Conteo celular en bajas concentraciones

Technical Note - Conteo celular en bajas concentraciones- Oscar Bastidas
Conteo celular en bajas concentraciones
¿Cómo usar SimpleCounter en muestras con concentraciones bajas?
¿Qué es el conteo celular?
Desde un punto de vista estadístico, el conteo celular se basa
en tomar una muestra de una población existente (la
concentración original), mediante la extracción de una
cantidad reducida de dicha población (la muestra), con el
objetivo de estimar el tamaño original de la población.
El problema subyacente en muestras con baja concentración
es que la muestra es demasiado pequeña para determinar de una manera precisa
el tamaño original de la concentración.
¿Cuáles son las consecuencias de que la muestra sea tan pequeña?
Si la muestra es muy pequeña, los resultados obtenidos diferirán en gran cantidad
de la concentración real.
2000000
1200000
1800000
1000000
1600000
1400000
800000
1200000
600000
1000000
800000
400000
600000
200000
400000
200000
0
0
0
2
4
6
8
10
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Fig. 1. Pequeña muestra (15 cells per count) Fig.2. Large Sample (150 cells per count)
En la figura 1 podemos ver 10 conteos celulares realizados para una concentración
original de 1 x 106 cels / ml, tomando 15 células por cada conteo.
¿Qué podemos hacer entonces?
Hay diversas maneras de obtener una medida fiable para muestras con baja
concentración celular usando SimpleCounter. Algunas de ellas pueden ser
aplicadas para conteos celulares de forma manual con cámara de Neubauer y un
microscopio.
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Solución
Min. Concentración
Cambiar el objetivo del microscopio
Contar más células en más campos
Cámara más profunda
Placa de 96 pocillos
250.000 cells / ml
62.500 cells / ml
7.000 cells / ml
250 cells / ml
Solución #1: Cambiar el objetivo del microscopio (> 250.000 cels / ml)
Si usamos los objetivos de 10x o 4x podremos ver más amplitud de campo, pero
sólo será útil si las células son los suficientemente grandes como para ser
analizadas.
El área verde vista a través de SimpleCounter con un objetivo de 4x es el
equivalente a 1 de los 9 cuadrados grandes de la cámara de Neubauer
(1mmx1mm),
El volumen analizado en este caso será:
Volumen = 1 mm x 1 mm x 0,1 mm = 0,1 mm3 = 0,0001 ml = 10-4 ml = 0,1 µl
(1 ml = 1.000 mm3)
Concentración: 106 cells / ml
Volumen:
0,1 µl
Media de células: 100
Error estimado: 20%
Contando en 1 cuadrado grande de la cámara de Neuabuer
Puesto que nuestra concentración original es de 1 x 106 cels / ml , la media del total
de células contadas será de: (1 x 106) x (10-4 ml) = 100 células
El error estimado será del 20%, rozando el límite marcado por la mayoría de
investigadores
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Solución #2: Contar más células en más campos. (> 62.500 cels / ml)
Con una concentración de 250.000 cels/ml, la media del total de células contadas
seguría siendo 100 si tomásemos 4 de los grandes cuadrados de la cámara de
Neubauer.
Concentración : 2,5 x 105 cells / ml
Volumem :
0,1 µl
Media de células: 100 (25/cuadrado)
Error estimado: 20%
Contando 4 cuadrados grandes de la cámara de Neubauer
SimpleCounter es el único contador celular que puede incrementar el número de
campos de microscopio con el objetivo de incrementar la veracidad en muestras
con bajas concentraciones
SimpleCounter puede incrementar el número de
campos con la misma cámara de Neuabuer.
Asumamos que pasamos de 5 campos a 20
campos, manteniendo el número de células
contadas en 100 para un error máximo del 20%. En
este caso, podríamos llegar a una concentración de
62.500 cels/ml.
Numéro de
campos de
microscopio
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Contar más campos
permite el conteo en
muestras con baja
concentración celular.
Concentración
mínima (cels/ml)
250.000
125.000
83.333
62.500
50.000
41.666
35.714
31.250
27.777
25.000
Concentración celular mínima en cámara de Neubauer.
SimpleCounter puede tomar muestras fuera de la rejilla, incrementando así la
concentración mínima que puede ser medida usando una cámara de Neubauer (o
cualquier otra: Thoma, Fuchs-Rosenthal, etc.)
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El área de conteo total de una cámara de Neubauer es de 3 mm x 3 mm = 9
mm2 9 mm2 x 0,1 mm = 0,9 mm3 = 0,0009 ml = 0,9 µl
Manual counting
Area Volume = 0,9µl
Total counting area for Simple Counter = 10 µl
El área de muestreo de SimpleCounter es 10 veces mayor respecto al conteo manual.
Si queremos contar más células realizando el conteo de manera manual con
cámara de Neuabuer, y toda la rejilla ya ha sido usada para contar, necesitaremos
volver a cargar la cámara para continuar el conteo.
Con SimpleCounter, el muestreo puede ser llevado a cabo fuera de la rejilla,
ahorrando el tiempo destinado a cargar una nueva cámara.
Sin embargo, para concentraciones inferiores a
35.000 cels/ml, el número de campos capturados
se incrementa demasiado, convirtiéndose en una
solución contraproducente. En este caso,
recomendamos seguir los pasos descritos en las
soluciones 3 y 4.
SimpleCounter
incrementa en 10 veces
el área de muestreo,
ahorrando tiempo con
respecto al conteo
manual.
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Solución #3: Cámara de recuento mas profunda ( > 7.000 cells / ml)
Si queremos contar en concentraciones muy bajas, la mejor solución consiste en usar cámaras
con más profundidad. La lógica de este argumento reside en el hecho de que las cámaras con
más profundidad pueden contener más volumen de muestra por área.
Un citómetro de flujo puede ser viable
para esta solución, dado el volumen de la
muestra analizada.
La cámara de Nageotte es una cámara de
0.5mm de profundidad.
Pudiendo
alcanzar concentraciones hasta 5 veces
más pequeñas que con una cámara de
Neubauer.
Número de
campos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
IMPORTANTE
La mayoría de contadores celulares no
cuentan en cámaras profundas.
SimpleCounter es el único contador que
funciona para cualquier tipo de cámara
de conteo.
Concentración/min
(cells /ml)
50.000
25.000
16.667
12.500
10.000
8.333
7.143
6.250
5.556
5.000
Concentración celular mínima para una cámara de Nageotte.
Cámara de Nageotte
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Solución #4: Cámara de 96 pocillos (> 250 cells /ml )
Para muy bajas concentraciones, las cámaras usuales de conteo celular no son
suficientes. Para este caso, recomendaos usar una cámara de 96 pocillos junto con
un microscopio invertido.
Cámara de 96 pocillos
En este caso, la profundidad suele ser de 10mm = 1cm.
Por lo tanto, podemos alcanzar concentraciones hasta 20 veces más pequeñas que
con una cámara de Nageotte.
Número de
campos en el
microscopio
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Concentración
mínima (cels/mil)
2.500
1.250
833
625
500
417
357
313
278
250
Concentración celular mínima para una cámara de 96 pocillos
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Para concentraciones incluso más bajas, se pueden usar cámaras de 96 pocillos
con una profundidad de hasta 29mm.
Cámaras de 96 pocillos con profundidad superior a 10mm.
Para cualquier pregunta o sugerencia con respecto al contenido de este artículo,
por favor pónganse en contacto con: [email protected]
BIOGRAFÍA Y REFERENCIAS.
[1]
A SIMPLIFIED METHOD OF PHYTOPLANKTON COUNTING, Eva Willen. Br. Phycol. J.
11:235-278, September 1976.
[2] CELEROMICS INTERNAL MARKET RESEARCH FOR SIMPLE COUNTER AND CULTURE
COUNTER DEVICES, performed with 40 Spanish and French Biotechnology companies and
Universities.
[3] DIE REVISION EINIGER METHODEN ZUM FESTELLEN DER QUANTITÄT DES
PHYTOPLANKTONS, P. Javornicky, Oddil faculty technologie paliv. a vody. Prague, 2:283367.
[4] THE INVERTED MICROSCOPE METHOD OF ESTIMATING ALGAL NUMBERS AND THE
STATISTICAL BASIS OF THE ESTIMATIONS BY COUNTING, J.W.G, Lund, Hydrobiologia 11:143170
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