salmonelosis

CAPÍTULO 2.9.9.
SALMONELOSIS*
RESUMEN
La salmonelosis es una enfermedad infecciosa del hombre y los animales causada por
microorganismos de dos especies de Salmonella (Salmonella enterica y S. bongori). Aunque
fundamentalmente son bacterias intestinales, Salmonella está muy distribuida en el ambiente y se
encuentran con frecuencia en vertidos de granjas, en las aguas residuales humanas y en cualquier
material con contaminación fecal. En el hombre, los microorganismos del género Salmonella son
agentes etiológicos de infecciones intestinales y sistémicas, por lo general, como contaminantes
secundarios de los alimentos, de origen animal y ambiental o, frecuentemente, como consecuencia
de la infección subclínica en animales de abasto que provoca la contaminación de la carne, los
huevos y la leche o la contaminación secundaria de frutas y verduras que se han fertilizado o
regado con desechos orgánicos. La salmonelosis humana es una de las enfermedades zoonósicas
más frecuentes y de mayor impacto económico causadas por estos microorganismos. Los agentes
de Salmonella se pueden encontrar también en los alimentos y originando el transporte
gastrointestinal asintomático o enfermedades infecciosas en los animales, particularmente en aves
y en cerdos. En todos los países existe la salmonelosis, pero parece tener una mayor prevalencia
en áreas de producción animal intensiva, especialmente de cerdos, de terneros y de algunos tipos
de aves criadas en cautividad (con frecuencia, los reptiles son portadores asintomáticos de
Salmonella). Varios serotipos son específicos del hospedador (ej. S. Abortusovis en ovejas o
S. Typhi en humanos) o adaptados al hospedador (como por ejemplo S. Choleraesuis y S. Dublin).
La enfermedad puede afectar a todas las especies de animales domésticos; los más susceptibles
son los animales jóvenes, en estado de gestación, o lactantes. La manifestación más común de la
enfermedad es la entérica, pero se puede observar un espectro muy amplio de síntomas clínicos
que incluye septicemia aguda, aborto, artritis y enfermedad respiratoria. Muchos animales, en
especial los cerdos y las aves, pueden estar infectados sin manifestar la enfermedad clínica. Tales
animales pueden ser importantes en la difusión de la enfermedad entre explotaciones y como
fuentes de contaminación alimentaria y de infección humana.
La tifosis aviar y la pullorosis, que son otras enfermedades aviares causadas por Salmonella, se
presentan en el capítulo 2.3.11. de este Manual.
Identificación del agente: El diagnóstico se basa en el aislamiento del microorganismo a partir de
tejidos recogidos asépticamente en necropsias o de las heces, de frotis rectales o muestras
ambientales, de productos alimenticios o de pienso; se puede diagnosticar también
serológicamente la infección anterior o actual de animales por algunos serotipos. Cuando aparece
infección en los órganos reproductores, en el embrión o en caso de aborto, es necesario cultivar el
contenido del estómago fetal, de los frotis placentarios y vaginales y, en el caso de las aves, de los
huevos embrionados.
Salmonella puede aislarse utilizando varias técnicas, una de las cuales es un pre-enriquecimiento
para recuperarlas con daño subletal, medios de enriquecimiento que contienen sustancias
inhibidoras para evitar microorganismos competidores, y medios sólidos selectivos en placa para
diferenciar Salmonella de otras enterobacterias.
Para obtener una confirmación definitiva de la cepa aislada, se pueden aplicar varias pruebas
bioquímicas, serológicas y moleculares a los cultivos puros. Salmonela posee antígenos llamados
somáticos (O), flagelares (H) y de virulencia (Vi), que pueden identificarse mediante sueros
específicos de tipo, y después puede determinarse el serotipo por referencia a la fórmula
antigénica del esquema de Kauffman–White. Muchos laboratorios necesitan enviar los
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Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis
aislamientos a un laboratorio de referencia para confirmar por completo la identidad serológica y
determinar, cuando sea posible, el fagotipo y el genotipo de la cepa.
Pruebas serológicas: Las pruebas serológicas deben realizarse en una muestra de la población
que sea estadísticamente significativa, pero estas pruebas poseen un valor limitado si se utiliza la
vacunación. En el diagnóstico rápido de S. Pullorum/Gallinarum en aves de granjas avícolas se
utiliza la prueba de sangre completa, que es una prueba diagnóstica relativamente fiable en
determinadas circunstancias. En el laboratorio, el método preferido para la exportación y el
diagnóstico de muestras de todos los animales de granja es la prueba de aglutinación en tubo.
Existen enzimoinmunoensayos para algunos serotipos, y pueden utilizarse para el diagnóstico
serológico y el control, especialmente, en el caso de aves y cerdos. La vacunación puede
comprometer el valor diagnóstico de las pruebas serológicas.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: Contra la salmonelosis se utilizan
muchas vacunas inactivadas y hay comercializadas algunas vacunas vivas. Debido a la baja
eficacia de las vacunas inactivadas, se utilizan adyuvantes con aceite o hidróxido de aluminio para
mejorar sus propiedades inmunógenas. A menudo se carece de datos sobre la eficacia en
condiciones de campo, aunque las pruebas de laboratorio pueden servir como indicadoras. Las
pruebas de inocuidad se realizan en animales de laboratorio y, en el caso de las vacunas
inactivadas, se llevan a cabo pruebas de esterilidad con medios bacteriológicos de
enriquecimiento. Para las vacunas producidas por manipulación genética se necesita más
seguridad, por ejemplo en lo que respecta al impacto ambiental y a la estabilidad. Para reducir las
infecciones por Salmonella en las aves y otras especies animales se puede emplear la exclusión
competitiva.
A. INTRODUCCIÓN
De acuerdo con la actual nomenclatura, que refleja avances recientes en la taxonomía (42), el género Salmonella
incluye solo dos especies importantes: S. enterica y S. bongori. Se ha propuesto también una supuesta tercera
especie, S. subterranea, tras el aislamiento de una única cepa ambiental poco usual (24, 27, 50, 54). Salmonella
enterica se divide en seis subespecies, que se distinguen por algunas características bioquímicas, y algunas de
ellas se corresponden con subgéneros anteriores. Estas subespecies son:
•
•
•
•
•
•
Subgéneros originales
Subespecie I
Subespecie II
Subespecie IIIa
Subespecie IIIb
Subespecie IV
Subespecie VI
=
=
=
=
=
=
Nomenclatura Actual
subespecie enterica
subespecie salamae
subespecie arizonae
subespecie diarizonae
subespecie houtenae
subespecie indica
El símbolo V se reserva para los serotipos de S. bongori a fin de evitar confusiones con el nombre de serotipo de
S. enterica subesp. enterica. Las cepas de Salmonella se clasifican en serotipos según la gran diversidad de los
antígenos (O) del lipopolisacárido (LPS) y de los antígenos proteicos de los flagelos (H), de acuerdo con la
clasificación de Kauffmann–White; en la actualidad se reconocen aproximadamente 2.500 serotipos (42). Este
número está en constante aumento. Los serotipos más comunes que causan infección en humanos y en
animales de abasto pertenecen a la subespecie enterica. Los serotipos de las otras subespecies tienen mayor
probabilidad de presentarse en animales poiquilotermos (de sangre fría) y en el ambiente, pero a veces se les
asocia con la enfermedad en humanos. Algunos serotipos de las subespecies S. arizonae y S. diarizonae se han
asociado con enfermedades en los pavos y en las ovejas, y otros pueden ser vehiculados por reptiles y anfibios
silvestres o en cautividad.
Solo se conservan los nombres para los serotipos de la subespecie enterica. Estos nombres no deben escribirse
en cursiva. La primera letra es mayúscula. En la práctica clínica, no es necesario indicar el nombre de la
subespecie, ya que solamente llevan nombre los serotipos de la subespecie enterica; por ejemplo, Typhimurium,
London, o Montevideo son serotipos de la subespecie enterica. En la práctica rutinaria, se puede usar el género
Salmonella seguido del nombre del serotipo (ej. Salmonella Typhimurium). La mayor parte de los serotipos de
otras subespecies se designan mediante una fórmula antigénica que incluye la subespecie, designada mediante
números romanos (ej. Salmonella IV 48:q.z51)
En este capítulo se siguen las nuevas convenciones establecidas de forma abreviada; es decir, se usa
S. Typhimurium en lugar de la nomenclatura más completa S. enterica, subesp. enterica serotipo Typhimurium.
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También se dan cambios de forma regular en la clasificación de los serotipos a medida que se dispone de nueva
evidencia sobre el parentesco genético, ej. S. Pullorum se clasifica actualmente como S. gallinarum serotipo
Pullorum (42).
La salmonelosis es una enfermedad infecciosa del hombre y de los animales causada por microorganismos de
las dos especies de Salmonella (S. enterica y S. bongori). Aunque fundamentalmente son bacterias intestinales,
Salmonella está muy distribuida en el ambiente y se encuentra con frecuencia en vertidos de granjas, en las
aguas residuales humanas y en cualquier material con contaminación fecal. En todos los países existe
salmonelosis, pero parece ser más prevalente en áreas de producción animal intensiva, especialmente de aves y
cerdos.
La enfermedad puede afectar a todas las especies de animales domésticos, siendo más susceptibles los más
jóvenes y los animales gestantes. La manifestación clínica más común es la enfermedad entérica, que a menudo
se presenta como una diarrea sanguinolenta y muy acuosa acompañada de fiebre, pero se puede observar un
amplio espectro de síntomas clínicos, como septicemia aguda, aborto, artritis, necrosis de las extremidades y
enfermedad respiratoria. Los síntomas y las lesiones no son patognomónicos. Muchos animales, especialmente
las aves y los cerdos, pueden estar infectados pero no mostrar enfermedad clínica (65). Tales animales pueden
ser importantes en la diseminación de la enfermedad entre explotaciones y ser causa de intoxicación alimentaria
humana. En el último caso, esto puede suceder cuando estos animales entran en la cadena alimentaria y
originan productos alimenticios contaminados (64, 65).
El curso de la infección, los síntomas clínicos, los hallazgos post mórtem y los modelos epidemiológicos varían
según el serotipo y la especie animal implicada. Algunos serotipos solo afectan a determinados hospedadores,
por ejemplo S. Gallinarum a aves y S. Cholerasuis a cerdos, aunque la mayor parte pueden causar enfermedad
en un amplio rango de especies animales (51). Se ha visto que muchos serotipos (incluyendo los que están
adaptados a hospedadores) tales como S. Coholeraesuis y S. Dublin originan la enfermedad en humanos, y los
trabajadores que asisten a los animales, los veterinarios y los empleados de mataderos, pueden infectarse
directamente en el trabajo, así como el personal de laboratorio.
Normalmente, la enfermedad se describe como salmonelosis, aunque se puede usar el término de fiebre
paratifoidea, por ejemplo, la paratifoidea porcina. En la industria avícola, la pulorosis o diarrea blanca bacilar y la
tifosis aviar designan a menudo las infecciones causadas por S. Pullorum y S. Gallinarum, respectivamente (51).
La tifosis aviar y la pulorosis se describen con detalle en el capítulo 2.3.11 del presente Manual.
Para las investigaciones epidemiológicas detalladas es necesario identificar las cepas, y tales investigaciones
han descansado tradicionalmente en métodos bioquímicos y serológicos, en la fagotipificación de algunos
serotipos y en los antibiogramas. En los últimos años se ha utilizado con éxito el análisis genotípico de los
microorganismos mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) y la
determinación molecular de las huellas del ADN. El análisis del perfil de plásmidos es un método rápido y
relativamente fácil para caracterizar cepas, y se ha empleado para estudiar la dispersión de Salmonella tanto en
medicina humana como en veterinaria. Esta técnica presenta limitaciones, pues no todas las cepas de
Salmonella presentan plásmidos, y los plásmidos se pueden adquirir con facilidad o ser de un tamaño similar
pero genéticamente diferentes. Sin embargo, ese procedimiento ha resultado ser útil para la investigación de los
brotes como complemento de otros métodos. Para suplementar los estudios del perfil de los plásmidos se han
utilizado otras técnicas genéticas alternativas, como la electroforesis en gel de campo pulsante, el AFLP
(polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados), VNTR (número variable de repeticiones en tándem),
análisis SNP (polimorfismo de nucleótido único) y ribotipificación automatizada (4, 32, 53. 56). La genotipificación
es un campo de trabajo en expansión y, en los últimos años se han desarrollado muchos métodos nuevos. Debe
tenerse en cuenta que un único método puede no servir para todos los aislamientos y que puede ser necesario
evaluar diferentes técnicas hasta encontrar un método o combinación de métodos que resulte satisfactorio y
capaz de diferenciar clones de un serotipo o fagotipo particular (45, 55). A menudo las técnicas moleculares son
más discriminatorias y rápidas y están sustituyendo a los métodos fenotípicos, tales como la serotipificación y la
tipificación mediante el fago, en las investigaciones epidemiológicas de algunos laboratorios. Sin embargo, estas
herramientas moleculares no están disponibles necesariamente en todos los laboratorios o no han sido
estandarizadas para producir resultados replicables en diferentes laboratorios, y es posible que los aislamientos
tengan que enviarse a un laboratorio de referencia adecuado.
Se están elaborando técnicas genéticas como la hibridación en microarrays y la PCR múltiple destinadas a
identificar serotipos específicos y a proporcionar información adicional sobre el contenido genético (18, 19, 44).
El aislamiento de Salmonella y su posterior identificación depende no solo de la calidad de la muestra sino
también del medio de cultivo y de las características de crecimiento del serotipo, particularmente, en aquellos
casos en que están adaptados a una especie hospedadora. Se ha publicado recientemente una revisión
completa de la infección de animales domésticos por Salmonella (65).
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Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis
En muchos países se han llevado a cabo programas nacionales para controlar las infecciones animales por
Salmonella con vistas a proteger al consumidor. En la Unión Europea, la Directiva de Zoonosis 2003/99/EC
establece el control respecto a S. Enteritidis y S. Typhimurium de las explotaciones de más de 250 aves y de las
incubadoras. De acuerdo con la legislación adicional, S. Virchow, S. Infantis y S. Hadar también se someterán a
controles especiales (10). El mismo día de la llegada se realiza el cultivo de los revestimientos de las jaulas de
reparto de las aves, de las aves muertas y de algunas al azar. A las 4 semanas de edad y 2 semanas antes de la
puesta de huevos, se cultivan las heces de hasta 60 muestras, dependiendo del tamaño de la explotación.
Después, los adultos se muestrean cada 2 semanas. También se llevan a cabo cada 2 semanas, en las
incubadoras donde eclosionan los huevos, se cultiva el meconio y los animales muertos dentro del cascarón,
aunque existen planes para sustituir lo anterior por la observación de los revestimietos de los compartimentos de
la incubadora en la granja. La UE también está legislando sobre el control de Salmonella en parvadas de
asentamientos comerciales, pollos de asar, pavos y cerdos. El análisis serológico está permitido como medida
complementaria, pero no puede seguir reemplazando al análisis bacteriológico de las aves de corral. En
Dinamarca se utiliza el control serológico de Salmonella en explotaciones porcinas y en explotaciones
comerciales de aves ponedoras. En otros varios países existen actualmente programas de vigilancia para
sacrificar piaras de cerdos utilizando muestras de “jugo de carne” o suero tomado en el matadero.
Las infecciones de animales de abasto por Salmonella tienen un papel importante en la salud pública y
particularmente en la seguridad alimentaria, ya que los alimentos de origen animal se consideran como la fuente
principal de infecciones por Salmonella en el hombre (64). Se han realizado programas especiales para el control
de aves, cerdos y ganado bovino, que incluyen el control de animales sanos que pueden ser portadores
subclínicos de estos microorganismos. También se controla la contaminación cruzada durante el procesamiento
de los alimentos, ya que puede ocurrir contaminación por manipuladores de alimentos sanos (65).
El pienso contaminado con Salmonella es la fuente más frecuente de infección en animales. Como la
contaminación del pienso se debe a menudo a serotipos de importancia para la salud pública, los piensos, sobre
todo la harina de carne y huesos, deben analizarse para investigar la presencia de Salmonella (46).
El pienso contaminado con Salmonella ha sido la fuente más común de introducción de nuevas cepas de
Salmonella en las redes de producción de ganado, desde las que se disemina por los desplazamientos de los
animales portadores y por otras vías. En muchas situaciones la mayor amenaza puede provenir del comercio
nacional o internacional de ganado; puede ser que el pienso contenga serotipos “medioambientales” menos
patógenos que no causen la enfermedad ni ciclos de infección en animales. Como la contaminación del pienso
se debe a menudo a serotipos de Salmonella de importancia para la salud pública, debe analizarse el mismo
para detectar la presencia de Salmonella (65). Como los piensos se elaboran con mezclas de ingredientes de
procedencia variada, puede encontrase en los mismos una amplia gama de salmonelas “exóticas”. Una vez
establecidas en una instalación, la propagación de unos animales a otros, la contaminación ambiental y las
plagas de la granja se convierten en las principales causas de la continuidad y la propagación de la infección.
Las muestras de pienso y de comida analizadas para investigar presencia de Salmonella deben ser
representativas. Se deben tomar medidas adecuadas para evitar la contaminación durante el transporte o el
almacenamiento (20, 21). Debido a la amplia variedad de alimentos y de productos alimenticios no hay un único
método de muestreo que sea apropiado para todos los casos. Por lo tanto, se deben utilizar métodos diferentes
que sean específicos para el producto (11, 22).
La Organización Mundial de la Salud proporciona información sobre el desarrollo de medidas adecuadas para la
prevención y el control de las enfermedades transmitidas por los alimentos, incluyendo las infecciones del
hombre por Salmonella. Los vehículos más comunes de infección son los huevos y sus productos derivados, la
carne de pollo y de otros animales, así como los derivados cárnicos. Las cosechas de verduras contaminadas y
las especias también son causa de numerosos brotes. Los serotipos más frecuentes en muchos países europeos
son S. Enteritidis y S. Typhimurium (aunque Salmonella es escasa en la producción de ganado, algunos países
de la UE cuentan con estrictos programas de control), mientras que el serotipo dominante en Norteamérica es
S. Typhimurium (64).
Una política de control de Salmonella a efectos de la salud pública debe cubrir todas las etapas desde “el establo
a la mesa”. Debe incluir la declaración obligatoria de todos los brotes de la enfermedad (13), y el control del
pienso y la comida (65). El control de alimentos debe incluir el muestreo de los alimentos compuestos y de otras
materias primas no procesadas para alimentación, así como el muestreo durante el procesamiento de la comida.
Deben realizarse investigaciones epidemiológicas a nivel mundial para analizar la transmisión de Salmonella y
para apoyar las políticas de control de Salmonella.
Son esenciales los controles sanitarios e higiénicos en los mataderos, y se deben tomar precauciones especiales
durante el sacrificio de poblaciones animales potencialmente infectadas. Deben practicarse medidas de
descontaminación durante el procesamiento. Cada vez es mayor la utilización de vacunas para disminuir
Salmonella en las aves de corral y es importante diferenciarla de las infecciones de campo para fines de control y
asegurarse de que las vacunas no contagian a los animales no vacunados (60).
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Otro elemento esencial en la profilaxis de la salmonelosis humana es la educación del consumidor, en particular,
la concienciación sobre el manejo y almacenamiento seguro del alimento, la higiene en la cocina y el tratamiento
culinario adecuado para limitar el riesgo de infección.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
La frecuencia del muestreo y el tipo de muestras obtenidas dependerán en gran medida de los objetivos del
programa de pruebas (incluidos los requisitos estatutarios), los hallazgos clínicos, los niveles de detección o la
precisión necesaria en la estimación de la prevalencia, el coste y la disponibilidad de recursos para el muestreo y
de instalaciones de laboratorio.
Las muestras individuales para pruebas bacteriológicas se recogen tan asépticamente como sea posible y, en
caso de enfermedad clínica o de control rutinario, deben recogerse antes de comenzar cualquier tratamiento
antibiótico. Con preferencia, las muestras clínicas se recogen durante la fase aguda de la enfermedad o muy
pronto después de la muerte. En el caso de las parvadas de aves de corral o de otras especies avícolas, las
muestras ambientales, como las heces agrupadas de forma natural, la basura y el polvo, los barridos o los frotis
a partir de las superficies del suelo, pueden ser el modo más eficaz, en cuanto al coste, de identificar granjas
infectadas (5, 25). Se deben tomar precauciones para evitar la contaminación cruzada de las muestras durante la
recogida, el desplazamiento y en el laboratorio. Los envíos deben mantenerse en frío y estar acompañados de
una información adecuada. Si es posible, en el caso de especies animales pequeñas, es preferible enviar al
laboratorio un número representativo de animales enfermos o recién muertos (63). Normalmente, los serotipos
adaptados al hospedador son más difíciles de aislar de las heces, de modo que, si se sospecha esta situación,
se deben cultivar tejidos infectados siempre que sea posible.
Se debe prestar una atención particular al aislamiento de Salmonella en animales con infecciones subclínicas, ya
que estos pueden liberar bacterias solo de modo intermitente y en cantidades bajas. Se puede lograr aumentar la
sensibilidad diagnóstica incrementando el tamaño de las muestras y el número de las muestras para que
representen más individuos, todo ello combinado en algunos casos con la mezcla de las muestras y la repetición
de los muestreos. En tales situaciones los métodos bacteriológicos o serológicos se deben utilizar para identificar
poblaciones infectadas más que para identificar animales individuales infectados.

Cultivo
Existen muchos métodos para aislar Salmonella que son de uso universal (9, 14, 17, 29, 46, 63). Más adelante
se describen algunos de los métodos más comunes. Las técnicas y medios de cultivo con los mejores resultados
en una situación diagnóstica concreta dependen de una variedad de factores que incluyen el tipo de Salmonella,
el origen y tipo del ejemplar, la experiencia del microbiólogo y la disponibilidad de medios de enriquecimiento
selectivo y de medios selectivos en placas.
Todos los medios de cultivo preparados deben someterse a controles de calidad y permitir el crecimiento del
microorganismo sospechoso a partir de un inóculo pequeño. El uso de la cepa de referencia en paralelo con las
muestras rutinarias puede dar lugar a contaminación cruzada de las muestras por la utilización inadecuada de las
técnicas, así que debe utilizarse un serotipo escaso con características de cultivo típicas que sean semejantes a
las de la cepa problema más prioritaria.
El establecimiento progresivo de programas para la garantía externa de la calidad ha impulsado la utilización
creciente de métodos estándar, como la norma ISO 6579:2002; aunque esta no ha sido validada para muestras
fecales y ambientales y se estableció para los alimentos y los piensos. En los últimos años se ha elaborado y
evaluado un método estándar para la detección de Salmonella a partir de la industria de producción animal, y
casi se ha adoptado un método ISO (35). Lo esencial del método estándar es el preenriquecimiento en agua de
peptona tamponada, el enriquecimiento en Rappaport–Vassiliadis (MSRV) semi-sólido modificado, el aislamiento
en agar xilosa-lisina-dexosicolato (XLD) y un medio selectivo de cultivo en placa.
a)
Medios de preenriquecimiento
El número de salmonelas es normalmente bajo en las heces de los animales asintomáticos, en muestras
ambientales, en los alimentos para el ganado y en los alimentos, por lo que es necesario utilizar medios de
preenriquecimiento para facilitar el aislamiento, tal como el agua de peptona tamponada o el caldo universal
de preenriquecimiento. Esto puede permitir que un escaso número de Salmonella se multipliquen sin que
mueran por los efectos tóxicos de los medios de enriquecimiento, o puede ayudar a la recuperación de las
que presentan daños subletales, como los debidos a la congelación, el calentamiento, la exposición a las
substancias microbicidas o a la desecación El preenriquecimeinto puede que no sea el mejor método para
aislar cepas poco vigorosas de Salmonella de las heces, como el caso de las cepas adaptadas al
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hospedador, debido a un sobrecrecimiento
preenriquecimiento no selectivo.
b)
de
microorganismos
competidores
durante
un
Medios de enriquecimiento
Los medios de enriquecimiento son medios líquidos o semisólidos que contienen substancias que permiten
el crecimiento selectivo de las salmonelas a la vez que inhiben el crecimiento de otras bacterias. Algunos,
sin embargo, son también relativamente tóxicos para algunos serotipos de Salmonella, por ejemplo, el
selenito inhibe S. Cholerasuis, y el colorante verde brillante es tóxico para muchas cepas de S. Dublin.
También se han utilizado las temperaturas elevadas para aumentar la selectividad del medio de
enriquecimiento. En algunos laboratorios se utiliza una temperatura de 43°C, aunque con algunos medios
puede resultar inhibidora; por ejemplo, los medios de tetrationato y de Rappaport–Vassiliadis inhiben las
cepas termosensibles, especialmente S. dublin, y ahora se recomienda 41.5°C para incubación en caldo de
Rappaport–Vassiliadis (22). También se puede emplear el enriquecimiento selectivo por movilidad para
aumentar la sensibilidad del aislamiento de Salmonella y la utilización de medios de enriquecimiento
semisólidos, como MSRV o medio semisólido para el diagnóstico de Salmonella (DIASALM), que pueden
proporcionar mayor sensibilidad (59). La composición del medio, que puede variar de un proveedor a otro, o
incluso en algunos casos de un lote a otro, la temperatura y la duración de la incubación, y el volumen de
las muestras utilizadas como inóculo del medio, pueden servir para influir en la tasa de aislamiento, y se
deben tener siempre en cuenta estas variables. Ejemplos de medios selectivos de enriquecimiento son el
de tetrationato sódico, como en el caldo de Muller–Kauffman, los caldos con selenito F, con selenito
cisteína, con verde brillante, el de Rappaport–Vassiliadis o el medio semisólido de Rappaport–Vassiliadis.
En algunos casos puede resultar ventajosa la utilización de más de un caldo selectivo o el cultivo mediante
preenriquecimiento y el enriquecimiento y la siembra directa, aunque a menudo el beneficio no justifica el
aumento de los costes. Se pueden añadir a los medios selectivos substancias como la Ferrioxamina E para
mejorar el aislamiento de Salmonella en muestras con limitación de hierro o de nutrientes como los huevos,
el agua o el suelo (46), o pueden añadirse antibióticos para mejorar el aislamiento de las cepas resistentes
a los antimicrobianos.
c)
Medios selectivos en placa
Estos son medios selectivos solidificados con agar que permiten un crecimiento diferencial en varios
aspectos. Inhiben el crecimiento de bacterias distintas a Salmonella y suministran información sobre
algunas de las principales características bioquímicas diferenciales – normalmente la incapacidad de
fermentar de la lactosa y la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S). Los resultados se obtienen después
de 24 y 48 horas de cultivo a 37°C. En dichos medios Salmonella forma colonias características que son
distintas de las producidas por otras bacterias en la placa, con la posible excepción de Proteus,
Pseudomonas y Citrobacter. En ocasiones, se pueden aislar salmonelas fermentadoras de la lactosa y la
producción de H2S puede ser variable. Se pueden detectar de modo más eficaz tales cepas atípicas cuando
se utilizan medios selectivos semisólidos. A este respecto, el medio DIASALM es particularmente útil ya que
se puede realizar una confirmación provisional por aglutinación en porta utilizando antisueros polivalentes
anti-O, anti-H o específicos, con líquido de la zona de crecimiento de la placa. Salmonella Abortusovis es un
serotipo de crecimiento lento, y es normal incubar las placas durante 72 horas y utilizar el medio no
selectivo de agar-sangre. Ejemplos de medios selectivos sólidos son el agar verde brillante, el agar xilosalisina-desoxicolato, el agar desoxicolato/citrato, el agar Rambach, y el agar sulfito de bismuto, aunque en la
literatura y en los catálogos de medios pueden encontrarse muchos más. Actualmente se dispone de una
amplia variedad de medios sólidos. Muchos de estos pueden servir de ayuda para la diferenciación entre
colonias sospechosas, pero deben ser validados para las matrices de muestra, los sistemas de cultivo, y la
gama de serotipos utilizados, ya que, bajo ciertas condiciones, la sensibilidad puede ser pobre.

Identificación de colonias sospechosas
Las colonias sospechosas se subcultivan en medios sólidos selectivos y no selectivos para asegurar la ausencia
de posibles contaminantes como Proteus spp. Si hay un crecimiento abundante en cultivo puro, las colonias
sospechosas se pueden probar por aglutinación en porta con sueros polivalentes para la tipificación de
Salmonella (28). En algunos casos, la colonia sospechosa puede no aglutinar o autoaglutinar y es necesario
entonces utilizar pruebas bioquímicas para confirmar la identificación. Estas pruebas se pueden realizar con
azúcares en agua de peptona o con sistemas comerciales (tales como el sistema Índice de Perfil Analítico [API]),
la prueba OBIS o en medios compuestos (tales como el agar triple azúcar-hierro [TSI]) (12).
La identificación de los antígenos O y H, y, en circunstancias especiales, del antígeno Vi, se realiza mediante
aglutinación directa en porta o por aglutinación en tubo utilizando antisueros específicos. En el caso de
microorganismos bifásicos, es necesario identificar ambas fases mediante el uso de la inversión de fase lo que
implica el pase por medio semisólido que contenga antisuero contra la fase conocida. La detección se facilita por
la disponibilidad de antisueros dirigidos contra varios factores, y puede mejorarse utilizando sueros monovalentes
de tipificación. Aunque muchos de los laboratorios puede identificar los serotipos más comunes, se necesita
6
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utilizar los servicios de un laboratorio de referencia para confirmar la identidad de un aislamiento y, posiblemente,
para obtener información sobre la fagotipia, si existe una clasificación disponible, y sobre el perfil genético.
Se pueden necesitar pruebas bioquímicas adicionales para identificar algunas variantes serotípicas, por ejemplo,
la del d-tartrato que permite diferenciar S. Paratyphi B var. Java de S. Paratyphi B. Los aislamientos se deben
probar en cuanto a su sensibilidad a un conjunto de agentes antimicrobianos ya que existe una preocupación
creciente por la emergencia de múltiples cepas nuevas resistentes que albergan genes de resistencia
transferibles a las cefalosporinas y las fluoroquinolonas (26, 43, 61). Las cepas vacunales vivas también se
identifican mediante marcadores de resistencia a antimicrobianos y por cambios bioquímicos como el
auxotrofismo o rugosidad.

Métodos de reconocimiento inmunológicos y de ácidos nucleicos
Se usan y comercializan numerosos métodos alternativos de detección de Salmonella (6, 8, 12, 48, 49, 52, 57,
66). Estos incluyen métodos basados en la conductancia/impedancia eléctrica, en la separación
inmunomagnética (IMS), en los enzimoinmunoensayos (ELISA), métodos de la PCR con sondas génicas,
incluyendo la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) (6) y en la PCR en tiempo real
(16, 31, 40) o cuantitativa (41). Muchos de estos métodos no han sido validados para muestras fecales y
ambientales, y resultan más adecuados para el análisis de alimentos humanos (39). Los métodos rápidos suelen
ser más costosos que los cultivos convencionales, pero pueden resultar económicamente viables para analizar
materiales donde se espera una prevalencia baja de contaminación o donde los materiales, como los alimentos,
están pendientes de una prueba negativa. Un método de enriquecimiento/IMS en combinación con un ELISA o
PCR puede proporcionar resultados en 24 horas. En la actualidad, ninguno de los métodos rápidos se ha
mostrado adecuado para la detección directa de Salmonella, de modo que se necesitan etapas de
enriquecimiento selectivo o no selectivo (37). Esto introduce más pasos en el proceso de detección y requiere
más tiempo para el operador. En los métodos basados en el ADN, la inhibición de la reacción de la PCR por
elementos de la matriz de la muestra, especialmente en el caso de las heces, resulta problemática y requiere
técnicas adecuadas de extracción del ADN (23). Los métodos de aislamiento rápido pueden también estar
ligados a sistemas de detección sofisticados, como biosensores (38). En los métodos rápidos para detección de
Salmonella hay muchas variaciones y avances, pero ninguno parece reemplazar satisfactoriamente al cultivo en
todas las circunstancias. Por tanto, no es posible dar detalles de todos los métodos en este capítulo o hacer
recomendaciones, pero los artículos de revisión citados más arriba contienen información adicional. Actualmente
se están haciendo esfuerzos para estandarizar a nivel internacional el empleo de algunos métodos rápidos (30),
pero todavía existe una cantidad considerable de trabajo pendiente.

Ejemplo de procedimiento de un método para aislar Salmonella de alimentos, piensos,
muestras fecales y ambientales
i)
Se añade una muestra de 10–25 g a ×10 volúmenes de agua de peptona tamponada a temperatura
ambiente. (NB: en el caso de muchos serotipos adaptados a un hospedador, y algunos serotipos
arizonae, es preferible añadir la muestra a un medio selectivo de enriquecimiento, como caldo
selenito-cisteína, y probar muestras de tejido cuando sea posible [incluyendo la siembra directa; véase
el método de cultivo para S. Pullorum/Gallinarum en el capítulo 2.3.11 de este Manual].
ii)
Se incuba el agua de peptona tamponada durante 16–20 horas a 37°C.
iii)
Se inocula, con 0,2 ml del agua de peptona tamponada incubada, 20 ml de medio semisólido
modificado de Rappaport–Vassiliadis o DIASALM en una placa de Petri.
iv)
Se inocula, con 1ml del agua de peptona tamponada incubada, 10 ml de caldo de tetrationato.
v)
Se incuba el medio semisólido modificado de Rappaport–Vassiliadis o DIASALM a 41,5°C y el caldo
de tetrationato a 37°C (se ha de estar seguro de que se utiliza una marca fiable de tetrationato para
uso a 37°C).
vi)
Después de 24 y 48 horas de enriquecimiento selectivo, se resiembra del medio semisólido modificado
de Rappaport–Vassiliadis tomando material del borde de la zona turbia con el asa de 1 µl y
extendiéndolo por siembra en estría sobre una placa con agar de Rambach o agar verde brillante y
sobre una placa con agar xilosa-lisina-desoxicolato más novobiocina.
vii)
Se resiembran 10 µl del caldo de tetrationato sobre agar de Rambach o agar verde brillante y sobre
agar xilosa-lisina-desoxicolato más novobiocina.
viii) Se incuban las placas a 37°C durante 24 horas.
ix)
Se examinan cinco colonias sospechosas (rojas/rosas con enrojecimiento del medio en el caso de
agar verde brillante, carmesí con bordes pálidos o naranjas/sin color en agar Rambach, rojas con
centro negro en agar xilosa-lisina-desoxicolato) utilizando antisuero poli “O” y poli “H” (fase 1 y fase 2)
o medios bioquímicos compuestos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
7
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis
x)
Se subcultivan las colonias muy sospechosas que no aglutinen con antisueros poli H en medios no
selectivos y se repeten después las pruebas. Si se obtiene una aglutinación fuerte con poli O y poli H,
esto es suficiente para una confirmación preliminar. Tales aislamientos se pueden luego seroagrupar.
Si los resultados de la aglutinación no son claros, hay que realizar más pruebas bioquímicas utilizando
medios compuestos como el TSI o emplear ONPG (o-nitrofenil-beta-d-galactopiranósido) y urea o
pruebas bioquímicas comerciales, como el API ID 32 E.
2.
Pruebas serológicas

Identificación serológica de animales y de explotaciones infectadas
Se han desarrollado varias pruebas serológicas para diagnosticar las infecciones por Salmonella en animales. En
aves, para la identificación de granjas infectadas con S. Pullorum/Gallinarum, se han utilizado con éxito durante
más de 50 años la prueba de sangre completa, que utiliza un antígeno teñido, y la prueba de aglutinación sérica
(SAT). Como S. Enteridis posee el mismo antígeno somático del grupo D que S. Pullorum/Gallinarum, la prueba
de sangre completa y otras relacionadas pueden utilizarse en el diagnóstico de la infección, pero la sensibilidad
es baja. Recientemente se han desarrollado otras pruebas, como las de tipo ELISA (58), para el diagnóstico de
las infecciones por S. Enteritidis y S. Typhimurium y para otros serotipos de animales de granja. Los ensayos
ELISA se han utilizado con eficacia para identificar serológicamente ganado portador de S. Dublin y se pueden
aplicar a la leche sin tratar, para analizar ganado estabulado de producción láctea. En Dinamarca se utiliza un
ELISA mixto con suero o fluido tisular liberado por congelación y descongelación de muestras de músculo para
detectar infecciones de Salmonella en cerdos (36). Se utiliza una prueba similar para detectar anticuerpos contra
S. Enteritidis y S. Typhimurium en la yema de huevo de explotaciones comerciales de ponedoras (13).
Algunas pruebas ELISA son ahora de uso rutinario y se han comercializado varias, y ahora se requiere la
estandarización de su utilización. La finalidad de esta sección es considerar las pruebas serológicas que se han
evaluado por completo y que son de uso rutinario en el diagnóstico de la salmonelosis en animales. Por tanto, no
se considerarán otras pruebas que están aún en fase de desarrollo. Con frecuencia se presentan nuevas
pruebas para el diagnóstico de Salmonella, de modo que una búsqueda en Internet es a menudo el mejor modo
de obtener una información actualizada.

Factores que influyen en el diagnóstico serológico
1.
Los métodos serológicos deben utilizarse para identificar poblaciones infectadas más que para identificar
animales individuales infectados, aunque se pueden emplear pruebas repetidas en la explotación como una
ayuda para seleccionar los animales portadores crónicos. Normalmente, las pruebas serológicas se diseñan
para detectar un número limitado de serotipos o serogrupos de Salmonella.
2.
Se sabe que algunos animales con respuesta serológica positiva no pueden ser infectados de nuevo por
Salmonella. De modo similar, animales que excretan activamente Salmonella pueden ser serológicamente
negativos. También se aplican consideraciones similares a los métodos de cultivo bacteriológico, y así, los
cultivos fecales con resultados negativos no indican necesariamente que el animal no está infectado. Sin
embargo, ninguna de estas situaciones debe considerarse como un problema importante si se realizan
suficientes pruebas. Los animales que son serológicamente positivos pueden haber cesado de excretar
Salmonella aunque las concentraciones de inmunoglobulinas circulantes pueden permanecer altas. Otros
animales de la granja pueden estar todavía infectados. Los animales serológicamente negativos pueden ser
el resultado de una infección reciente que origine la excreción antes de que la producción de
inmunoglobulinas sea máxima, o de una infección con serotipos menos invasivos. Con toda probabilidad,
los animales que han sido infectados recientemente serán detectados serológicamente por un programa
adecuado de análisis a lo largo de la vida de la explotación.
3.
Los animales recién nacidos son inmunológicamente inmaduros y no responden serológicamente al
antígeno somático LPS hasta las 2–3 semanas de edad. Sin embargo, sí producen una respuesta
serológica a los antígenos de la proteína flagelar. El ganado bovino puede no responder serológicamente
hasta las 10–12 semanas de edad y es posible que los lechones no desarrollen una respuesta inmune o
posean una respuesta de anticuerpos que refleja la inmunidad materna. Las respuestas diferenciadas que
implican diferentes clases de anticuerpos (IgM, IgA, IgG) pueden utilizarse en cerdos para distinguir las
infecciones recientes de las antiguas, pero con frecuencia eso no es de utilidad para ensayar piaras en las
que los individuos se hallan normalmente en diferentes fases de la infección. La mayoría de las pruebas se
basan en la IgG, y es típico que aparezcan elevados niveles de anticuerpos entre 1 y 3 semanas después
de la infección y que duren entre 2 y 3 meses.
Los pollos pueden también adquirir pasivamente anticuerpos anti-salmonella de sus progenitores a través
del saco vitelino; esto puede indicar que la población de los padres estaba infectada. Los mamíferos
pueden adquirir anticuerpos de la madre a través del calostro.
8
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis
4.
Durante muchos años se ha utilizado la inmunización para controlar ciertas infecciones por Salmonella en
animales de granja y, si se emplea serología en el diagnóstico, es necesario diferenciar entre la respuesta a
la vacuna y a una infección real. Muchas vacunas vivas que se administran oralmente no proporcionan una
respuesta de anticuerpos séricos significativa en la mayoría de los animales, pero puede haber excepciones
ocasionales. Las vacunas muertas inyectables utilizadas para el control de S. Enteritidis en pollos pueden
producir una respuesta de anticuerpos muy prolongada. Sería muy provechoso que se pudiera fabricar una
vacuna viva marcada que se pudiera diferenciar del desafío de campo mediante pruebas serológicas.
5.
El efecto de la terapia con antibióticos en la respuesta serológica no está claro. Algunos investigadores
encuentran títulos reducidos después de la terapia, mientras que otros no detectan efecto alguno. No
obstante, si se ha empleado terapia antimicrobiana, la serología puede ser una técnica de diagnóstico para
la salmonelosis más útil que el cultivo.
6.
Existen aproximadamente 2.500 serotipos diferentes de Salmonella. Dependiendo del antígeno y de la
prueba utilizada, pueden ocurrir reacciones serológicas cruzadas entre diferentes serotipos, por ejemplo
entre S. Typhimurium, S. Pullorum y S. Enteritidis. En algunos casos pueden ocurrir reacciones cruzadas
como resultado de la exposición a microorganismos distintos de Salmonella.
7.
En las aves, la yema del huevo se puede probar para detectar inmunoglobulinas frente a Salmonella, y los
huevos representan, por tanto, un método para analizar explotaciones. En Dinamarca se emplea esta
estrategia para controlar explotaciones comerciales de ponedoras. En el ganado bovino, se puede utilizar la
leche para la detección de anticuerpos anti-Salmonella para analizar las explotaciones de producción
láctea.
8.
La utilización de discos de papel de filtro para recoger suero elimina la necesidad de separar el suero. Los
discos también permiten la conservación a largo plazo y reducen los costes de transporte al laboratorio. La
sensibilidad de la prueba puede resultar levemente reducida en comparación con las pruebas realizadas
con suero fresco.
a)
La prueba de sangre completa
La prueba de sangre completa es una prueba rápida para la tifosis aviar y la pulorosis que puede utilizarse
en la granja. La sensibilidad de esta prueba es baja y, sin experiencia, se pueden registrar muchos
resultados como falsos positivos y falsos negativos.
Para una descripción detallada de la prueba de sangre completa, véase el capítulo 2.3.11 Tifosis aviar y
pulorosis.
b)
Prueba rápida de aglutinación en porta
El suero (0,02 ml) se mezcla con antígeno polivalente teñido con cristal violeta (0,02 ml). El porta se mueve
cuidadosamente durante 2 minutos, tras los cuales se ve el resultado de la prueba. Los componentes de la
prueba se guardan a 4°C y antes de usarlos deben alcanzar la temperatura ambiente.
Los sueros problema deben estar libres de contaminantes y de hemolisis. Puede ser conveniente
centrifugar las muestras de suero que se hayan mantenido guardadas por algún tiempo.
Si se sospecha la existencia de reacciones falsas positivas inespecíficas, los sueros positivo/sospechosos
deben probarse de nuevo después de una inactivación térmica a 56°C durante 30 minutos.
c)
Prueba de aglutinación sérica
La SAT es relativamente poco sensible, y muchos animales viejos tienen niveles bajos de aglutininas en sus
sueros debido a enterobacterias distintas a Salmonella. Las muestras aisladas carecen de valor diagnóstico
excepto como muestras para el examen inicial del rebaño. Se necesitan muestras pareadas como requisito
mínimo para confirmar una infección activa. La prueba es relativamente barata; los antígenos se pueden preparar
con facilidad y no se requiere un equipo costoso. La SAT se puede adaptar a formato de microtitulación y se
puede utilizar para determinar títulos somáticos o flagelares. Se recomienda utilizar para SAT un suero estándar y
otros métodos confirmativos para el control de la pureza y la inmunogenicidad de las preparaciones de
antígeno(s) para SAT, que no dependan de los sueros producidos a partir de dichos antígenos.
•
Preparación del antígeno somático
i)
Se resiembra Salmonella, desde el cultivo apropiado de mantenimiento, a una placa con medio agarsangre base (BAB), u otro medio adecuado, para crecimiento de colonias aisladas. Incubar durante
toda la noche a 37°C (±2°C).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
9
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis
ii)
Se selecciona una colonia lisa y realizar una prueba de aglutinación en porta para confirmar que está
presente el antígeno somático requerido.
iii)
Mediante un asa estéril, se inocula con la colonia seleccionada un tubo de agar nutritivo inclinado.
iv)
Se incuba el cultivo durante 8–12 horas a 37°C (±2°C).
v)
Con una pipeta Pasteur, se retira el crecimiento, preferentemente en una cabina de seguridad, con
aproximadamente 2 ml de alcohol absoluto y se transfiere el contenido a un tubo estéril.
vi)
Se deja el antígeno a temperatura ambiente durante 4–6 horas para que el alcohol mate las bacterias
y suelte los flagelos.
vii)
Se centrifuga el tubo en una centrífuga de mesa durante 5 minutos a 1.000 g. Se vierte el líquido y se
añade suficiente solución salina con fenol para conseguir que el antígeno alcance una opacidad
equivalente a la de un tubo No. 2 en la escala de Braun (aproximadamente 108 unidades formadoras
de colonias/ml) u otro estándar apropiado.
viii) Se realiza una titulación estándar con un suero conocido para confirmar que el antígeno es positivo
para el factor requerido.
d)
ix)
Se guarda en un refrigerador a 4°C hasta su utilización.

Preparación de antígenos flagelares
i)
Se resiembra Salmonella, desde el cultivo apropiado de mantenimiento, a una placa con medio BAB, u
otro medio adecuado. Incubar durante toda la noche a 37°C (±2°C).
ii)
Se realiza un pase en medio semisólido (con aproximadamente 0,3% de agar) en un tubo de Craigie,
u otro contenedor adecuado, para inducir la expresión óptima del antígeno flagelar apropiado. Si el
serotipo es bifásico, se añade al medio antisuero H que corresponda a la fase a suprimir.
iii)
Se utiliza la aglutinación en porta para comprobar que Salmonella está en la fase requerida. Si es así,
se inocula con un asa de cultivo 20 ml de caldo nutritivo. Se incuba durante 12–18 horas a 37°C
(±2°C) para un crecimiento óptimo. (Si la fase es incorrecta, se vuelve a pasar por el medio
semisólido).
iv)
Se pipetean en la suspensión de antígeno 250 µl de formaldehído al 40% (se deben usar guantes y se
debe trabajar preferiblemente en una cabina de seguridad), y se deja toda la noche.
v)
Se prueba el antígeno por SAT utilizando el suero de tipificación apropiado.

Procedimiento de la prueba
i)
Es más fácil analizar los sueros a una dilución de 1/20; se añaden 0,25 ml de antígeno a 0,25 ml de
suero prediluido a 1/10 en solución salina normal.
ii)
Las mezclas se incuban en un baño de agua a 50°C durante 24 horas en el caso de los antígenos
somáticos, y durante 4 horas, para los antígenos flagelares. La dilución y el tiempo de incubación
puede variar dependiendo del antisuero usado.
iii)
Los sueros que dan reacción positiva se diluyen luego de 1/20 a 1/320 y se vuelven a probar con el
antígeno apropiado.
ELISA para Salmonella Enteritidis
Para la detección de IgG (IgY) específica para S. Enteritidis, existen dos sistemas básicos principales: el
ELISA indirecto (2) y el ELISA competitivo “ tipo sandwich” (58).
El ELISA indirecto supone el uso de un antígeno detector que recubre los pocillos de una placa de
microtitulación. Después de aplicar un reactivo bloqueante para reducir uniones inespecíficas, se añaden a
los pocillos las muestras problema. El anticuerpo de la muestra que se une específicamente se detecta con
un conjugado anticuerpo/enzima. Se han utilizado varios antígenos, incluyendo LPS, flagelos, fimbrias SEF
14, proteínas de la membrana externa y preparaciones de antígenos celulares totales.
El ELISA sándwich competitivo emplea un reactivo específico – un anticuerpo monoclonal (MAb) o
policlonal – para recubrir los pocillos de antígeno. Luego se añade una preparación pura o cruda de
antígeno. Después se aplican las muestras problema seguidas por el anticuerpo conjugado, que no se unirá
al antígeno si la muestra contiene anticuerpos específicos. El tiempo de ensayo se puede acortar
añadiendo simultáneamente la muestra problema y el conjugado. Se ha preparado MAb de LPS, flagelos y
SEF14 de S. Enteritidis.
Ambos sistemas presentan ventajas y desventajas. El ensayo indirecto es más simple y hay reactivos
disponibles para todos los serotipos de Salmonella de pollos, pavos, patos y mamíferos. El ELISA
10
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis
competitivo se puede aplicar a todas las especies animales y, en general, muestra mayor especificidad. Sin
embargo, no hay reactivos comercializados para todos los serotipos. También hay algunos problemas de
afinidad y puede ser menos sensible que las técnicas indirectas. En condiciones de campo, ambos sistemas
han producido reacciones positivas falsas y en algunos casos el análisis con un ELISA indirecto con LPS
puede confirmarse después con un ELISA competitivo flagelar.
Ambos tipos de ensayo pueden utilizarse con suero, yema de huevo o sangre seca reconstituida eluida de
discos de papel de filtro. En Dinamarca y otros países se emplea un ELISA mixto (o ELISA de jugo de
carne) para detectar infecciones de Salmonella en cerdos (36). Este ELISA contiene los antígenos “O” de
tipo 1, 4, 5, 6, 7 y 12 del LPS de S. Typhimurium y S. Cholerasuis, lo que capacita al ensayo para detectar
serológicamente el 95% de los serogrupos de Salmonella que se encuentran en los cerdos de la mayoría
de países europeos. También se han añadido antígenos del grupo D a algunos kits para ELISA. El suero se
utiliza para analizar granjas de producción y multiplicación, mientras que, para cerdos en el matadero, se
realiza el ensayo con el fluido tisular (“jugo de carne”) que se libera cuando se descongelan 10 g de
muestra de músculo congelado.
Con algunos ELISA se puede diferenciar entre las infecciones producidas por serotipos de Salmonella de
diferentes serogrupos. Entre los grupos B y D y otros serotipos invasivos se produce alguna reacción
cruzada. Sin embargo, normalmente hay una mayor respuesta de anticuerpos cuando en el ELISA se utiliza
LPS del serotipo homólogo. Aún no se ha decidido ni existe acuerdo internacional sobre cuál es el mejor
método para establecer un valor de “corte” en la absorbancia, por encima del cual los sueros se designan
como procedentes de una población afectada por S. Enteritidis, sin que se produzca un nivel inaceptable de
resultados positivos falsos.
Los ELISA están adaptados a la automatización y, por tanto, a programas de muestreo a gran escala. Un
problema importante es que se necesita un equipo costoso, y muchos de los reactivos son también caros.
Hay varias preparaciones ELISA y ELISA-mixtas comercializadas para S. Enteritidis, S. Typhimurium y
Grupo B/C. En teoría, estas deberían validarse mediante ensayos internacionales coordinados antes de
adoptarse a efectos de control.
Un ejemplo de un ELISA validado es el desarrollado por el Laboratorio de Referencia de la OIE de VLA
Weybridge (ver dirección en el Cuadro de la parte 3 de este Manual). Los requisitos se indican a
continuación.

Equipo
Placas de PVC, tipo Falcon microprueba III; pipetas apropiadas y cilindros de medida; lavador de placas de
microprueba; lector de placas ELISA; filtro de prueba de 405–410 nm y filtro de referencia de 630 nm.

Antígeno
i)
El LPS de S. Enteritidis extraído con fenol está comercialmente disponible (Catálogo Sigma
No. L6011). Este se reconstituye en 1 ml de agua desionizada y se guarda a –20°C en alícuotas de
100 µl en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7, a una concentración de 2,5 mg/ml. Para
su uso, el antígeno debe ser descongelado en tampón de recubrimiento a la concentración apropiada.
ii)
El antígeno LPS también se puede preparar por la técnica de Westphal & Luderitz (62) y estandarizar,
en lo que respecta a su concentración en carbohidrato, por el método de Gerhardt (15) a una
concentración ajustada a 1.000 µg/ml.

Diluyente del suero y del conjugado
Se añade seroalbúmina bovina (BSA) (2 g) y Tween 20 (0,05 ml) a PBS (100 ml) (Alternativamente, la leche
en polvo [1 g] puede reemplazar a la BSA). Se guarda a 4°C y se hacen soluciones frescas cada semana.
Tampón de recubrimiento: Se añade carbonato sódico (1.59 g) y bicarbonato sódico (2.93 g) a agua
desionizada (1 litro) y se ajusta a pH 9,6. (Alternativamente, se disuelve una tableta de tampón 0,05 M
carbonato/bicarbonato de Sigma [No. Catálogo C-3041] en agua desionizada [100 ml]). Se guarda a 4°C y
se renueva cada 2 semanas.
Tampón de substrato: Se prepara una solución de dietanolamina al 10% (v/v) en agua desionizada. La
dietanolamina debe precalentarse a 37°C antes de distribuirse, y el pH de la solución debe ajustarse a
pH 9,8 con ácido clorhídrico 1 M. Se guarda a 4°C y se renueva cada 2 semanas.
Conjugado enzimático: Inmunoglobulina anti-pollo de cabra conjugada a fosfatasa alcalina (por ejemplo,
ICN Immunobiologicals, o como suministro alternativo de Sigma: A9171) o globulina anti-pollo de otras
especies. Se guarda a 4°C diluida en diluyente a la concentración apropiada y se renueva cada semana.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
11
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis
Substrato del enzima: Se disuelve una tableta de p-nitrofenil fosfato disódico (5 mg) en tampón de substrato
(5 ml) no antes de 30 minutos de su uso, y se mantiene en la oscuridad.

Estándares
i)
Antisuero control positivo preparado por inoculación intramuscular de cuatro pollos libres de patógenos
específicos (SPF) de 1 semana de edad con un inóculo que contenga 106 S. Enteritidis. El suero se
obtiene 3–4 semanas después, cuando los títulos de anticuerpo son máximos.
ii)
Suero control negativo A de cuatro aves SPF de 1 semana de edad.
iii)
Suero control negativo B de 58 productoras de 1 semana de edad que estén libres de infecciones por
Salmonella. Se juntan los sueros y se guardan en volúmenes de 100 µl a –20°C.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO
Se utilizan muchas vacunas inactivadas contra la salmonelosis causada por serotipos diferentes en varias
especies animales, incluyendo una vacuna combinada contra S. Enteritidis y S. Typhimurium para empleo en
aves. La inactivación se realiza normalmente por calentamiento o por tratamiento con formalina y se suele utilizar
un adyuvante, como el hidróxido alumínico. En varios países también se han utilizado vacunas vivas; estas
incluyen las cepas semi-rugosas, tales como la 9R para la tifosis aviar y la HWS51 para las infecciones por
S. dublin (33). Otras vacunas atenuadas incluyen mutantes autotróficos y “de deriva metabólica”, que se usan en
Alemania para evitar infecciones por Salmonella en animales de granja y en el Reino Unido para S. Enteritidis y
S. Typhimurium en aves de corral. Se han desarrollado vacunas mutantes, atenuadas racionalmente por
supresión de genes mediante técnicas de biología molecular, para aves de corral y para otras especies; estas
comprenden los mutantes aroA y las cepas con mutaciones en los genes que codifican la adenilato ciclasa (cya)
y la proteína receptora del adenosín monofosfato cíclico (crp) (7), disponibles en los EE.UU. Normalmente, en
Europa no se permite el uso como vacunas de microorganismos genéticamente modificados.
Las normas para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el capítulo 1.1.8. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las directrices que se indican aquí y en el capítulo 1.1.8 son de carácter
general y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Para vacunas vivas o muertas, la cepa bacteriana debe de estar lo más estrechamente relacionada que sea
posible con las cepas salvajes de circulación actual. Debe escogerse cuidadosamente de casos de
enfermedad clínica grave y debe determinarse su virulencia y la producción de antígeno. Es mejor evaluar
varias cepas potenciales de este modo antes de probar la selección+ final. Las cepas vacunales finales
deben identificarse por documentación histórica y caracterizarse por marcadores fenotípicos y/o genéticos
estables. Las cepas de vacunas vivas deberán poseer caracteres estables que permitan su distinción de las
cepas salvajes. Se pueden usar marcadores de resistencia a antimicrobianos, por ejemplo a rifampicina. La
atenuación de la virulencia debe ser estable y lograrse preferiblemente por dos mutaciones independientes
definidas. La estabilidad de las cepas vacunales vivas puede verificarse mediante comprobaciones
periódicas utilizando la determinación molecular sensible (de las huellas de ADN) y las técnicas de
hibridación en microarrays.
b)
Método de cultivo
El cultivo de inóculo se propaga y mantiene utilizando medios adecuados, muchos de los cuales se han
descrito (en libros de texto) para el crecimiento de Salmonella. Los medios empleados no deben contener
suero ni tejidos animales. El cultivo puede ser en medio sólido, en frascos de Roux, o en medio líquido, en
cuyo caso se puede utilizar un equipo de fermentación a gran escala. La limitación de hierro o la incubación a
baja temperatura en un medio mínimo puede aumentar la producción de antígeno LPS por la cepa vacunal.
c)
Validación como una vacuna
i)
Pureza
La cepa vacunal debe comprobarse del siguiente modo:





12
Tinción de un frotis de suspensión bacteriana en un porta de vidrio empleando la tinción de Gram.
Homogeneidad del cultivo en medios no selectivos.
Requerimientos metabólicos indicados por pruebas bioquímicas.
Detección de marcadores, y fagotipia.
Aglutinación con antisuero específico.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis
ii)
Inocuidad
Se debe determinar en ratones la LD50 (dosis letal 50%) o la ID50 (dosis infectiva 50%). A la especie a
vacunar se le debe suministrar diez veces la dosis de campo de vacuna viva, o el doble de la dosis de
vacuna inactivada, a la edad y por la ruta recomendadas. Los animales se observan para comprobar
la ausencia de reacciones adversas. Para las vacunas vivas debe demostrarse su estabilidad y la
ausencia de reversión a la virulencia después de pases seriados en especies susceptibles. También
es necesario considerar vacunaciones repetidas. Debe demostrarse que las vacunas vivas no
persisten por mucho tiempo en los animales vacunados o que no se transmitan a la leche o a los
huevos que puedan consumirse, y el método de aplicación no debería presentar riesgos a los
operadores.
iii)
Eficacia
Para demostrar que la vacuna es eficaz deben utilizarse experimentos de laboratorio y ensayos de
campo. Los experimentos de laboratorio consisten en pruebas de vacunación e inoculaciones de
desafío en la especie a vacunar, a las dosis y edad recomendadas. Los datos sobre eficacia también
pueden utilizarse como base para la prueba de potencia de los lotes. Los ensayos de campo para
probar la eficacia son más difíciles de realizar, debido a las dificultades para estandarizar las
condiciones del desafío y disponer de los controles apropiados.
iv)
Aspectos ambientales
Las vacunas vivas deben probarse respecto a su capacidad para persistir en el ambiente e infectar
otras especies, como roedores o aves salvajes que puedan resultar expuestas. La supervivencia
prolongada de algunas vacunas vivas en las heces y en las camas puede representar un riesgo
ambiental inaceptable cuando el material se extrae de los habitáculos animales. No deberían usarse
vacunas vivas durante la puesta de huevos.
2.
Método de producción
Las vacunas deben producirse en habitaciones limpias y adecuadas a las que solo tenga acceso personal
autorizado. Se debe tener cuidado en evitar la contaminación cruzada entre áreas donde se procesan
microorganismos vivos y otras zonas. Debe evitarse la contaminación de los operadores y del medio, y la
preparación de las vacunas debe tener lugar en una zona separada de la de trabajo con cultivos para
diagnóstico. Los operarios no deben manejar la vacuna mientras estén enfermos y no deben estar sometidos a
condiciones inmunosupresoras o a medicación. En las áreas de producción y en las habitaciones para animales
se debe suministrar ropa protectora al personal.
A partir del cultivo del inóculo primario se preparan lotes de cultivos de siembra, y el número de pases depende
de la validación del proceso. La vacuna se puede preparar por inoculación de un medio adecuado, como caldo
nutritivo, con un cultivo reciente y mediante incubación en un agitador a 37°C durante 24 horas, con o sin
aireación. Los microorganismos se recogen por sedimentación o centrifugación. Alternativamente, los
microorganismos se pueden cultivar y recoger tanto de medios sólidos, como de agar nutritivo. En el caso de
vacunas vivas, la suspensión se diluye en PBS, pH 7,0, y se puede liofilizar.
El tiempo de inactivación para una vacuna muerta debe ser al menos un 33% superior al necesario para reducir
el número de viables a un nivel indetectable. El proceso de inactivación se debe aplicar a todo el volumen de
células recogidas como vacuna.
Los conservantes, excipientes para la liofilización, estabilizadores para recipientes multidosis y otras substancias
añadidas o en combinación con las vacunas no deben tener efecto perjudicial sobre la potencia inmunizante del
producto.
3.
Control interno
Los siguientes aspectos requieren atención:
 Control visual de la suspensión, homogeneidad por la tinción de Gram, cultivo en medio no selectivo.
 Aglutinación en porta con antisueros específicos.
 Titulación de bacterias por turbidimetría y/o recuento en placa.
 Prueba de inactivación eficaz (vacunas muertas) sembrando en medio no selectivo o utilizando un medio que
proporcione óptimo crecimiento, por ejemplo, medio de producción con la neutralización del compuesto
inactivante.
 Titulación de bacterias viables (vacunas vivas) antes y después de la liofilización.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
13
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos se encuentran en el
capítulo 1.1.9.
b)
Inocuidad
Se puede utilizar una prueba de laboratorio en ratones, que previamente se haya visto que se correlaciona
con la seguridad en la especie a vacunar, para determinar la LD50 y/o la ID50. Cada lote se debe probar en
la especie que se ha de vacunar, a la edad y por la vía recomendada, utilizando al menos dos veces la
dosis de campo para vacunas muertas y diez veces la dosis para vacunas vivas.
c)
Potencia
La potencia se prueba utilizando ensayos de vacunación-desafío en ratones y otras especies, incluyendo (si
es posible) la especie que se ha de vacunar y la respuesta inmunológica en la especie que se ha de
vacunar.
d)
Duración de la inmunidad
La duración de la inmunidad suele variar considerablemente según los productos, los regímenes de
vacunación y los animales individuales vacunados. La inmunidad a Salmonella es normalmente específica
de serogrupo. Las consultas entre colegas sugieren que la mayoría de las vacunas muertas proporcionan
protección durante 6 meses, mientras que algunas vacunas vivas administradas mediante inyección
inducen una inmunidad más fuerte, que puede persistir durante 1 año o más. Debe recordarse, sin
embargo, que un desafío fuerte como el asociado a granjas de ocupación continua o a roedores infectados
puede superar la inmunidad vacunal y las vacunas vivas comerciales pueden ser atenuadas para reducir la
supervivencia ambiental de forma tal que disminuya la respuesta inmune. También pueden presentarse
problemas con la administración oral eficaz de la vacuna, con las vacunas vacías o con la precisión de la
inyección de vacunas inyectables vivas y muertas.
e)
Estabilidad
Se carece de información sobre la estabilidad de las vacunas muertas. La estabilidad está afectada por las
condiciones de conservación y por la presencia de microorganismos contaminantes creciendo en el
producto. La estabilidad se determina por pruebas de potencia repetidas a intervalos temporales
adecuados. La estabilidad de las vacunas vivas se puede determinar realizando un recuento del número de
microorganismos viables de modo repetitivo a intervalos temporales adecuados.
f)
Conservantes
En las vacunas bacterianas muertas se incluyen a menudo compuestos con actividad antimicrobiana como
conservantes, del tipo del tiomersal, fenol o cristal violeta.
g)
Precauciones
En ocasiones, algunas vacunas muertas pueden causar aborto en hembras preñadas debido a su
contenido en LPS, y las vacunas vivas deben utilizarse también con precaución en estos animales. A veces,
sin embargo, es necesario vacunar hembras preñadas para proporcionar inmunidad maternal a su
descendencia. Puede resultar útil incluir en el programa de pruebas de seguridad un ensayo de
endotoxinas, de modo que se puedan comparar los niveles con aquellos que se muestran seguros en las
pruebas de doble dosis. Las vacunas también pueden causar inflamación en el sitio de la inyección.
5.
Pruebas del producto final
a)
Inocuidad
Las vacunas muertas se ensayan en una prueba de dosis doble y las vacunas vivas en una prueba que
utiliza diez veces la dosis, en la especie a vacunar.
b)
Potencia
La prueba de potencia debe relacionarse con la eficacia de la vacuna en la especie a la que va dirigida, si
es posible, y se deben aplicar criterios adecuados para aprobar los lotes. Es posible estimar las vacunas
muertas por la respuesta producida de anticuerpos anti O-H, aunque debe tenerse en cuenta que los
14
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis
anticuerpos séricos son solamente una parte de los mecanismos de protección del hospedador contra
Salmonella. Alternativamente, la potencia de la vacuna se puede estimar por su efecto sobre la LD50 en
ratones.
D. EXCLUSIÓN COMPETITIVA
En las aves de corral, la susceptibilidad a la infección por Salmonella puede reducirse notablemente mediante un
tratamiento oral o en aerosol – antes de su exposición al microorganismo (es ideal en la eclosión del huevo) –
con un cultivo de microflora anaeróbica del ciego, que inhibe la colonización de Salmonella, ocupando los sitios
de la colonización intestinal, produciendo ácidos y otras sustancias inhibidoras y estimulando las respuestas
inmunes generalizadas de tipo local y mucosal. En algunos países este tratamiento se utiliza con frecuencia,
pero en otros solo se emplea como ayuda para descontaminar granjas con infección persistente. También es útil
minimizar la alteración de la flora intestinal tras el tratamiento microbiano o el estrés y potenciar el efecto de las
vacunas administradas a continuación. Al igual que ocurría con el tratamiento que disminuye la prevalencia o las
cantidades de microorganismos de Salmonella excretados por grupos de animales infectados, puede ocurrir
alguna interferencia con programas de vigilancia y puede tener que ajustarse el muestreo y la sensibilidad de la
prueba para compensar ese inconveniente (1, 34, 47).
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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la salmonelosis (véase el cuadro en la parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consúltese la lista más actualizada en la página web de la OIE: www.oie.int).
18
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008