) Clarificación de la muestra: se transfiere el contenido de la placa de Petri a un tubo cónico de 50 ml
utilizando una pipeta. Se aclara la placa de Petri con agua del grifo, añadiendo el agua del aclarado al
tubo cónico. Se añade más agua hasta completar un volumen de 45 ml. Se deja que el tubo se
sedimente, sin remover, durante 10 minutos.
Después de los 10 minutos se utiliza una pipeta para retirar el sobrenadante, dejando los 10 ml del
fondo (no se debe derramar el sobrenadante, ya que eso podría alterar el sedimento). Se guarda el
líquido retirado para su eliminación o descontaminación una vez se haya leído la muestra.
Se repiten los pasos (xv) y (xvi).
xx)
En caso de un resultado positivo o dudoso, debe tomarse una muestra adicional de cada canal para
completar la muestra agrupada. Esas muestras deben ensayarse individualmente o en grupos
sucesivos más pequeños hasta que se puedan identificar los animales individuales infectados.
Identificación de las larvas: Una vez separadas por digestión de la célula muscular, las larvas de la primera
fase del ciclo tienen aprox. 1 mm. de largo y 0,03 mm. de ancho. El rasgo más característico de las larvas
de Trichinella es el esticosoma, formado por una serie de células discoides que, dispuestas a lo largo del
esófago, ocupan la mitad anterior del cuerpo del parásito. Las larvas de Trichinella pueden aparecer
enroscadas (a baja temperatura), móviles (a temperatura templada) o en forma de una C (media luna)
(cuando están muertas). En caso de duda, las larvas deberían observarse con un mayor aumento y
deberían examinarse más tejidos. Si el recuento es elevado, deberá repetirse la prueba llevando antes la
muestra a una dilución apropiada.
•
Garantía de calidad
Los laboratorios que utilicen métodos de digestión artificial deben mantener un sistema de garantía de
calidad apropiado para garantizar la sensibilidad de la prueba. Los componentes de un sistema de garantía
de calidad para la prueba de digestión están descritos por la Comisión Internacional para la Triquinelosis
(CIT) (13) y en otros lugares, y deben incluir el uso regular de pruebas de suficiencia (7, 8).
b)
Otras pruebas
•
Otros métodos de detección directa
i)
El método del embudo de separación doble: Esta prueba se recomienda como alternativa del
procedimiento de digestión común descrito anteriormente, y está autorizado por la UE para su
utilización con fines de exportación. El método se diseñó para su aplicación bajo condiciones estrictas
de control de calidad, para minimizar el los errores técnicos, y se ha validado ampliamente para su
utilización con la carne de cerdo y de caballo (5).Incluye una técnica de digestión con un spin-bar y
embudos de separación secuencial para la sedimentación de las larvas. El procedimiento tiene pocas
fases, requiere menos tiempo y apenas necesita fases de clarificación adicionales. Para realizar la
digestión se utiliza una cámara de incubación equipada con puertas de cristal transparente y con una
temperatura de 45°C. La digestión se realiza en 3 litros de líquido de digestión en un agitador
magnético. Tras la digestión, se cuela la suspensión en un embudo de separación de 4 litros a través
de una malla de filtro de 177–180 µm, que se aclara meticulosamente con agua del grifo hacia el
interior del embudo de separación. Se deja que la suspensión se sedimente durante 30 minutos y se
escurren 125 ml en un embudo de separación de 500 ml. Se aumenta el volumen hasta 500 ml
añadiendo 375 ml de agua del grifo, y se deja que la suspensión resultante se sedimente durante
10 minutos más. Finalmente, se escurren 22–27 ml de sedimento en una placa de Petri y se examina
para comprobar la presencia larvas como se describió anteriormente.
ii)
Método de digestión de una muestra agrupada asistido mecánicamente técnica de sedimentación
(Método 4: 84/319/EEC): En este método se utiliza un triturador Stomacher para la fase de digestión y
un embudo de separación para la sedimentación de las larvas (3).
iii)
Reacción en cadena de la polimerasa: Algunos estudios han puesto de manifiesto que se puede
utilizar la PCR para detectar el ácido nucleico de las larvas en la musculatura de los animales
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infectados. Sin embargo, carece de sensibilidad y no es práctico para el uso rutinario en animales de
abasto. La identificación de las especies o los genotipos de Trichinella recuperados del tejido muscular
puede ser útil para entender la epidemiología de los parásitos en animales, para evaluar el riesgo
relativo de la exposición humana y para rastrear la granja en la que se haya originado la infección. Se
han desarrollado cebadores específicos que permiten la identificación de la especie y el genotipo de
las larvas individuales, tomadas de tejidos musculares, mediante la PCR (25). La solicitud para aislar o
genotipificar las larvas de Trichinella puede hacerse a través del Laboratorio de Referencias de la OIE
en Roma, Italia, o en Saskatoon, Canadá (véase el cuadro en la parte 3 del Manual de la Pruebas
disgnóstico y de la vacunas para los Animales Terrestres (www.iss.it/Trichinella/index/asp).
•
•
Métodos de detección directa no recomendados para la inspección de la carne
i)
Triquinoscopía: Este método implica la compresión de múltiples trozos de tejido muscular de 2 ×
10 mm entre dos placas de vidrio (compressorium) hasta que se vuelven translúcido, seguida de un
examen al microscopio (2). Aunque este método se ha utilizado durante décadas, es laborioso y se
dispone de datos comparativos según los cuales no es tan sensible como los ensayos de digestión (6).
Un aumento del tamaño de la muestra para compensar ese déficit no práctico cuando se han de
probar en grandes cantidades de animales, y la Trichinella spp. no encapsulada (T. pseudospiralis,
T. papuae y T. zimbabwensis) puede presentarse sin enroscamiento fuera de las células musculares,
lo que dificulta su detección mediante la triquinoscopía. Debido a esas limitaciones, no se recomienda
la triquinoscopía ni otros métodos de compresión para el análisis rutinario de las canales.
ii)
Trichomatic 35: en este método se utilizan una cámara de digestión automatizada y un filtro de
membrana para la recuperación y el análisis de las larvas. Los pasos fundamentales para la digestión
y el proceso de recuperación son difíciles de monitorizar en este sistema, y la capacidad de la prueba
es de solo 35 g.
Métodos inmunológicos
Se han descrito una serie de pruebas para el diagnóstico de la triquinelosis en los animales domésticos y
salvajes (17). Los métodos incluyen la prueba de inmunofluorescentia (IFA), blot de inmunoelectrotransferencia (IEBT), western blot, pruebas de inmunohistoquímica enzimática, y el
enzimoinmunensayo (ELISA). Con la excepción del ELISA, estas pruebas no han sido estandarizadas y no
se dispone de reactivos para uso rutinario. No obstante, la CIT ha ofrecido un conjunto uniforme de
recomendaciones para la elaboración y el uso de las pruebas serológicas para la detección de anticuerpos
en circulación (17). El ELISA es la única prueba avalada por la CIT. Está autorizado solamente como
herramienta de vigilancia para la detección de anticuerpos anti-Trichinella en los cerdos; no es fiable para la
detección de la infección por Trichinella en animales individuales.
2.
Pruebas serológicas
Aunque otras pruebas serológicas pueden tener algunas aplicaciones prácticas, el ELISA es reconocido
generalmente como el método preferido por ser económico, fiable y adaptable a las prácticas de buena calidad, la
existencia de una cantidad cada vez mayor de datos de validación por su buena sensibilidad y especificidad
cuando se aplica en condiciones adecuadas. Es un instrumento útil para llevar a cabo en poblaciones y se utiliza
de forma rutinaria para los programas de vigilancia y las investigaciones de los focos de la enfermedad. Sin
embargo, por las razones que se exponen más adelante, no se recomienda el ELISA parautilizarlo
individualmente a los cerdos con fines de seguridad alimentaria.
a)
Enzimoinmunoensayo (ELISA)
•
Sensibilidad y especificidad
En cerdos se pueden detectar niveles de infección muy bajos (11), de una larva por 100 g de tejido,
mediante los ensayos ELISA. Este alto nivel de sensibilidad hace de la prueba serológica mediante el
ensayo ELISA un método útil para la detección de la transmisión de la infección por Trichinella en las
granjas o para los programas de seguimiento más amplios. Una desventaja de la serología en la detección
de la triquinelosis es la incidencia de la baja tasa de resultados negativos falsos que se han observado en el
caso de los animales infectados. Tales resultados se deben a un desfase en la cinética de las respuestas de
los anticuerpos en los animales ligera o moderadamente infectados por la T. Spiralis o por las especies de
Trichinella silvestre. Esta baja tasa de producción de anticuerpos significa que los animales infectados no
pueden detectarse hasta 3–5 semanas después de la exposición (9, 13). Eso se debe sobre todo, al retraso
en la respuesta inmune tras la ingestión de las larvas. Normalmente no se presentan niveles detectables de
anticuerpos en los cerdos hasta después de 3–5 semanas o más después de la exposición (11, 14). Por
esta razón, las pruebas serológicas no son recomendables en las pruebas con canales individuales. Las
respuestas serológicas persisten en los cerdos durante un largo período después de la infección sin
disminución del título; sin embargo, se ha detectado la disminución de anticuerpos en los caballos a los
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pocos meses de la infección (22). Las pruebas serológicas pueden ser poco útiles en los caballos, ya que
los títulos de anticuerpos terminan por descender por debajo de los niveles de diagnóstico a pesar de la
presencia de larvas infectantes en los músculos (19, 26) Es poco lo que conoce acerca de las respuestas
de los anticuerpos a la infección por Trichinella en las especies de caza, pero deben obtenerse muestras de
suero de gran calidad con el fin de disminuir la probabilidad de reacciones positivas falsas.
•
Muestras
La utilización del ELISA para detectar la presencia de los anticuerpos específicos del parásito propicia un
método que puede realizarse en suero, en sangre o en líquido de tejidos recogidos antes o después del
sacrificio (15). La dilución utilizada para el suero es diferente de la utilizada para el líquido de tejidos (23).
•
Antígenos
La especificidad y sensibilidad del ELISA depende en gran medida de la calidad del antígeno utilizado en la
prueba. Los antígenos que se secretan específicamente de los esticocitos de las larvas L1 vivas y contienen
el epítopo de carbohidrato del TSL-1 son reconocidos por los animales infectados por Trichinella. Los
antígenos reconocidos en los productos ES de las lombrices constan de un grupo de glicoproteínas
estructuralmente relacionadas con pesos moleculares de 45–55 kDa (24). En el ensayo ELISA también se
ha utilizado un antígeno de carbohidrato sintético (tivelosa). Algunos estudios realizados con cerdos indican
que el antígeno de tivelosa puede ser tan bueno como el antígeno ES para las pruebas de vigilancia en los
cerdos; sin embargo, la sensibilidad del ELISA en el que se utiliza el antígeno sintético es más baja que la
del ELISA con antígenos ES (4, 18). Se han desarrollado varias preparaciones de antígenos que
proporcionan un alto grado de especificidad para la infección por Trichinella en cerdos (16). Los antígenos
secretores (ES) de la T. spiralis usados en el ensayo ELISA se conservan en todas las especies y genotipos
de Trichinella (24), y, por tanto, la infección puede detectarse en cerdos o en otros animales que hospedan
alguna de las ocho especies
•
Producción de antígeno
El diagnóstico de la infección por Trichinella mediante el ELISA se puede realizar utilizando antígenos del
esticosoma recogidos de los productos ES de las larvas de Trichinella en cultivo (16). A efectos de
estandarización, es recomendable que T. spiralis se utilice para la producción de antígeno para las pruebas
con animales de abasto. Sin embargo, se ha demostrado que el antígeno preparado de cualquier otra
especie de la Trichinella puede usarse para la detección de anticuerpos en animales infectados
independientemente de cuál sea la especie que produce la infección (20). Los parásitos que van a usarse
en la preparación de antígeno deben ser mantenidos por pases en serie en ratones y ratas.
Para preparar el antígeno que se va a utilizar en los ensayos ELISA (16), se recuperan las larvas de
T. spiralis (T-1) en estadio muscular de las canales de ratones de campo o de ratas sin piel ni vísceras
mediante la digestión en pepsina al 1% con HCI al 1% a 37oC durante 30 minutos (como se ha descrito
anteriormente). Se lavan las larvas (3 veces durante 20 minutos cada vez) en medio Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM) con penicilina (500 unidades/ml) y estreptomicina (500 unidades/ml). Luego se colocan
(a una densidad de 5.000 L1/ml) en DMEM suplementado con HEPES (hidroxietilpiperazina N-2, ácido
etanesulfónico N-2) (10mM), glutamina (2mM), piruvato (1mM) y penicilina (250 unidades/ml) /
estreptomicina (250 µg/ml) (DMEM completo) a 37°C en atmósfera con un 10% de CO2 . El medio de cultivo
se recupera después de 18–20 horas, se retiran los vermes mediante filtración y el fluido se concentra a
presión mediante una membrana de retención de un peso molecular de 5.000 Da. Los antígenos (ES) así
recuperados pueden almacenarse congelados durante cortos períodos a –20°C o por más tiempo a –70°C;
estos antígenos contienen aproximadamente 25 componentes proteicos según SDS/PAGE (sulfato dodecil
de sodio / electroforesis en gel de poliacrilamida), muchos de los cuales admiten la diagnosis del epítopo de
antígeno de carbohidrato TSL-1.
La pureza del antígeno es fundamental para la especificidad del ensayo ELISA. Deben seguirse varios
pasos para monitorizar el crecimiento de las bacterias, bien sea de forma visual con el microscopio o
recubriendo una muestra de medio. Los cultivos que muestren cualquier crecimiento bacteriano deben ser
desechados. Las larvas no deberían mantenerse más allá de 18 horas; el deterioro de las lombrices
después de este tiempo contribuye al escape de antígenos somáticos que reducen la especificidad de la
prueba. Los antígenos producidos en la forma descrita deberían tener una gama (ratio) de absorbancia
280:260 nm de >1.0. Los antígenos obtenidos a partir del mantenimiento in-vitro de las larvas de la
Trichinella deben ensayarse frente a un panel de sueros positivos y negativos conocidos antes de usarse.
•
Procedimiento de la prueba
Más adelante se expone un ejemplo de un ensayo ELISA para detectar la infección por Trichinella en
cerdos. Es esencial que todos los reactivos usados en el ensayo estén estandarizados para una
concentración óptima con el fin de obtener resultados fiables. Los valores típicos se indican en el ejemplo.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 2.1.16. — Triquinelosis
i)
Se cubre la placa de microtitulación de 96 pocillos con 100 µl de antígenos ES de T. spiralis diluidos a
5 µg/ml en agua tamponada (50 mM de carbonato/bicarbonato tamponado, pH 9,6). Se realiza la
cobertura durante 60 minutos a 37°C o toda la noche a 4°C.
ii)
Se lavan tres veces los pocillos cubiertos con antígeno en tampón de lavado que contenga 50 mM
Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5% de leche desntada en polvo y 1,0% de Triton X-100. Después de cada
lavado, las placas se deben secar.
iii)
Se diluye a 1/50 o 1/100 suero de cerdo en tampón de lavado. Las fuentes alternativas de anticuerpos
que pueden usarse en lugar de los sueros son, entre otros, la sangre total o los fluidos de tejidos a una
dilución de 1/5 o 1/10 (23). Se agregan 100 µl de suero diluido a los pocillos cubiertos con antígeno.
Debe usarse en cada placa una muestra de suero positivo conocida y una muestra de suero negativo
conocida con una dilución idéntica a la de los sueros de la prueba. Se incuban a temperatura ambiente
durante 30 minutos.
iv)
Se lavan tres veces los pocillos como en el apartado ii.
v)
Se añade a cada pocillo 100 microlitros de una IgG (inmunoglobulina G) anticerdo obtenida en conejo,
purificada por afinidad y conjugada con peroxidasa a una dilución apropiada en tampón de lavado, por
ejemplo, una dilución 1/1.000 de IgG de conejo anticerdo (0,1 mg/ml) producido por Kirkegaard and
Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, USA. Tras añadir el segundo anticuerpo, se incuban las
placas durante 30 minutos a temperatura ambiente.
vi)
Se lavan tres veces los pocillos como en el apartado (ii) y se enjuagan una vez con agua destilada.
vii)
Se añaden 100 µl de un sustrato de peroxidasa apropiado (por ejemplo, ácido aminosalicílico-5’
[0,8 mg/ml] con 0,005% de hidrógeno de peróxido, pH 5,6–6,0).
viii) Después de 5–15 minutos, se leen las placas para ver la densidad del color a 450 nm en un lector de
microtitulación automático. Los valores obtenidos de los ensayos ELISA, que son cuatro veces
superiores a los de los controles agrupados de suero normal, se consideran positivos. Los valores tres
veces mayores que los normales se consideran sospechosos.
Existen adaptaciones comerciales del ensayo ELISA. El fabricante debe validar el equipo antes de la
concesión de la licencia y el usuario debe también evaluar el funcionamiento del equipo antes de su uso
mediante la utilización de muestras de referencia positivas y negativas.
La prueba debe aplicarse en un ambiente en el que se cumplan las normas de gestión de calidad aceptadas
internacionalmente, como la ISO 17025.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO.
No existen vacunas frente a la triquinelosis en los animales de abasto ni en los de caza. No existen productos
biológicos establecidos para la detección directa del parásito. Para los métodos inmunológicos aplicables, se
recomiendan los antígenos TSL-1, a fin de maximizar la especificidad de la prueba. Estos antígenos pueden
obtenerse como productos ES recuperados mediante el mantenimiento de las larvas del músculo in-vitro como se
ha descrito anteriormente.
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* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la triquinelosis (véase el cuadro de la parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consúltese la lista más actualizada en la página web de la OIE: www.oie.int).
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