segundo ciclo primer ciclo tercer ciclo cuarto ciclo situación inicial

Amplificación de DNA mediante PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)
La técnica de la PCR permite amplificar un segmento de DNA específico
(segmento diana) del que se conocen las secuencias de los extremos.
Para ello es necesario básicamente lo siguiente: 1.- una pequeña
cantidad de DNA que contenga el segmento en cuestión (DNA aislado
del organismo); 2.- Oligonucleótidos sintéticos (cebadores o primers) de
DNA de cadena simple, correspondientes a los extremos del segmento
diana (con la polaridad adecuada); 3.- DNA polimerasa resistente a
altas temperaturas y 4.- dNTPs. La reacción se lleva a cabo en un
aparato (termociclador) capaz de mantener diferentes temperaturas
durante distintos tiempos de forma muy precisa . En las siguientes
figuras se indican ejemplos de primers, un programa de PCR con
temperaturas y tiempos y un esquema de como va aumentando el
número de copias del segmento específico de DNA durante el proceso
(cinco primeros ciclos).
Segmento de DNA que se desea amplificar (segmento diana).
Puede tener hasta varios miles de pares de bases.
DNA
aislado
del
organismo
Hebra 1
5'
ACGGGAATTGAACCCGCGCA
GGCTGATCAAGGCCCAAGCT
3'
Hebra 2
3'
TGCCCTTAACTTGGGCGCGT
CCGACTAGTTCCGGGTTCGA
5'
5' - ACGGGAATTGAACCCGCGCA - 3'
3' - CCGACTAGTTCCGGGTTCGA - 5'
5' - ACGGGAATTGAACCCGCGCA - 3'
3' - CCGACTAGTTCCGGGTTCGA - 5'
5' - ACGGGAATTGAACCCGCGCA - 3'
3' - CCGACTAGTTCCGGGTTCGA - 5'
Primers extremo 2
(secuencia complementaria
de la hebra 2)
Primers extremo 1 (secuencia
complementaria de la hebra 1)
Ejemplo de programa de PCR
oligonucleótidos (cebadores o primers) de
DNA de cadena simple, correspondientes a
los extremos del segmento que se desea
amplificar (con la polaridad adecuada)
DNA
aislado
del
organismo
DNA polimerasa
resistente a
temperatura
alta (Taq)
nucleótidos
(dNTPs)
calentamiento
a 95ºC,
60 segundos
(desnaturalización)
situación inicial
DNA aislado
del organismo
tercer ciclo
calentamiento
(desnaturalización)
+ enfriamiento
(renaturalización)
primers
extremo 1
5'
Segmento
que se desea
amplificar
3'
35 ciclos
Mantenimiento a
72ºC,
90 segundos
(elongación)
primer ciclo
La temperatura, el tiempo de renaturalización del programa, y el
exceso de primers, hacen que la renaturalización se produzca
preferencialmente de la forma que se indica en el esquema
Mantenimiento a
temperatura
de elongación
3'
enfriamiento
a 60ºC,
60 segundos
(renaturalización)
5'
primers
extremo 2
Por cada molécula de DNA inicial, al final del 3º ciclo hay 2 copias del
segmento diana y 6 copias de segmentos de DNA de longitud variable
segundo ciclo
calentamiento
(desnaturalización)
+ enfriamiento
(renaturalización)
calentamiento
(desnaturalización)
+ enfriamiento
(renaturalización)
elongación
elongación
calentamiento
(desnaturalización)
+ enfriamiento
(renaturalización)
cuarto ciclo
elongación
Por cada molécula de DNA inicial, al final del 4º ciclo
hay 8 copias del segmento diana y 8 copias de
segmentos de DNA de longitud variable
quinto ciclo
calentamiento
(desnaturalización)
+ enfriamiento
(renaturalización)
+ elongación
Por cada molécula de DNA inicial, al final del 5º ciclo hay 22 copias del
segmento diana y 10 copias de segmentos de DNA de longitud variable
nuevos ciclos
Transcurridos n ciclos, por cada molécula de DNA inicial, el número de copias de segmentos de DNA de longitud variable es 2n, mientras que el
número de copias del segmento diana es 2n-2n. Con 35 ciclos se obtienen, por cada molécula de DNA inicial, 70 copias de longitud variable y
34.359.738.298 copias del segmento diana.
© Ramón Giráldez