RENIBACTERIOSIS (Renibacterium salmoninarum)

NB: Esta enfermedad ya no aparece en la lista
del capítulo 1.2.3 del Código de animales acuáticos.
Este capítulo no ha sido actualizado desde 2003.
CAPITULO 2.1.11.
RENIBACTERIOSIS
(Renibacterium salmoninarum)
RESUMEN
La renibacteriosis (RB) causada por Renibacterium salmoninarum ocurre en la mayoría de los sitios
donde se cultivan peces salmónidos o donde existen en estado silvestre (25, 26). Los salmónidos varían en
su susceptibilidad a la RB, y generalmente se considera que las especies del salmón del Pacífico del género
Oncorhynchus son las más susceptibles (21, 26, 49, 52). La RB puede causar una mortalidad grave en
salmónidos juveniles de agua dulce y marina, así como en adultos antes del desove. Se ha descrito la
enfermedad en Norteamérica y en muchos países de Europa, y también en Japón, Chile e Islandia (2, 21,
25, 27). Los brotes de RB más frecuentes han ocurrido en piscifactorías, y la extensión de la RB ha ido en
paralelo con la expansión del cultivo de salmónidos (25). Se ha descrito también RB a nivel clínico en
peces silvestres (5, 36, 39, 45), incluyendo poblaciones naturales en desove en las que nunca se habían
introducido peces de criadero (22, 51). Aunque la naturaleza crónica de la enfermedad ha impedido una
estimación exacta de la pérdida de peces, particularmente entre las poblaciones de peces silvestres, la RB
continúa siendo una de las enfermedades bacterianas más importantes de peces que afectan a los salmónidos
cultivados. Se han descrito pérdidas elevadas, de hasta el 80% en producciones de salmón del Pacífico y del
40% en el salmón del Atlántico (Salmo salar) (25).
Renibacterium salmoninarum es un diplobacilo Gram-positivo pequeño (0.3–0.1 µm × 1.0–1.5 µm),
inmóvil, que no forma esporas ni es ácido-alcohol resistente (27). Típicamente, causa una infección
sistémica lenta y progresiva, con enfermedad raramente manifiesta hasta que el pez tiene 6–12 meses (21).
Los peces con infección grave por R. salmoninarum pueden carecer de síntomas externos o manifestar uno
o más de los siguientes: letargia; oscurecimiento de la piel; distensión abdominal por ascitis; branquias
pálidas asociadas con anemia; exoftalmos; hemorragias perianales; y cavidades quísticas en el músculo
esquelético. El examen interno revela la presencia de lesiones nodulares focales o multifocales de color gris
blanquecino en el riñón, y a veces en el bazo e hígado. Además, puede haber líquido turbio en la cavidad
abdominal, hemorragias en la pared del abdomen y en las vísceras y una capa membranosa difusa y blanca
(pseudomembrana) en uno o más de los órganos internos. En cortes tisulares de las lesiones de la RB, se
observa frecuentemente R. salmoninarum dentro de células fagocíticas, particularmente en macrófagos. La
bacteria parece sobrevivir y quizás replicarse dentro de estas células (4, 10, 31, 57).
La bacteria de la enfermedad renal puede transmitirse horizontalmente a partir de peces infectados que
comparten el suministro de agua (6, 38), y verticalmente mediante los huevos de padres infectados (23,
43). Como con otras enfermedades infecciosas de salmónidos que son difíciles o imposibles de erradicar, se
recomiendan medidas preventivas para el control de la RB en las existencias de salmónidos cultivados (1,
21). Debido a que R. salmoninarum es a menudo endémico en las poblaciones de salmónidos silvestres
(9, 22, 34), las medidas para controlar las pérdidas causadas por la RB pueden anularse por la
exposición constante de los criaderos a la bacteria transmitida por el agua mediante descargas originadas
por peces silvestres que residen aguas arriba de los criaderos (33, 38). Los salmónidos que se crían en agua
de mar presentan problemas especiales porque es difícil asegurar una separación adecuada de grupos de
peces para evitar la transmisión horizontal y por la posibilidad de que otras especies marinas puedan
actuar como reservorio de R. salmoninarum (7, 14, 50, 54).
Para reducir la posibilidad de la transmisión vertical de R. salmoninarum en salmónidos cultivados, se
usa en la actualidad la segregación de reproductores o la selección, para escoger lotes de huevos como fuente
de peces juveniles para cría (30, 43, 55). El proceso de selección intenta el desarrollo de lotes de huevos de
progenitores con niveles indetectables o muy bajos de R. salmoninarum. Esto requiere el uso de métodos
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Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.11. — Renibacteriosis (Renibacterium salmoninarum)
muy sensibles de detección de la RB para determinar la prevalencia y los niveles de R. salmoninarum en
cada pez parental. Elliott & Barila (16) opinan que la prueba de filtración en membrana con anticuerpo
fluorescente (MF-FAT) proporciona la sensibilidad y la cuantificación necesaria para investigar la relación
entre el nivel de R. salmoninarum en las madres y la probabilidad de transmitir la enfermedad a la
descendencia. Pascho et al. (43) han demostrado con posterioridad la utilidad de segregar a los
reproductores para controlar las pérdidas por RB mediante MF-FAT junto con la prueba de
enzimoinmunoensayo para escoger lotes de huevos de progenitores de salmón rosado infectados con muy altos
o muy bajos niveles de R. salmoninarum. Estos investigadores describieron que las pérdidas por RB entre
la descendencia de padres con muy bajos niveles de R. salmoninarum fueron significativamente menores
que las de la progenie de padres con niveles muy altos de infección. No obstante, se debe entender en
acuicultura que la segregación de reproductores no puede eliminar por completo la RB de una población
afectada. Como los reproductores usados para producción comercial de peces deben estar libres de la bacteria
de la enfermedad renal, es necesario repoblar una piscifactoría contaminada con peces procedentes de una
población libre de RB.
Es importante para el éxito de cualquier programa de control de la RB la aplicación de métodos de
diagnóstico fiables que puedan detectar bajos niveles de R. salmoninarum en diferentes tipos de muestras.
Por tal motivo, los especialistas en sanidad pesquera y los investigadores están interesados en el desarrollo
de métodos rápidos y fiables para detectar infecciones por R. salmoninarum (29, 41, 42, 48, 56). A
medida que se ha desarrollado una prueba nueva, ha habido una cierta tendencia a abandonar las técnicas
anteriores. Sin embargo, no se ha desarrollado todavía una única prueba ideal para detectar la presencia de
RB en múltiples muestras.
PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO
El cultivo bacteriano continúa siendo el método de referencia para determinar la viabilidad de
Renibacterium salmoninarum en una muestra, y también para cuantificar en número de bacterias en las
muestras. Sin embargo, los procedimientos de inmunodiagnóstico han llegado a ser los más usados en el
análisis de gran número de peces en instalaciones de acuicultura o en peces silvestres. Los dos métodos
principales de inmunodiagnóstico son el enzimoinmunoensayo (ELISA) y la prueba con anticuerpo
fluorescente (FAT). Las pruebas de diagnóstico basadas en ácidos nucleicos, como la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), son ahora aceptables para confirmar la identificación de R. salmoninarum en
cultivos y en tejidos de peces o en muestras de fluidos corporales.
Procedimientos de muestreo: véase el capítulo I.1, secciones B y C.
1. MÉTODOS ESTANDARIZADOS DE ANÁLISIS DE RENIBACTERIUM SALMONINARUM
El análisis y el diagnóstico de la enfermedad renal bacteriana (RB) deben basarse en pruebas de ELISA
y en pruebas de FAT. La confirmación de R. salmoninarum debe hacerse por cultivo bacteriano en
medio KDM-2 (del inglés, kidney disease medium), o por PCR. La preparación de muestras y los
procedimientos de procesamiento se detallan más adelante.
2. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE RENIBACTERIUM SALMONINARUM
2.1. Enzimoinmunoensayo para pruebas de tejido, plasma y líquido celómico
El procedimiento recomendado se basa en el método de Pascho & Mulcahy (44) modificado por
Pascho et al. (43). También hay otros métodos ELISA disponibles comercialmente (46).
a) Materiales y reactivos
i)
Tubos de muestreo
Los tubos de muestreo recomendados son tubos estériles de microcentrífuga de 2 ml con
graduaciones marcadas, espacio para escribir, y una tapadera de cierre atornillado.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo 2.1.11. — Renibacteriosis (Renibacterium salmoninarum)
ii)
Preparación del diluyente para la muestra analizada y el control
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, suplementada con 0,05% (v/v) de
Tween 20 (PBST), y 0,01% (p/v) de timerosal como conservante. Para 1 litro: 8,00 g de
NaCl, 0,20 g de KH2PO4, 1,09 g de Na2HPO4, 0,20 g de KCl, 0,10 g de timerosal,
confirmar pH = 7,4, y 0,5 ml de Tween 20.
iii) Microplacas de 96 pocillos
Para ELISA debe usarse una microplaca con 96 pocillos diseñada para inmunoensayo. La
prestación de estas placas varía y para un ELISA dado se deben probar microplacas de
varios fabricantes para determinar la más adecuada.
iv) Antígeno del control positivo
Células de Renibacterium salmoninarum (0,5% [p/v] de células en peso húmedo) en PBS,
pH 7,4, con 0,01% (p/v) de timerosal. Las células bacterianas se pueden liofilizar para
mantenimiento a largo plazo; normalmente las bacterias liofilizadas llevan un compuesto
estabilizador, como dextrosa. Las bacterias liofilizadas se rehidratan con 1,0 ml de agua
con grado de reactivo y se preparan las diluciones necesarias, 1/100, 1/500, 1/1.000, y
1/5.000 (v/v), en PBST, guardándose a –70°C.
v)
Tampón de recubrimiento
Se prepara carbonato sódico o se compra una solución comercial de recubrimiento.
Bicarbonato sódico, pH 9,6: se guarda a temperatura ambiente y se desecha a los 30 días.
Para 1 litro: 1,59 g de Na2CO3, 2,93 g de NaHCO3, y 0,10 g de timerosal, confirmar pH
= 9,6.
Solución comercial de recubrimiento concentrada: guardar y diluir según las instrucciones
del comerciante.
vi) Solución de lavado
PBST, o una solución comercial de lavado que contenga Tween 20. Para cada ELISA
preparar una solución de lavado fresca. O bien, hacer PBST como se ha descrito
anteriormente, o diluir el concentrado de solución de lavado comercial siguiendo las
instrucciones del fabricante.
vii) Diluyente del conjugado
Se prepara fresco para cada ELISA. Se usa PBST como se describe antes, o en sustitución
de Tween 20 usar 2% (p/v) de leche en polvo descremada. También hay disponibles
productos comerciales concentrados, a menudo comercializados como diluyentes o
soluciones bloqueadoras.
viii) Substrato ABTS–peroxidasa–cromógeno
Existen productos comercializados y a menudo se suministran como un sistema en dos
partes: el cromógeno ABTS – 0,6 g/litro de ABTS (ácido 2,2’-azino-di-[3-etilbenzotiazolin]-6-sulfónico) en tampón glicina, y peróxido de hidrógeno como substrato –
0,02% peróxido de hidrógeno en un tampón con ácido cítrico.
ix) Solución de frenado
5% (v/v) de dodecil sulfato sódico (SDS). Se prepara en agua de grado reactivo
inmediatamente antes de uso.
b) Anticuerpo y conjugado de recubrimiento
i)
Anticuerpo de recubrimiento
Inmunoglobulina contra R. salmoninarum purificada por afinidad: se rehidrata el
anticuerpo de recubrimiento liofilizado mezclando primero 1,0 ml glicerol + 1,0 ml de
agua grado reactivo que contiene 0,2% (p/v; 2×) timerosal, y luego se transfiere 1,0 ml de
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Capítulo 2.1.11. — Renibacteriosis (Renibacterium salmoninarum)
la solución de glicerol al 50% a cada vial del producto. Se rehidrata el contenido de un
número de viales suficiente para analizar el número previsto de peces que se muestrearán
en una estación determinada de desove. Se mezcla el contenido de todos los viales y luego
se distribuye en varios crioviales que se guardan a –70°C.
ii)
Conjugado
Inmunoglobulina contra R. salmoninarum purificada por afinidad y marcada con
peroxidasa de rábano (HRPO): se rehidrata el anticuerpo de recubrimiento liofilizado
mezclando primero 1,0 ml glicerol + 1,0 ml de agua de grado reactivo que contiene 0,2%
(p/v; 2×) timerosal, y luego se transfiere 1,0 ml de la solución de glicerol al 50% a cada
vial del producto. Se rehidrata el contenido de un número de viales suficiente para
analizar el número previsto de peces que se muestrearán en una estación de desove
determinada. Se junta el contenido de todos los viales y luego se distribuye en varios
crioviales que se guardan a –70°C.
iii) Concentraciones de trabajo del anticuerpo de recubrimiento y del conjugado.
Las concentraciones de trabajo del anticuerpo anti-R. salmoninarum purificado de cabra
(anticuerpo de recubrimiento), y del anti-R. salmoninarum de cabra conjugado con HRPO
se deben determinar primero por titulación en tabla de doble entrada con el anticuerpo de
recubrimiento y el conjugado con HRPO.
NOTA: Típicamente, el anticuerpo anti-R. salmoninarum se deposita 1 µg por ml en los
pocillos de la microplaca; la dilución se hace de una preparación concentrada de
anticuerpo a 1 mg/ml, y la dilución de trabajo del anticuerpo conjugado con HRPO es
por lo general cerca de 1/2000 (v/v).
c) Toma de muestras y preparación
i)
Pez adulto
Tejido renal, 1/4 (p/v): una parte de tejido + tres partes de PBST. Se recogen 2–5 g en
total; cuando se muestrea el riñón, se recomienda que esta muestra consista en una
mezcla de pequeños trozos de tejido de la parte anterior, media y posterior del riñón.
Fluido ovárico, 1/2 (v/v): un volumen de fluido ovárico + un volumen de PBST.
Recoger aproximadamente 1 ml.
Plasma, 1/5 (p/v): un volumen de sangre completa + cuatro volúmenes de PBST.
Recoger la sangre con jeringa o con un tubo capilar, luego poner el volumen correcto de
sangre en el volumen apropiado de PBST, eliminar la fracción celular por centrifugación a
baja velocidad, decantar y analizar después el sobrenadante.
Normalmente las muestras se toman después del desove. Hay que tomar precaución para
evitar la contaminación cruzada entre peces y la contaminación de muestras de tejidos
con los fluidos corporales. Las muestras de tejido y las de los fluidos corporales se
mantienen en hielo durante la recolección. Guardar a -70ºC.
ii)
Pez juvenil
Mezclar tejido de riñón y bazo, a una dilución recomendada de 1/4 (p/v), pero se puede
usar a 1/8 (p/v): una parte de tejido + siete partes de PBST. Los peces juveniles con
frecuencia se recogen completos y se diseccionan en el laboratorio. De cada pez se extrae
todo el riñón y el bazo. Es preferible analizar tejidos de peces individuales pero se puede
hacer una mezcla si los peces son demasiado pequeños. Se recomienda hacer dos mezclas
de peces cuando se recoge una cantidad insuficiente de tejido de un pez individual.
Guardar a –70°C.
Plasma, dilución recomendada 1/5 (p/v) pero puede usarse a 1/10 (p/v): un volumen de
sangre completa + nueve volúmenes de PBST. Recoger la sangre con jeringa o con un
tubo capilar, luego poner el volumen correcto de sangre en el volumen apropiado de
PBST, eliminar la fracción celular por centrifugación a baja velocidad, decantar el
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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sobrenadante, guardar el líquido o calentar a 100ºC durante 15 minutos, y analizar el
sobrenadante. Guardar a –70°C.
d) Procesamiento de la muestra para ELISA
i)
Se preparan para ELISA las muestras de tejido del pez o los fluidos corporales como se
describió antes.
ii)
Se calienta cada muestra a 100°C durante 30 minutos, luego se centrifuga a 8.00010.000 g durante 10 minutos a 4°C. Si las muestras se prepararon antes y se congelaron,
se descongelan antes de calentar.
iii) Las muestras procesadas y calentadas se guardan a 4°C, o se congelan a –70°C para
análisis posterior.
e) ELISA, día 1
NOTA: Antes de comenzar el ELISA, los usuarios deberían revisar las aplicaciones de los
controles y los reactivos apropiados que se describen en el cuadro 1.
i)
Se diluye el anticuerpo concentrado de cabra contra R. salmoninarum en tampón de
recubrimiento: tampón de recubrimiento carbonato/ bicarbonato, pH 9,6, o una solución
de recubrimiento comercial. Cuando se emplea esta solución se hace una preparación
fresca para cada ELISA. El tampón carbonato/bicarbonato se suele desechar después de
30 días. Se usa agua de grado reactivo o similar.
ii)
Los pocillos del control del conjugado y del control del substrato/cromógeno no reciben
anticuerpo de recubrimiento. Se colocan 200 µl de tampón de recubrimiento en cada uno
de estos pocillos.
iii) Los pocillos de los blancos, los controles negativos, los controles positivos, y los pocillos
para analizar las muestras reciben 200 µl de anticuerpo de recubrimiento.
iv) Cada placa se sella con un sellador adhesivo después de añadir el tampón o el anticuerpo
de recubrimiento. Cada placa se coloca en una cámara húmeda y se incuba a 4°C durante
16 horas.
Cuadro 1. Controles de ELISA para detectar Renibacterium salmoninarum
Grupo de
control
Blanco
Referencia
o controles
positivos
Control
negativo
Control del
conjugado
Control del
substrato/
cromógeno
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Propósito
Niveles de absorbancia
de fondo en ausencia de
muestra de prueba
Control interno que
asegura absorbancia a
ciertos niveles de
antígeno
Absorbancia producida
por muestra de un pez
control negativo
Asegura inexistencia de
unión inespecífica del
conjugado a la superficie
del pocillo o al
anticuerpo de
recubrimiento
Prueba para producción
no enzimática del color
de la reacción
Anticuerpo de
recubrimiento
Pasos en el ELISA
Adición de Conjugado Substrato/
muestra
cromógeno
Solución
de frenado
Sí
PBST solo
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Solo tampón de
recubrimiento
PBST solo
Sí
Sí
Sí
Solo Tampón de
recubrimiento
PBST solo
Solo
diluyente
Sí
Sí
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Capítulo 2.1.11. — Renibacteriosis (Renibacterium salmoninarum)
f) ELISA, día 2
i)
Se prepara solución de lavado PBST o se diluye una solución concentrada de lavado
comercial en agua de grado reactivo, y se guarda toda la noche a 4°C. Durante el ELISA
la solución de lavado debe estar a temperatura ambiente.
ii)
Se elimina el anticuerpo de recubrimiento no unido lavando cada placa cinco veces,
dejando remojar durante 30 segundos cada vez que se rellenan los pocillos. Se elimina el
exceso de tampón de lavado de cada placa tras completar los cinco lavados. Se lavan las
placas por orden numérico.
iii) Se depositan alícuotas de los controles y de las muestras analizadas en los pocillos de las
microplacas. Los siguientes pocillos de control reciben 200 µl del diluyente de las
muestras analizadas (PBS, pH 7,4, suplementado con 0,05% [v/v] de Tween 20): el
blanco, el control del conjugado, y el control del substrato/cromógeno. Los pocillos de
control del tejido reciben el tejido o fluido corporal apropiado.
iv) Se depositan alícuotas de 200 µl de cada control positivo en los pocillos adecuados.
v)
Se depositan alícuotas de 200 µl de cada muestra analizada de prueba en los pocillos
adecuados.
vi) Se cubre cada placa con un sellador adhesivo y se incuba 3 horas a 25°C en una cámara
húmeda. Cada microplaca se lava cinco veces como se describió previamente.
vii) Se distribuyen 200 µl del conjugado diluido en los pocillos adecuados. Los pocillos
control del substrato/cromógeno reciben una cantidad equivalente de diluyente sin
anticuerpo conjugado.
viii) Cada placa se cierra con un sellador y se incuba en una cámara húmeda durante 2 horas a
25°C.
ix) Se lavan las microplacas cinco veces como se ha descrito previamente.
x)
Reacción con el substrato/cromógeno.
El tiempo de reacción con el substrato/cromógeno es crítico. La reacción debe pararse
exactamente a los 20 minutos. El volumen de la solución de frenado es 50 µl para
asegurar que los pocillos no rebosen. La solución de frenado con SDS se prepara de un
concentrado al 5% (v/v) como sigue: cuatro partes de concentrado + una parte de agua.
Se añade a cada pocillo 200 µl de solución de substrato/cromógeno. Se rellenan todas las
placas por orden numérico. Inmediatamente después de que todos los pocillos hayan
recibido la solución de substrato/cromógeno, se sella la placa y se pone en una cámara
húmeda a 37°C.
xi) Se detiene la reacción con el substrato/cromógeno y se mide la absorbancia. Se empieza a
añadir la solución de frenado inmediatamente después de completar el período de
incubación. Los pocillos deben recibir 50 µl de solución de frenado en la misma secuencia
usada para aplicar la solución de substrato/cromógeno. Se limpia cualquier condensación
en el fondo de la placa y se mide inmediatamente la absorbancia a 405 nm.
2.2. Técnica estándar de inmunofluorescencia directa e indirecta para analizar muestras de
tejidos y aislamiento bacteriano.
En general, hay dos tipo de procedimientos de tinción que usan anticuerpos marcados con
isotiocianato de fluoresceína (FITC): las técnicas de inmunofluorescencia indirecta y directa (IFI y
DFAT, respectivamente). El principio y las técnicas son similares, pero la indirecta usa un
segundo anticuerpo que a menudo está biotinilado para aumentar la sensibilidad. La técnica
directa se emplea más frecuentemente para la confirmación bacteriana y la tinción de
R. salmoninarum.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo 2.1.11. — Renibacteriosis (Renibacterium salmoninarum)
Hay tres pasos básicos en la DFAT: preparación y fijación de cultivos bacterianos o de tejido
renal sobre portas con pocillos múltiples; tinción de los portas con los anticuerpos reactivos; y
lectura e interpretación de los resultados sobre los portas.
a) Preparación de los portas
i)
Cultivos bacterianos puros (prueba de confirmación de aislamientos puros de
R. salmoninarum): los aislamientos puros de bacterias se diluyen en PBS y se llevan a un
porta de vidrio para microscopía. Se seca al aire y se fija en metanol absoluto durante 5–
10 minutos.
ii)
DFAT para R. salmoninarum en frotis renales de peces: después de que el frotis se ha
secado completamente, los portas se fijan en metanol durante 5–10 minutes.
b) Tinción
i)
Controles positivos y negativos: se pueden preparar portas que contengan una especie
bacteriana que no presente reacción cruzada y un control positivo, y conservarlos
refrigerados para uso como control en la tinción DFAT. Los controles positivos siempre
se usan como prueba confirmativa para identificar correctamente la morfología y la
fluorescencia de la bacteria en cuestión. El control negativo es importante para evaluar el
proceso completo de la tinción, los ruidos de fondo, y la fluorescencia inespecífica.
ii)
Se colocan los portas en la oscuridad en cámara húmeda, y en cada porta se deposita una
gota de anticuerpo específico conjugado con FITC.
iii) Se incuba 60 minutos a temperatura ambiente.
iv) Se lavan suavemente los portas con PBS, pH 7,1 (véase la sección 2.3).
v)
Se realiza una tinción de contraste con azul de Evan durante 3–4 minutos para
R. salmoninarum. (No es necesaria una tinción de contraste para la prueba confirmativa de
cultivos bacterianos puros, aunque si se desea se puede usar Rodamina)
vi) Se lava con PBS, pH 7,1.
vii) Se seca completamente al aire, y se añade medio de montaje y un cubre.
c) Lectura y valoración
Los portas se observan a 1.000 aumentos en un microscopio compuesto de fluorescencia
(indicar al fabricante la longitud de onda correcta y los filtros necesarios para microscopía de
epifluorescencia con FITC). Primero se observan los portas con los controles positivos y
negativos. Esto tiene dos propósitos: (1) asegurar la calidad del proceso de tinción (el control
positivo debe tener miles de bacterias fluorescentes, y el negativo no debe mostrar
fluorescencia); y (2) familiarizar al observador con el tamaño y la forma correcta de la bacteria
y con la magnitud del halo fluorescente en el control positivo. El observador puede utilizar el
control positivo como referencia si es necesario para confirmar bacterias sospechosas en los
pocillos analizados.
i)
Prueba de confirmación bacteriana: los aislamientos positivos con bacterias tendrán
intensa fluorescencia y la misma morfología y tamaño que el control positivo.
ii)
Frotis renales analizados para R. salmoninarum: la bacteria tendrá una pared celular
distintiva de color verde manzana, el tamaño apropiado (1 µm de largo por 0,5 µm) y la
forma adecuada (con forma arriñonada o piriforme). Se compara cualquier bacteria
sospechosa con el porta control para asegurarse de que se cumplen los tres criterios
anteriores de R. salmoninarum.
d) Guía de valoración de la técnica de inmunofluorescencia
(Basada en la descripción del Fish Pathology Section Laboratory Manual, Meyers, T.R., ed. Special
Publication 11, Alaska Dept Fish and Game, P.O. Box 25526, Juneau, AK 99802 USA.) Los
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Capítulo 2.1.11. — Renibacteriosis (Renibacterium salmoninarum)
criterios de valoración estándar para la interpretación de la FAT en frotis de tejidos se basan
en un examen mínimo de 60 campos a 1.000 aumentos.
i)
Negativo (–): no se ven organismos en treinta campos examinados.
ii)
Mas/menos (±): se observan organismos con fluorescencia dudosa o morfología no
típica del organismo. Se observa un organismo típico pero se sospecha que no procede de
la muestra examinada, es decir, de los lavados de una muestra de nivel muy positivo.
iii) Una cruz (1+): de 1-5 organismos observados. Si solo se encuentra un organismo, se
continúa el examen hasta 100 campos intentando encontrar un segundo organismo que
confirmaría la calificación 1+. Si no se detecta otro organismo, la interpretación final
como ± o 1+ es discrecional por parte del observador.
iv) Dos cruces (2+): se observan 6-50 organismos, con algunos campos negativos y otros
que contienen varios organismos típicos.
v)
Tres cruces (3+): se observan 51-150 organismos y cada campo contiene típicamente una
docena o más de organismos.
vi) Cuatro cruces (4+): más de 150 organismos, con menos de 200 organismos por campo
promedio.
vii) Clínico (C5+): más de 200 organismos por campo promedio. Es probable observar en
esta categoría lesiones grandes en los riñones de muestra
2.3. Prueba de filtración en membrana con anticuerpo fluorescente (Inmunofluorescencia en
membrana de filtración) para fluido ovárico
Este procedimiento se basa en el método de Elliott & Barila (16) modificado por Elliott &
McKibben (17).
a) Reactivos
i)
0,01 M PBS, pH 7,1
8,50 g NaCl, 1,07 g Na2HPO4 (anhidro), 0,34 g Na2H2PO4H2O (monohidrato), y agua
destilada hasta 1 litro. Conservar la solución añadiendo 0,01% (w/v) de timerosal.
ii)
PBS/Tritón
5,0 ml Tritón X-100 (Bio-Rad), y PBS, pH 7.1, hasta 1 litro. Se filtra por filtro de 0.2 µm
de poro.
iii) Solución de tripsina
1,0 g Tripsina en polvo (Difco) 1/250, y DH2O hasta 1 litro. Se mezcla la tripsina con el
agua a 4°C. La solución se clarifica filtrando a través de papel de filtro Whatman No. 1 (o
por centrifugación a 4.000 g, seguida de filtración en filtro de 0,2 µm). Se distribuye en
pequeñas alícuotas o se congela a –20°C. (La tripsina guardada a –20°C retiene la
actividad 1 o 2 meses; para una conservación más duradera hay que mantener a –70°C.)
Se descongelan alícuotas de tripsina según se requiera cada día; no re-congelar.
iv) Contraste con negro de eriocromo T
1/2000 suspensión base
0,25 g de negro de eriocrom T, y PBS, pH 7,1, hasta 500 ml. Filtrar por papel de filtro
Whatman No. 1, y luego por Whatman No. 42 (el último es opcional) para eliminar
grumos del colorante. Se guarda el colorante de contraste en botella oscura o cubierta con
papel de aluminio.
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Capítulo 2.1.11. — Renibacteriosis (Renibacterium salmoninarum)
NOTA: Hay variaciones en el contenido de colorante entre los lotes del compuesto.
Dependiendo del lote usado, para una tinción apropiada se pueden requerir de diluciones
de negro de eriocromo T (p/v en PBS) que van de 1/2000 a 1/20.000.
Suspensión de trabajo
Comprobar la calidad del colorante sobre filtros de prueba. La suspensión de contraste
preparada debe ser de color púrpura y los filtros deben de mostrar un color púrpura pero
no estar tan contrastados que aparezcan casi negros.
v)
Medio de montaje en glicerol
0,01 M PBS, pH 7,4
3,36 ml de solución A: 0,5 M KH2PO4, (anhidro, 68,04 g/litro), 16,0 ml solución B:
0,5 M K2HPO4, (anhidro, 87,09 g/litro), 8,5 g NaCl, y agua destilada hasta 1 litro.
Medio de montaje
90 ml de glicerol, 2,5 g de 1,4-diazobiciclo-(2,2,2)-octano (DABCO), y 10 ml de 0,01 M
PBS, pH 7,4. Se añade el DABCO al glicerol y se disuelve calentando suavemente la
mezcla en un baño de agua. Luego se añade el PBS. Se ajusta a pH 8,6–9,0 añadiendo
0,1 N HCl o 0,1 N NaOH cuando sea necesario. Se guarda a temperatura ambiente en
botella oscura o cubierta con papel de aluminio.
b) Preparación de la muestra
i)
Se mezclan en un tubo pequeño de centrífuga 0.5 ml de fluido ovárico con 0,5 ml de
PBS/Tritón y 0,5 ml de solución de tripsina. Se mezcla vigorosamente durante 20–
30 segundos.
ii)
La mezcla se calienta a 50°C durante 10 minutes.
iii) Con una jeringa de 3 ml equipada con una aguja (22 × 1,5 pulgadas o similar) se saca la
muestra del tubo de centrífuga y se tritura unas cuantas veces con la jeringa para romper
los grumos que quedan de material.
c) Filtración por membrana
i)
Se une la jeringa que contiene la muestra a un soporte de filtro tipo Swinney o a un
soporte con filtro desechable. El soporte debe contener un filtro de policarbonato de
13 mm de diámetro y 0,2 µm de tamaño de poro (Whatman Nuclepore, Cambridge,
Massachusetts, USA) y un filtro de apoyo de membrana de nylon de 13 mm de diámetro
y 5,0 µm (o más) de tamaño de poro (Osmonics, Minnetonka, Minnesota, USA).
NOTA: El filtro de policarbonato debe colocarse en el soporte con el lado brillante hacia
arriba (hacia la jeringa). Los filtros de policarbonato son finos y con frecuencia
desarrollan “arrugas” semejantes a las de las láminas de los soportes. Colocando un filtro
de nylon más grueso entre el filtro de policarbonato y la lámina, se ayuda a reducir la
formación de estas arrugas y por tanto se favorece que la superficie del filtro sea plana
para facilitar la observación y recuentos de las bacterias
ii)
Se pasa la muestra por el filtro.
iii) Cada filtro se lava con 3 ml de PBS/Tritón (se pasa a través del filtro con una jeringa; se
usa una jeringa distinta para cada muestra).
iv) Se deja el filtro en el soporte y se deposita 100 µl de suero contra R. salmoninarum
conjugado con FITC a la dilución de trabajo óptima. Se cubre la parte superior de los
soportes de los filtros con papel de parafina o de aluminio (alternativamente, se los coloca
en una cámara húmeda), y se incuba a temperatura ambiente y en la oscuridad durante
1 hora.
v)
232
Tras la incubación se lava cada filtro con 3 ml de PBS/Tritón forzando el lavado con una
jeringa a través del filtro.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.11. — Renibacteriosis (Renibacterium salmoninarum)
vi) Se tiñe forzando con una jeringa el paso de 1 ml de suspensión de negro de eriocrom T a
través del filtro.
vii) Se sacan los filtros de policarbonato de los soportes y se los coloca para que se sequen al
aire en portas para microsocopía. Se desechan los soportes de los filtros. Cuando los
filtros se secan se colocan una o dos gotas de medio de montaje con glicerol, pH 9, en el
centro de cada filtro y se tapa con un cubreobjetos. Se examina a 1.000 aumentos en un
microscopio equipado con epifluorescencia para FITC.
viii) El número de células de R. salmoninarum contadas sobre el filtro en un número dado de
campos microscópicos se puede convertir a células/ml de la muestra original de fluido
ovárico según la fórmula:
Células/mm2 =
(Factor de conversión) (factor de dilución) ( número total de células contadas)
Número total de campos examinados
Donde el factor de conversión es el área de la superficie de filtración dividida por el área
de un campo individual a los aumentos usados. Se puede calcular la sensibilidad teórica de
la técnica para cualquier número de campos que se desee examinar entrando ‘1’ en la
ecuación para el número total de células contadas. En general, se examinan 50 campos o
más por filtro.
ix) Para confirmar los resultados de la MF-FAT, se puede usar un procedimiento como la
PCR anidada para R. salmoninarum (11, 41).
2.4. Cultivo bacteriano
a) Muestras
Para el diagnóstico e identificación en muestras tisulares de R. salmoninarum se deben tomar
asépticamente muestras de tejido de las lesiones renales o de las lesiones en otros órganos.
Cuando no se presentan lesiones, el riñón es el órgano preferido de muestreo. En las hembras
maduras, el fluido ovárico también puede representar un material adecuado.
En controles rutinarios, para detectar individuos infectados en una población se debe
muestrear un número suficiente de peces (véase el capítulo I.1, sección B.1).
b) Aislamiento
Renibacterium salmoninarum es un organismo de crecimiento exigente que requiere una
incubación prolongada para producir colonias (2–3 semanas, a veces más, a 15°C). Son
factores requeridos la L-Cisteína y el suero, o sustitutos del suero, y se han propuesto
diferentes medios e ingredientes para mejorar su crecimiento o reducir el desarrollo de
microorganismos asociados. En la actualidad se utilizan los siguientes dos medios especiales:
•
Medio de enfermedad renal enriquecido con suero (KDM-2) o con carbón vegetal
(KDM-C) (15, 19): 0,1 g L-cisteína (clorhidrato), 1 g triptona, 0,05 g extracto de levadura,
1,5 g agar y 100 ml de agua destilada. Se ajusta el pH a 6,5–6,8 con NaOH, se distribuye
en frascos o tubos y se autoclava 20 minutos a 120°C. Se puede guardar durante 1 mes a
4°C. Se regenera antes de usar y se añade 5–10% de suero fetal bovino (FCS), o 0,1% de
carbón activado.
•
Medio selectivo de enfermedad renal (SKDM-2) (3): 0,1 g L-cisteína (clorhidrato), 0,005 g
cicloheximida, 1 g triptona, 0,05 g extracto de levadura, 1 g agar y 100 ml de agua
destilada. Se ajusta el pH a 6,8 con NaOH y se autoclava 20 minutos a 120°C. Se enfría
hasta aproximadamente 48°C, y se añaden 10% FCS y los componentes siguientes,
previamente esterilizados por filtración (0,22 µm): 0,00125 g D-cicloserina, 0,00025 g
ácido oxolínico y 0,0025 g sulfato de polimixina B (todas son concentraciones finales).
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
233
Capítulo 2.1.11. — Renibacteriosis (Renibacterium salmoninarum)
Las placas con el medio de aislamiento se secan a temperatura ambiente durante 24–
48 horas, se siembra por la superficie del agar 0,1–0,2 ml del material infeccioso, y se
incuba a 15°C en bolsas de plástico o en cámara húmeda cuando la absorción es
completa. No se ha descrito el efecto de guardar las placas con SKDM-2 sobre la eficacia
de los aditivos antimicrobianos. Se recomienda que las placas con SKDM-2 se mantengan
a 4°C y se utilicen poco después de la preparación.
Parece que el suero y el carbón probablemente actúan como agentes detoxificantes más bien
que como nutrientes esenciales, y su eficacia se ha considerado comparable (15), e incluso
opcional (53). El suplemento del medio KDM-2 con antibióticos puede reducir el problema de
los organismos de crecimiento rápido (bacterias y hongos), pero hay alguna evidencia de que
también puede inhibir al mismo R. salmoninarum (40). Otra posibilidad es supervisar las placas
regularmente a intervalos de 2–3 días, y eliminar asépticamente las colonias producidas por los
organismos de crecimiento rápido. Para mantener la viabilidad de R. salmoninarum, Evelyn (20)
recomienda la preparación de suspensiones de tejidos en medio isotónico salino enriquecido
con peptona (0,1 % [p/v]).
Cuando se dispone de un cultivo de reserva de R. salmoninarum, es posible sacar partido del
fenómeno de ‘satelismo’ descrito por Evelyn et al. (24) acelerando el crecimiento de los
aislamientos. Se pone una suspensión densa de la cepa de laboratorio en el centro de la placa y
las muestras analizadas se inoculan en la periferia. La velocidad de crecimiento y el tamaño de
la colonia de los aislamientos aumentan así notablemente. La inducción del crecimiento
también puede lograrse añadiendo al medio 1,5% (v/v) de KDM-2 gastado estéril (24).
c) Características (28, 35)
Después de un período de incubación suficientemente largo en KDM-2, KDM-C o SKDM-2,
R. salmoninarum produce colonias enteras redondeadas y elevadas, blancas o cremosas,
brillantes y lisas, de unos 2 mm de tamaño. Como media, las bacterias de peces enfermos
producirán colonias visibles tras 2–3 semanas, pero se han descrito hasta 8 semanas para el
crecimiento inicial en KDM-2, y 12 semanas en el medio selectivo SKDM-2. Los cultivos
viejos pueden tener un aspecto granular o cristalino. Los cortes transversales por dichas
colonias revelan la presencia de bacilos Gram-positivos en una matriz cristalina. Se piensa que
el material cristalino es cisteína precipitada del medio. No ocurre crecimiento en agar sangre
sin suplemento de cisteína o en agar tripticasa-levadura. Algunas cepas crecen con turbidez
uniforme en medio líquido, pero otras desarrollan un sedimento. Renibacterium salmoninarum
aparece como bacilos pequeños (0,3–1,5 × 0,1–1 µm) Gram-positivos, PAS-positivos, no
esporogénicos, inmóviles, no ácido-alcohol resistentes, frecuentemente en pares, en cadenas
cortas o en formas pleomórficas como ‘letras chinas’, especialmente en tejidos de peces.
Renibacterium salmoninarum es catalasa-positivo y oxidasa-negativo. Sus características
fenotípicas se han establecido usando sistemas API-Zym y pruebas convencionales (cuadro 2).
El perfil de R. salmoninarum en API-Zym es: – + – + – + – – + – + + – – – + – – ± – (Austin
& Austin 1999). Sin embargo, el lento crecimiento del organismo no hace muy útiles estas
pruebas en la práctica, y se emplean con más frecuencia métodos serológicos para confirmar la
identidad de las cepas aisladas.
Cuadro 2. Características de Renibacterium salmoninarum (18, 28)
234
Característica
Producción de:
Respuesta
Característica
Degradación de (continuación):
Respuesta
Fosfatasa ácida
+
ADN
–
Fosfatasa alcalina
+
Elastina
–
Butirato esterasa
–
Gelatina
–
Caprilato esterasa
+
Guanina
–
Catalasa
+
Ácido hialurónico
–
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.11. — Renibacteriosis (Renibacterium salmoninarum)
Cuadro 2. Características de Renibacterium salmoninarum (18, 28)
Característica
Producción de:
Respuesta
Característica
Degradación de (continuación):
Respuesta
Quimotripsinasa
–
Hipoxantina
–
Cistina arilamidasa
–
Lecitina
–
α-fucosidasa
–
ARN
–
α-galactosidasa
–
Almidón
–
β-galactosidasa
–
Testosterona
–
β-glucosaminidasa
–
Tributirina
+
α-glucosidasa
+
Tween 40
+
β-glucosidasa
–
Tween 60
+
β-glucuronidasa
–
Tween 80
–
Leucina arilamidasa
+
Tirosina
–
α-manosidasa
+
Xantina
–
Miristato esterasa
–
Producción de ácidos con azúcares
–
Oxidasa
–
Crecimiento en/a:
Tripsinasa
+
pH 7,8
+
Valina arilamidasa
–
Sales biliares, 0,025%, (p/v)
–
Reducción de nitrato
–
Degradación de:
Adenina
–
Cristal violeta, 0,0001% (p/v)
+
Azul de metileno, 0,001% (p/v)
−
Azul Nilo, 0,00001% (p/v)
+
Esculina
–
Fenol, 0,025% (p/v)
–
Arbutina
–
Tiocianato potásico, 1% (p/v)
–
Caseína
+
Cloruro sódico, 1%( p/v)
+ (pobre)
Quitina
–
Selenito sódico, 0,01% (p/v)
–
Condroitina
–
Acetato taloso, 0,001% (p/v)
–
Uso de::
Uso de::
4-umbeliferil (4MU)-acetato
+
4PU-heptanoato
+
4MU-butirato
+
4PU-laurato
+
4MU-β-D-celobiopiranósido
monohidrato
–
4PU-nonanoato
+
4MU-elaidato
–
4MU-oleato
+
4MU-α-L-arabinopiranósido
–
4MU-palmitato
–
4MU-2-acetamido-2-deoxi-β-Dgalactopiranósido
–
4MU-propionato
+
4MU-β-L-fucopiranósido
–
2.5. Reacción en cadena de la polimerasa anidada para analizar muestras de tejido, sangre
completa y fluido ovárico
Este procedimiento se basa en el método de la PCR anidada descrito por Chase & Pascho (11), y
Pascho et al. (41). El diseño anidado solo se debe usar con controles rigurosos para asegurar la
exactitud de cada diagnóstico, y para evitar la contaminación cruzada entre muestras. Pueden ser
deseables otros diseños cuando esto resulte difícil de lograr, pues los resultados positivos falsos
pueden tener graves consecuencias, como la innecesaria eliminación de toda una producción de
peces. Se han descrito también otros métodos moleculares de detección para el diagnóstico de las
infecciones por R. salmoninarum (8, 13, 32, 37, 47).
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
235
Capítulo 2.1.11. — Renibacteriosis (Renibacterium salmoninarum)
a) Consideraciones generales
i)
Las extracciones de ADN deben realizarse en un área libre del producto amplificado por
PCR para reducir el riesgo de contaminación.
ii)
Para evitar resultados de positivos falsos por secuencias amplificadas de ADN de otras
ocasiones, las mezclas de reacción de la primera ronda deberían prepararse también en un
área separada o bajo una campana de UV.
iii) Cada área de trabajo debe tener su propio juego de materiales, reactivos y sistemas de
pipeteo.
iv) Para cada análisis por PCR se incluyen controles múltiples de los reactivos sin ADN para
comprobar la contaminación, y se selecciona un control débilmente positivo que será
indicativo del funcionamiento de la PCR.
b) Diseño de cebadores
i)
En el protocolo de PCR anidada se usan dos pares de cebadores oligonucleotídicos. Los
cebadores se diseñaron a partir de la secuencia publicada para la proteína p57 de
R. salmoninarum (12).
ii)
Los cebadores utilizados en la primera ronda fueron: directo 75–93 (5’-AGC-TTC-GCAAGG-TGA-AGG-G-3’; P3) e inverso 438–458 (5’-GCA-ACA-GGT-TTA-TTT-GCCGGG-3; M21). El número de localización de los cebadores corresponde a la secuencia de
nucleótidos en la secuencia de lectura abierta.
iii) Los cebadores utilizados en la segunda ronda de amplificación fueron: directo 95–119 (5’ATT-CTT-CCA-CTT-CAA-CAG-TAC-AAG-G-3’, P4) e inverso 394–415 (5’-CATTAT-CGT-TAC-ACC-CGA-AAC-C-3’; M38). El número de localización de los
cebadores corresponde a la secuencia de nucleótidos en la secuencia de lectura abierta.
c) Extracción y purificación de ADN
Para purificar ácidos nucleicos de un tejido se usa un equipo de recuperación de DNA y se
siguen las instrucciones del fabricante. Normalmente, los protocolos de extracción de ADN
no tienen en cuenta la rígida pared celular de una bacteria Gram-positiva, y la bacteria podría
permanecer intacta durante los pasos de lisis. Sin embargo, el tratamiento de las muestras de
tejido y de líquidos corporales con lisozima se ha descrito como eficaz y esencial en la
recuperación del ADN y del rARN bacteriano de alta calidad (11, 47). Después de la lisis
celular inicial, se añaden 50 µl de 4× tampón con lisozima y se incuba a 37°C durante 1 hora.
Se debe consultar al fabricante las instrucciones específicas sobre este paso de lisis.
Entre los fabricantes de equipos para recuperación de ADN de tejidos están: DNeasy Tissue
Kit de Qiagen, Chatsworth, California (CA), USA; Nucleospin Tissue Kit de Clonetech Palo
Alto, CA, USA, o Clinipure Genomic ADN Kit de GeneMate, Klaysville, Utah, USA.
i)
Tejido renal: se cortan 25–50 mg de tejido en trozos pequeños y se colocan en un tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml. Se añade tampón de lisis de tejidos y se incuba siguiendo las
instrucciones del fabricante. Tras la lisis inicial del tejido, se añaden 50 µl de 4× tampón
con lisozima (80 mg/ml lisozima, 80 mM Tris/HCl, pH 8,0, 8 mM EDTA [ácido
etilendiaminotetracético]; 4,8% Tritón) y se incuba durante 1 hora a 37°C. Se continúa
con la purificación del ADN como se indica.
ii)
Fluido ovárico: se pipetea 50 µl de fluido ovárico en un tubo de microcentrífuga de
1,5 ml, se añade tampón de lisis y se incuba siguiendo las instrucciones del fabricante.
Tras la lisis inicial del tejido, se añaden 50 µl de 4× tampón con lisozima y se incuba
durante 1 hora a 37°C. Se continúa con la purificación del ADN como se indica.
iii) Sangre completa: se pipetea 50 µl de sangre completa en un tubo de microcentrífuga de
1,5 ml, se añade tampón de lisis y se incuba siguiendo las instrucciones del fabricante.
236
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.11. — Renibacteriosis (Renibacterium salmoninarum)
Tras la lisis inicial del tejido, se añaden 50 µl de 4× tampón con lisozima y se incuba
durante 1 hora a 37°C. Se continúa con la purificación del ADN como se indica.
iv) Células de Renibacterium salmoninarum: se precipitan las bacterias de la solución mediante
centrifugación a 7000 g durante 15 minutos. Se decanta el sobrenadante, se resuspende el
precipitado en tampón de lisis y se incuba siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras
la lisis inicial del tejido, se añaden 50 µl de 4× tampón con lisozima y se incuba durante
1 hora a 37°C. Se continúa con la purificación del ADN como se indica.
d) Determinación del rendimiento y la pureza de las muestras de ácido nucleico
Considerando el valor de las absorbancias a 260 nm, ajustar las muestras de ADN a una
concentración entre 0,01 y 0,1 ng/µl con agua de calidad para biología molecular. Determinar
la pureza de cada muestra de ADN calculando la relación de las lecturas a 260 nm y 280 nm.
Las muestras de ADN puro tienen una relación A260/A280 de 1,8–2,0.
e) Protocolo de la primera ronda de PCR
i)
Preparación de la mezcla de reacción para la primera ronda de PCR.
El volumen total de la PCR en primera ronda es 50 µl: 10 µl de la muestra de ácido
nucleico y 40 µl de la mezcla de reacción. Para preparar la mezcla de reacción, se combina
0,2 mM de cada nucleótido, 50 mM KCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl2,
0,2 mM de cada uno de los cebadores P3 y M21, y 2 U de polimerasa Taq.
ii)
Se añaden los reactivos de PCR en el tubo “mezcla principal” excepto el ADN molde.
iii) En los tubos de PCR, se añaden 40 µl de mezcla principal o maestra y se recubren las
muestras con una gota de aceite mineral. Se cierran las tapas fuertemente tras cada
adición.
iv) Se añaden 10 µl del ADN extraído a los tubos de PCR.
v)
En cada pocillo de reacción del termociclador, se ponen dos gotas de aceite mineral. Se
cargan las muestras en el termociclador.
vi) El termociclador se programa a 30 ciclos como sigue: desnaturalización a 94°C durante
30 segundos; hibridación a 60°C durante 30 segundos; y extensión a 72°C durante
1 minuto.
f) Protocolo de la segunda ronda de PCR
i)
Preparación de la mezcla de reacción para la segunda ronda de PCR.
El volumen total de la mezcla de reacción es 50 µl; ésta incluye 1 µl del ADN amplificado
en la primera ronda como ADN molde. Se usa la misma mezcla de reacción que en la
primera ronda excepto que se emplean los cebadores P4 y M38.
ii)
Se añaden los reactivos de PCR excepto el ADN en el tubo de la mezcla principal.
iii) En los tubos de PCR anidada, se ponen 49 µl de mezcla principal y se recubren las
muestras con una gota de aceite mineral. Se cierran las tapas fuertemente tras cada
adición.
iv) Se añade 1 µl del producto de la primera ronda de PCR a los tubos de la PCR anidada.
v)
En cada pocillo de reacción del termociclador, se ponen dos gotas de aceite mineral. Se
cargan las muestras en el termociclador.
vi) El termociclador se programa a 30 ciclos como sigue: desnaturalización a 94°C durante
30 segundos; hibridación a 60°C durante 30 segundos; y extensión a 72°C durante
1 minuto.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
237
Capítulo 2.1.11. — Renibacteriosis (Renibacterium salmoninarum)
g) Visualización del ADN amplificado
i)
Se emplean 10 µl del producto de la segunda ronda de la PCR para electroforesis en gel
de 2% de agarosa. Cada gel de electroforesis debe incluir un ADN marcador con
repeticiones espaciadas de 1 kb.
ii)
Se tiñen los geles durante 30 minutos en una solución de 5 µg/ml de bromuro de etidio,
0,02 M de hidroximetil aminometano, 0,02 M de ácido acético glacial, y 0,5 mM de
EDTA.
iii) Los geles se examinan por transiluminación con luz UV. Las muestras se consideran
positivas para R. salmoninarum si se observa el producto esperado de 320 pares de bases.
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*
* *
NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la renibacteriosis (Renibacterium salmoninarum)
(véase el cuadro al final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la lista actualizada en la página
Web de la OIE: www.oie.int).
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