TÉCNICAS DE TINCIÓN

TÉCNICAS
DE
TINCIÓN
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TÉCNICAS DE TINCIÓN
ÍNDICE
1. Introducción
2. Tipos de tinciones
2.1. Tinción de Gram
2.2. Tinción ácido – alcohol resistencia
2.3. Tinción de esporas
2.4. Tinción negativa
3. Precauciones
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1. Introducción
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de
ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste
entre la célula y el medio que la rodea es la utilización de colorantes. Estos pueden
emplearse también para localizar estructuras específicas en la célula o para
distinguir entre tipos diferentes de células.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de
teñirlas, proceso llamado fijación. Para las bacterias la fijación por el calos es lo
más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como
formaldehído, ácidos y alcoholes. Después de la fijación se realiza habitualmente en
células que han sido secadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el
agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación
produce generalmente el encogimiento de las células, la tinción, por el contrario,
hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que
las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con
mucha precisión.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia
son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con
los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos
nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul
de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas
cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares
cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la
eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias
liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos
de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o
depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.
Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada
con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se
denomina mordiente. Un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se
combina con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora sí podrá atacar
el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopia
son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un
buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y
que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es
especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales,
puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.
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2. Tipos de tinciones
2.1. Tinción de Gram
También puede utilizarse a menudo un método que no tiñe igualmente todas las
células, un proceso denominado tinción diferencial. La tinción de este tipo más
extensamente utilizada es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo
danés Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su reacción a la
tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y
gramnegativas.
Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias
fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con
cierto detalle la tinción de Gram. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos
se tiñen primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son
tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este
estado todas las células, tanto las gramnegativas como las grampositivas, están
teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) –
yoduro potásico (KI). El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico
simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las células y forma un
complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células
grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. Se
lleva a cabo después de la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona,
sustancias en las que es soluble el complejo yodo – cristal violeta. Algunos
organismos (grampositivos) no se decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo
hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la
resistencia a la decoloración. Después de la decoloración las células grampositivas
son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto
las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es
un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la
coloración de contraste las células gramnegativas son rojas mientras que las
grampositivas permanecen azules.
Figura 13: La tinción de Gram.
Deben destacarse dos aspectos cruciales de la tinción de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento de yodo. El
yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células.
2) La decoloración debe realizarse con poco agua para evitar que pierdan la
tinción las células grampositivas. El proceso de decoloración debe ser corto y
es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados
satisfactorios.
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Finalmente, el carácter de grampositivo no es siempre un fenómeno del todo o
nada. Algunos organismos son más grampositivos que otros y algunos son
gramvariables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos. La
tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio
bacteriológico.
2.2. Tinción ácido – alcohol resistencia
Esta tinción sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que
tienen un alto contenido en lípidos y en ácidos micólicos y que no pueden ser
calificadas por la tinción de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una
mezcla de fucsina – fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de
mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto las ácido – alcohol sensibles como las
resistentes. Después se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias
ácido – alcohol sensibles se decoloren mientras que las ácido – alcohol resistentes
se quedan rosa. Como en la tinción de Gram se utiliza un colorante de contraste
que en este caso es el azul de metileno que tiñe las células ácido – alcohol
sensibles de color azul quedando las células ácido – alcohol resistentes de color
rosa.
Figura 14: La tinción ácido – alcohol resistencia.
2.3. Tinción de esporas
Se utiliza para teñir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas.
Sobre el portaobjetos con la preparación se echa verde malaquita que tiñe las
células de verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las células se quedan
incoloras y las endosporas permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para
obtener bacterias de color rosa mientras que las endosporas continúan con su color
verde del verde malaquita.
Figura 15: La tinción de esporas.
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2.4. Tinción negativa
Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir pero
se colorea un cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de
las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que
no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las
células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono
coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa
es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en microscopia
óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor
de las células bacterianas.
Figura 16: La tinción negativa, bacteriófago T4.
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3. Precauciones
Se dispone de otras técnicas de tinción que pueden utilizarse para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, paredes
celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Los métodos de tinción son de gran
utilidad, pero deben usarse siempre con precaución ya que pueden conducir a
errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados
que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones
completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se
denominan artefactos y deben tomarse muchas precauciones para tener la
seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una
estructura realmente existente.
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