1. introducción - Universidad de Sevilla

1. INTRODUCCIÓN
1.1 COMUNICACIÓN NEURONAL Y LIBERACIÓN DE
NEUROTRANSMISORES EN LA SINAPSIS
El correcto funcionamiento del sistema nervioso humano radica en la comunicación
neuronal que se lleva a cabo en determinados puntos de conexión entre las neuronas
denominados sinapsis. La sinapsis la forman por un lado un terminal nervioso, denominado
terminal presináptico -que emite una señal- y por el otro, el terminal postsináptico que recibe la
señal. La sinapsis es a su vez un punto clave de transducción de una señal eléctrica en una
señal química.
En la Figura 1-1 se describe un esquema del circuito neuronal responsable del
movimiento reflejo de flexión de la rodilla que se produce en una persona tras la
estimulación de la planta del pie. El tiempo transcurrido entre el estímulo y la respuesta es
aproximadamente 25 milisegundos. El fenómeno requiere varias etapas: (1)percepción del
estímulo por receptores de presión en una neurona sensorial, (2) conducción de una señal
eléctrica a través del axón aferente, (3) transmisión de la señal en la sinapsis entre la
neurona sensorial y una interneurona, (4) transmisión de la señal en la sinapsis entre la
interneurona y una motoneurona, (5) conducción de una señal eléctrica a través del axón
eferente (6), transmisión de la señal en la sinapsis entre la motoneurona y el músculo, que
desencadena la contracción muscular.
La precisión y eficacia de este circuito se explica por las propiedades intrínsecas de las
neuronas, que generan, transmiten y transducen señales eléctricas en señales químicas que
en última instancia da lugar a una acción determinada del organismo, por ejemplo la
contracción muscular. La señal química de mayor relevancia en el circuito es la liberación
desde el terminal presináptico de sustancias químicas denominadas neurotransmisores que
actúan sobre el terminal postsináptico. En la Figura 1-1 los lugares donde se produce
liberación de neurotransmisores están marcados con *.
Figura 1-1: Esquema simplificado del circuito neuronal responsable de la recepción de un
estímulo mecánico y la ejecución posterior de una contracción muscular. Figura modificada de
Understanding the Nervous System: an Engineering Perspective de Deutsch y Deutsch (IEEE Press,
New Jersey 1993).
Las neuronas son células excitables que conducen y amplifican señales de voltaje. La
membrana de las neuronas posee moléculas sensibles al voltaje denominadas canales
iónicos. A través de bombas específicas, la membrana neuronal mantiene constantes las
concentraciones de determinados iones (principalmente iones Na+, K+, Ca2+ y Cl-). En el
interior celular responsables de la diferencia de voltaje que se establece entre el interior de
la célula y el medio que la baña. La membrana regula a través de los canales iónicos la
permeabilidad específica a los iones mencionados. En reposo la diferencia de voltaje que se
establece a través de la membrana es de 60 a 90mV, siendo el interior negativo con
respecto al exterior.
Figura 1-2: Esquema de la conducción del impulso nervioso y la transmisión sináptica entre
dos neuronas. Tomada de Fischbach, Scientific American (1992).
El fenómeno principal de la comunicación neuronal comienza con la aparición en una
zona de la membrana neuronal de un cambio en la polaridad del potencial de membrana.
Cuando el cambio en el potencial de membrana alcanza un determinado umbral detectable
por los canales iónicos permeables al ión Na+ se produce la apertura de esos canales y el
ión Na+ fluye al interior neuronal generando una señal de voltaje denominada potencial de
acción que se transmite a través del axón hasta llegar al terminal presináptico (Figura 1-2).
En la membrana del terminal presináptico residen canales iónicos específicos para el
ión Ca2+. La llegada del potencial de acción al terminal nervioso o presináptico se detecta
por los canales iónicos de Ca2+ que se abren y, a favor de gradiente electroquímico, dejan
fluir hacia el interior neuronal el ión Ca2+. Una de las propiedades más interesantes de este
ión es que además de ser portador de carga es una señal química. El ión Ca2+ se une en el
interior celular a proteínas receptoras específicas que se activan y ejecutan determinadas
acciones en la neurona. En este contexto, la acción fundamental del Ca2+ es disparar la
liberación de los neurotransmisores desde el interior neuronal al medio extracelular. Los
neurotransmisores se almacenan aislados en pequeños compartimentos rodeados de
membrana, denominadas vesículas sinápticas y que se describen en detalle más adelante.
Los neurotransmisores son liberados al exterior cuando el Ca2+ dispara la fusión de la
membrana vesicular con la membrana celular, el interior de la vesícula entra en contacto
con el exterior celular y los neurotransmisores difunden hasta alcanzar la membrana del
terminal postsináptico. Ese fenómeno se denomina exocitosis. En la membrana postsináptica
se unen a proteínas específicas denominadas receptores postsinápticos cuya activación es la
primera etapa de la recepción de la señal. Los receptores postsinápticos pueden ser canales
iónicos específicos que se abren al unirse al neurotransmisor y dejan fluir hacia el interior
celular iones que nuevamente generan una señal eléctrica y/o química. Los receptores
postsinápticos pueden también estar acoplados a proteínas intracelulares que generan una
cascada de reacciones químicas resultante en la transducción de la señal y/o en diversas
acciones celulares.
1.2 VESÍCULAS SINÁPTICAS: MICROMÁQUINAS
MOLECULARES PARA ALMACENAR Y LIBERAR
NEUROTRANSMISORES
Las vesículas sinápticas son pequeños orgánulos de aproximadamente 50nm de
diámetro que almacenan altas concentraciones de neurotransmisor. En un terminal
presináptico se almacenan cientos de vesículas sinápticas, de las cuales un pequeño
porcentaje (generalmente menor del 10%) se sitúan en una zona especializada denominada
zona activa, donde se produce la exocitosis tras la llegada del potencial de acción al terminal
(Figura 1-3).
Figura 1-3: Sinapsis vista al microscopio electrónico. Tomada de
Heuser (http://www.heuserlab.wustl.esu)
Las vesículas sinápticas albergan en su membrana un conjunto de proteínas que
dependiendo de la función que ejercen pueden dividirse en dos grupos:
Proteínas responsables del almacenamiento del neurotransmisor. Una
proteína clave es una bomba que acumula protones dentro de la vesícula en un proceso
que supone un gasto energético. Otro grupo de proteínas funcionan como
transportadores específicos que introducen neurotransmisores en un proceso acoplado
a la salida de protones desde la vesícula.
Proteínas responsables del tráfico de la vesícula en el terminal presináptico.
En la Figura 1-4 se muestra un esquema de las principales proteínas de la vesícula
sináptica. Entre otras funciones, esas proteínas se encargan de ejecutar y regular la
fusión de las vesículas sinápticas con la membrana plasmática.
Figura 1-4: Esquema de las principales proteínas de las vesículas
sinápticas implicadas en el tráfico vesicular en los terminales nerviosos.
En la Figura 1-5 se describe el modelo más aceptado actualmente de como se lleva
a cabo este proceso. La acción de estas proteínas es fundamental para la regulación de
la liberación de neurotransmisor y por tanto para el funcionamiento global del sistema
nervioso.
Figura 1-5: Modelo de la fusión de las vesículas sinápticas y de las
proteínas que participan. Tomada de Südhof y Rizo, 2002.
La perturbación de esas proteínas en determinadas situaciones puede conducir a
enfermedades neurológicas humanas. Por ejemplo las graves consecuencias que se
derivan de intoxicaciones como el botulismo o el tétanos se deben a la existencia de
toxinas específicas que destruyen proteínas como la synaptobrevina , la sintaxina o la
SNAP-25 (proteínas descritas en la Figura 1-5). Actualmente es un reto científico de
primer orden dilucidar la función de las proteínas del terminal presináptico. En los
últimos años se han alcanzado progresos de gran relevancia en este campo mediante el
uso de técnicas de ingeniería genética en ratones, que permiten el estudio funcional de
estas proteínas en ratones genéticamente modificados a los que se les han eliminado o
mutado estas proteínas (Fernández-Chacón y Südhof, 1999). El estudio funcional
cuantitativo de la sinapsis requiere métodos sensibles que permitan cuantificar en
tiempo real la liberación de neurotransmisores. El objetivo fundamental de este
proyecto es diseñar y construir instrumentación dirigida al registro y adquisición de
señales para el estudio de la liberación de neurotransmisor en células aisladas. A
continuación se describen algunos de los métodos utilizados en la actualidad para
cuantificar la liberación de neurotransmisores.
1.3 CUANTIFICACIÓN DE LA LIBERACIÓN DE
NEUROTRANSMISORES
Existen diferentes métodos para cuantificar neurotransmisores y su aplicación
depende fundamentalmente del tipo de neurotransmisor que se pretenda registrar y del tipo
celular o neuronal que se estudie. En general los métodos electroquímicos, como se explica
más adelante, son de gran utilidad para los neurotransmisores que pueden oxidarse
aplicando a través de un microelectrodo una diferencia de potencial no superior a 1V (por
ejemplo, la dopamina, la adrenalina y la serotonina). Otros métodos como la
monitorización de los potenciales postsinápticos son útiles para registrar la actividad de
múltiples sinapsis sobre una sola neurona a las que es complicado acceder con
microelectrodos para detección electroquímica o bien liberan un neurotransmisor (por
ejemplo el glutamato) no detectable con las técnicas electroquímicas convencionales.
1.3.1 DETECCIÓN ELECTROQUÍMICA
La Electroquímica es una rama de la Química dedicada a estudiar la relación que
existe entre determinados fenómenos eléctricos y químicos. Una gran parte de esta
disciplina está dedicada al estudio de los cambios químicos que se producen con el paso de
una corriente eléctrica y la producción de energía eléctrica a partir de reacciones químicas.
La electroquímica abarca el estudio de muy diversos fenómenos (por ejemplo la
electroforesis o la corrosión), tecnologías (recubrimiento de superficies metálicas, la
producción a grandes escalas de aluminio y cloro) y aparatos (baterías y sensores
electroanalíticos) (Bard y Faulkner, 2000).
Las técnicas de detección electroquímica se vienen utilizando para estudiar la
liberación de neurotransmisor desde hace más de 30 años. Se comenzaron a utilizar para
cuantificar neurotransmisores en el cerebro completo de animales vivos (Adams, 1969).
Más recientemente estas técnicas se han refinado y utilizando microfibras de carbono (8-10
micrómetros de diámetro) es posible aplicarlas para detectar en tiempo real la secreción
que produce una sola célula (Leszczyszyn y col. (1990); Tatham y col., 1991) e incluso una
sola vesícula (Chow y col., 1992; Álvarez de Toledo y col., 1993; Alés y col., 1999). En este
aspecto es de destacar que en la Universidad de Sevilla el Prof. Álvarez de Toledo en el
Departamento de Fisiología Médica y Biofísica ha sido pionero en desarrollos tecnológicos
de detección electroquímica de alta resolución aplicados al estudio de la liberación de
neurotransmisores y ha revelado un nuevo mecanismo de liberación de neurotransmisor
denominado “kiss and run” (Álvarez de Toledo y col., 1993; Alés y col., 1999; véase también
Kandel y Schwartz, 2000). Más recientemente se han diseñado nanosensores
electroquímicos basados en electrodos de platino fabricados con nanotecnología que
pueden monitorizar simultáneamente eventos secretores en diferentes partes de una célula
(Dias y col., 2002). Una aplicación de esta nanotecnológica puede ser la construcción de
matrices con múltiples sensores asociados cada uno a una célula aislada diferente como
base tecnológica para sistemas de alto rendimiento en la industria farmacológica que
permitan estudiar simultáneamente el efecto de un gran número de fármacos sobre la
liberación de neurotransmisor.
El aspecto de la electroquímica que nos ocupa en este Proyecto Fin de Carrera es
el relativo a los sensores electroanalíticos, en particular la aplicación de sensores
electroquímicos para detectar y cuantificar neurotransmisores.
1.3.1.1 PRINCIPIOS DE LA DETECCIÓN ELECTROQUÍMICA
Las técnicas de detección electroquímica cuantifican la corriente eléctrica generada al
oxidarse ciertas moléculas cuando se le aplica un determinado potencial, característico de
cada una, denominado potencial de oxidación. En la reacción de oxidación, la molécula cede
electrones, de ahí la formación de una corriente eléctrica. El número de electrones cedidos
depende del tipo de molécula que se oxide, y es una constante conocida. Para aplicar dicho
potencial se utiliza un electrodo de vidrio con una microfibra de carbono en su interior, a
través del cual fluyen los electrones liberados en la oxidación.
La detección de moléculas disueltas en soluciones acuosas mediante estas técnicas, está
limitada a moléculas cuyos potenciales de oxidación o reducción se encuentran entre –1V y
1V. Por encima de 1V o por debajo de –1V se produce la electrolisis del agua, y la
consecuente formación de radicales libres que son tóxicos para las células.
HO
O
NH
H
O
Figura 1-6:Oxidación y reducción de la dopamina
+
NH +2e + 2H
Adrenalina
Noradrenalina
Dopamina
Dopa
Melatonina
Metanefrina
Normetanefrina
3-Metoxitiramina
A. Homovanílico
5HIAA
DOPAC
Tiramina
Octopamina
Triptamina
5-HT
5-HTP
AA
-300 mV
+1000 mV
Ácido
úrico
NO
Neuropéptidos
Antidepresivos
IMAO
β -bloqueantes
Triptófano
Tirosina
Neuropéptidos
Figura 1-7: Principales sustancias de interés biológico junto con sus potenciales de
oxidación.
Una característica importante de las medidas electroquímicas es que el número de
moléculas que han sido oxidadas o reducidas pueden ser cuantificadas si sólo un tipo de
molécula disuelta ha reaccionado y si se conoce el número de electrones transferidos por
molécula. La relación que existe entre la carga total transferida y el número de moléculas
disueltas en las inmediaciones del electrodo que han reaccionado sigue la Ley de Faraday:
Q = ∫ Idt =
zFM
= zeM
NA
Ecuación 1-1
donde Q representa la carga total involucrada en la reacción redox y se obtiene integrando la
corriente que se registra I. M representa el número de moléculas que han reaccionado; z es el
número de electrones transferidos por molécula; F es la constante de Faraday 96.485 C/mol;
NA es el número de Avogadro 6.023x1023 y e es la carga elemental del electrón 1.6x10-19 C.
Por supuesto, si existen varios tipos de moléculas oxidables que reaccionan
conjuntamente, la relación se vuelve más complicada. Afortunadamente, para varios tipos de
células, sólo se libera un tipo de sustancia oxidable, o predomina un solo tipo.
En los sistemas electroquímicos que nos conciernen, estamos interesados en los
procesos y factores que afectan el transporte de carga entre un conductor eléctrico (un
electrodo) y un conductor iónico (un electrolito). El transporte de carga en el electrodo se
debe al movimiento de electrones (y huecos), mientras que en el electrolito el transporte de
carga se debe al movimiento de iones.
PROCESOS FARADAICOS Y NO FARADAICOS
En las interfaces electrodo-solución se pueden dar dos tipos de procesos: faradaicos y
no faradaicos. Los procesos faradaicos comprenden la transferencia de electrones en la
interfaz metal-solución. Esta transferencia de electrones se debe a la existencia de reacciones
de oxidación o reducción en la solución fase, y dado que estas reacciones están gobernadas
por la Ley de Faraday (la cantidad de reacciones químicas causadas por un flujo de corriente
es proporcional a la cantidad de electricidad que pasa) se denominan procesos faradaicos.
Bajo ciertas condiciones la interfaz electrodo-solución presenta una región de potencial
en la cual no se producen transferencia de electrones, debido a que estas reacciones son
termodinámicamente o cinéticamente desfavorables. Sin embargo pueden ocurrir procesos ,
como la absorción o emisión, que cambian la estructura de la interfaz electrodo-solución
cambiando el potencial en el electrodo o la composición de la solución. Estos procesos se
denominan no faradaicos y explican que aunque no exista transferencia de carga en la
interfaz, se pueda producir corriente (al menos transitoria) cuando varia el potencial, el área
del electrodo o la composición de la solución.
Ambos procesos coexisten en los experimentos que nos conciernen, aunque sólo
los procesos faradaicos nos dan la información que buscamos en ellos. Por lo tanto los
efectos de los procesos no faradaicos deben ser tenidos en cuenta si estamos interesados en
obtener información acerca de la transferencia de carga (electrones) que se produce en la
interfaz electrodo-solución.
PROCESOS NO FARADICOS Y LA NATURALEZA DE LA INTERFAZ
ELECTRODO-SOLUCIÓN
Consideremos un electrodo ideal polarizable (IPE Ideal Polarizable Electrode), es
decir, un electrodo en el que la carga no pueda atravesar la interfaz electrodo-solución. En
este tipo de electrodos, sólo se pueden dar procesos no faradicos. Cuando aplicamos un
potencial a un IPE éste actúa como un condensador. La ecuación que gobierna la
capacidad de este condensador es:
C=
q
E
Ecuación 1-2
donde q es la carga acumulada en el condensador (en culombios C), E es el potencial
aplicado a la capacidad (en voltios V) y C es la capacidad (en faradios F).
Cuando se aplica un potencial a un condensador , se acumula carga en éste hasta que
q cumpla con la Ecuación 1-2. Durante el proceso de carga se producirá una corriente
denominada corriente de carga que fluirá a través del condensador. La carga en un
condensador consiste en un exceso de electrones en una de las placas del condensador y
una deficiencia de electrones (o exceso de huecos) en la otra (véase Figura 1-8). Para un
potencial determinado existirá una carga en el electrodo qM y una carga en la solución qS de
manera que para todo tiempo se cumplirá:
qM = qS
Ecuación 1-3
La carga en el electrodo qM representa un exceso o deficiencia de electrones y reside
en una fina capa (< 0.1 Å) en la superficie del metal, mientras que la carga en la solución qS
representa un exceso de aniones o cationes en la cercanía de la superficie del electrodo
(véase Figura 1-8). Las cargas pueden expresarse como densidades de carga sin más que
dividir por el área del electrodo: σ M = q
M
A
en unidades µC cm 2 .
Para un potencial dado, la interfaz electrodo-solución estará pues caracterizada por
un condensador de doble capa Cd , en un rango de valores típicos de 10-40 µF cm 2 . La
totalidad de las cargas y dipolos orientados que existen en la interfaz electrodo-solución se
denomina doble capa eléctrica (Bard and Faulkner, 2000).
Carga positiva en la
superficie del electrodo
Moléculas de
agua
Iones solubles
Figura 1-8: Descripción de la doble capa eléctrica en la interfaz electrodo-solución.
La corriente de carga del electrodo, forma una corriente adicional, que se suma a la
corriente producida como resultado de las reacciones de oxidación, y ha de ser tenida en
cuenta a la hora de cuantificar el número de moléculas que han reaccionado. Asumiendo
que el electrodo se modela eléctricamente como una capacidad Cd en serie con una
resistencia Rs la ecuación que seguirá la corriente transitoria de carga bajo un escalón de
potencial E y condiciones de condensador descargado inicialmente será:
i=
E − t Rs C d
e
Rs
Ecuación 1-4
PROCESOS
FARADICOS
Y
FACTORES
QUE
AFECTAN
A
LA
TRANSFERENCIA DE ELECTRONES
La tasa de transferencia de electrones se ve afectada por una serie de procesos que
contribuyen a la oxidación de las moléculas electroactivas que se encuentran en la solución.
Estos procesos se muestran en la Figura 1-9 y comprenden:
La transferencia de masa: las moléculas que se encuentran dispersas por la
solución han de estar en contacto con la superficie del electrodo para que
ocurra la reacción de oxidación.
La transferencia de electrones en la superficie del electrodo
Reacciones químicas anteriores o
posteriores a la transferencia de
electrones: pueden ser procesos homogéneos, como la dimerización, o
heterogéneos, como la descomposición catalítica.
Otras reacciones que pueden ocurrir en la superficie del electrodo: como la
absorción, emisión o cristalización (electrodeposición).
electrodo
solución total
Interfaz electrodo-solución
reacción química
Transporte de masa
absorción
emisión
ne
transferencia
de electrones
emisión
absorción
reacción química
Figura 1-9: Procesos que intervienen en la transferencia de electrones en una interfaz electrodosolución
Los dos factores más importantes que afectan a la magnitud de la corriente
resultante de la oxidación de moléculas son el transporte de masa y el porcentaje de
transferencia de electrones en la superficie del electrodo. El transporte de masa se presenta
en forma de difusión: movimiento de carga bajo la influencia de un gradiente de potencial
químico y puede ser descrito por la ecuación de Nerst-Planck (Ecuación 1-5) en una sola
dimensión:
J i ( x) = − Di
∂C i ( x)
∂x
Ecuación 1-5
donde Ji(x) es el flujo de sustancia i (mol/s· cm²) a una distancia x de la superficie
del electrodo, Di es el coeficiente de difusión (cm²/s) y
∂C i ( x)
es el gradiente de
∂x
concentración de la sustancia i a una distancia x de la superficie del electrodo.
Cuando la sustancia llega a la superficie del electrodo, entonces se produce la
reacción de oxidación y la transferencia de electrones. Para describir los procesos de
transferencia de electrones necesitamos incorporar tanto el aspecto cinético como el
termodinámico . Termodinámicamente la ecuación de Nerst (Ecuación 1-6) proporciona una
ecuación de equilibrio entre las concentraciones de sustancias oxidadas y sustancias reducidas
en la superficie del electrodo.
E = E0 +
RT Cox
ln
nF Cred
Ecuación 1-6
En esta ecuación E es el potencial aplicado en la superficie del electrodo de trabajo,
E0 es el potencial al cual se oxida la molécula en cuestión, R es la constante de gas, T es la
temperatura, n es el número de electrones transferidos, F es la constante de Faraday y Cox y
Cred son las concentraciones de sustancias oxidadas y reducidas respectivamente en la
superficie del electrodo.
El aspecto cinético viene dado por la ecuación de Butler-Volmer:
 (1 − α )na F ( E − E 0 ) 
j = − k C red (0, t ) exp 

RT


0
Ecuación 1-7
donde j es el flujo de sustancias reducidas(p.e. epinedrina, dopamina,etc.), k0 es el porcentaje
estándar y constante de transferencia de electrones, α es el coeficiente de transferencia, na es
el número de electrones que se transfieren limitando el paso en la reacción electroquímica, F
es la constante de Faraday, E es el potencial del electrodo y Cred está expresado e función del
tiempo y la distancia. Lo que nos dice la ecuación 1-7 es que el flujo es proporcional al
porcentaje estándar de transferencia de electrones, a la concentración de moléculas no
oxidadas y a la diferencia de potencial entre el electrodo y el potencial de oxidación de la
molécula. Para un potencial constante podemos escribir:
 (1 − α )na F ( E − E 0 ) 
k a = −k exp 

RT


0
Ecuación 1-8
donde ka es el porcentaje de transferencia de electrones oxidados o reducidos.
Para relacionar Cred(0,t) con la concentración total C*red tenemos que considerar el
transporte de masa.
*
− Cred (0, t )
Cred
 ∂C ( x, t ) 
jred = − Dred  red
D
≈
−
red

∂x
δ

 x =0
Ecuación 1-9
donde Dred es el coeficiente de difusión de la sustancia reducida, Cred es la concentración de la
sustancia reducida en la superficie del electrodo, x es la distancia hasta la superficie del
electrodo, t es el tiempo, C*red es la concentración total de sustancia reducida en la solución y
δ es una función del grosor de la capa de difusión. La Ecuación 1-9 nos viene a decir que el
flujo es proporcional al gradiente de concentración de sustancia reducida en la superficie del
electrodo. Bajo condiciones estacionarias la dependencia temporal de la corriente puede ser
ignorada y el valor de δ puede ser tomado como constante. Así pues combinando las
ecuaciones 1-7 y 1-9 podemos obtener la siguiente relación:
jred
*
k a Cred
=−
kδ
1+ a
Dred
Ecuación 1-10
Esta ecuación implica que cuando E, y por lo tanto ka, es grande, el flujo de electrones,
o lo que es lo mismo la corriente a través del electrodo, puede ser controlada por el
coeficiente de difusión de sustancia reducida en la superficie del electrodo. Entonces:
jred = −
*
Dred C red
δ
con unidades
(cm 2 / s )(mol / cm 3 )
mol
⇒
cm
cm 2 ⋅ s
Ecuación 1-11
Por lo tanto la corriente es proporcional a la concentración total conocido Dred y δ .
Para un valor fijado de δ la Ecuación 1-11 predice que la corriente será independiente del
tiempo, pero dependiente del voltaje. En la práctica el valor de δ y su grado de
independencia temporal se determina por condiciones experimentales y por las condiciones
de frontera usadas para resolver la Ecuación 1-5 de difusión. Para situaciones dependientes
del tiempo esta dependencia aparece en δ (Bard y Faulkner, 1980).
1.3.2 OTROS MÉTODOS EMPLEADOS EN EL ESTUDIO DE LA
LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISOR
Existen otras técnicas electrofisiológicas para el estudio de la liberación de los
neurotransmisores en neuronas, basadas en la detección del potencial o corrientes
postsinápticas que se produce durante la transmisión sináptica.
La recepción de
neurotransmisores en la membrana postsináptica conlleva la unión a receptores específicos
que disparan la apertura de canales y flujo de iones hacia el interior celular.
Ese es el caso, por ejemplo, de lo que ocurre en las neuronas del hipocampo – una
zona del cerebro implicada en los procesos de memoria y aprendizaje-. Las neuronas del
hipocampo liberan el neurotransmisor glutamato que actúa sobre los denominados
receptores ionotrópicos de glutamato desencadenando una corriente postsináptica debida a
un flujo de cationes hacia el interior neuronal. Este tipo de estudios puede llevarse a cabo
en preparaciones de rodajas de hipocampo de ratas o ratones, o bien cultivando neuronas
de ratones recién nacidos que son capaces de formar sinapsis en una placa de petri (Figura
1-10, cortesía de Pablo García-Junco Clemente, Dpto. de Fisiología Médica y Biofísica).
Este tipo de experimentos se lleva a cabo utilizando la técnica de “patch-clamp” ( Hamill y
col., 1981) que permite registrar las corrientes de pequeña magnitud (10-12 a 10-9 amperios)
que se producen en el terminal postsináptico. El registro se realiza a través de una
micropipeta de vidrio conectada un convertidor-corriente voltaje de un amplificador
(denominado amplificador de “patch-clamp”) que a su vez fija la diferencia de potencial a
través de la membrana de la célula impuesta por el experimentador.
Figura 1-10: Neuronas de hipocampo de ratón en cultivo
observadas con un sistema de contraste diferencial de
interferencias tipo Nomarski. Observese como las neuronas se
aproximan unas a otras para formar sinapsis.
Un abordaje de gran utilidad para el estudio de la liberación de neurotransmisor en
las neuronas del hipocampo es el uso de neuronas cultivadas a baja densidad que forman
conexiones sinápticas sólo consigo mismas denominadas autapsis (Bekkers y Stevens, 1991).
Estas condiciones de cultivo permiten acceder a la neurona con una micropipeta de “patchclamp” y estudiar la liberación de neurotransmisor según el siguiente proceder
experimental: (1) estimulo de la neurona con un pulso de voltaje positivo que genera un
potencial de acción que viaja a través del axón hasta llegar a los terminales presinápticos
que liberan neurotransmisor, (2) teniendo en cuenta que la neurona está formando sinapsis
consigo misma, el terminal postsináptico es la misma neurona y la corriente postsináptica
generada, proporcional a la cantidad de neurotransmisor liberada, fluye y se registra con el
mismo microelectrodo que se utilizó para estimular. En el presente Proyecto Fin de
Carrera se describirá más adelante el diseño y construcción de un generador de ondas para
uso como estimulador en múltiples tipos de experimentos y preparaciones como por
ejemplo la preparación de neuronas de hipocampo en cultivo.
2 OBJETIVOS
Los objetivos generales de este proyecto son diseñar, construir y adaptar
instrumental para la estimulación y registro de la liberación de neurotransmisores aplicable
a neuronas y a otras células vivas aisladas.
El proyecto se engloba dentro de la
construcción de un laboratorio de electrofisiología que dirige el Prof. Rafael FernándezChacón del Departamento de Fisiología Médica y Biofísica de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Sevilla y en colaboración con el Prof. Ramón Risco-Delgado del
Departamento de Física Aplicada de la Escuela Superior de Ingenieros de la misma
Universidad. El laboratorio se compone de varios módulos y será dedicado al estudio de la
liberación de neurotransmisor en animales generados mediante ingeniería genética, algunos
de ellos modelos animales para el estudio molecular de enfermedades humanas del sistema
nervioso como el retraso mental en el Síndrome de Down y los trastornos epilépticos. Los
módulos de los que consta este proyecto se han diseñado de forma que permitan integrarse
en varias configuraciones experimentales, en conjunto o individualmente. Éstas
configuraciones se detallarán más adelante.
Concretamente, los objetivos que cubre el presente Proyecto Fin de Carrera son:
Adaptación mecánica de los elementos necesarios para realizar experimentación
celulara un sistema de micromanipulación de precisión englobado dentro de un
microscopio invertido para manipulación de células vivas aisladas sobre un soporte
neumático de aislamiento de vibraciones.
Diseño y construcción de un módulo de registro y amplificación de señales
electroquímicas.
Ensamblaje y programación de una tarjeta de control y adquisición de señales, que
permita operar a través de un ordenador los módulos descritos previamente, bien en
conjunto o bien separadamente.
Diseño y construcción de un módulo de generación de ondas de voltaje para
estimulación. Este módulo ha de ser capaz de generar ondas de diferentes formas y las
características de amplitud y duración han de ser controlables tanto manualmente como
desde un ordenador PC.
3 DISPOSITIVO EXPERIMENTAL
Los módulos instrumentales objeto de este Proyecto Fin de Carrera están integrados
dentro de un dispositivo experimental (“set-up”) más complejo que se describe a
continuación.
Los experimentos se realizarán sobre células vivas aisladas y esta circunstancia
requiere que los módulos estén adaptados a un microscopio. Esta adaptación no está
exenta de complejidad ya que hay que optimizar las condiciones de manipulación mecánica
y aislamiento eléctrico de los diferentes módulos que componen el dispositivo
experimental. Este proceso de adaptación de los módulos requiere el diseño y construcción
de piezas a medida, que se describen más adelante.
Los diferentes elementos de los que se compone el dispositivo experimental de
electrofisiología se enumeran a continuación:
Mesa antivibratoria
Microscopio
Jaula de Faraday
Dos micromanipuladores
Control remoto de precisión para uno de los micromanipuladores
PC
Tarjeta de adquisición
Amplificador de amperometría
Módulo de estimulación
Los detalles de los elementos enumerados se tratan en apartados posteriores. Las
especificaciones de cada elemento se encuentran en el Anexo II.
3.1 DESCRIPCION DE LOS ELEMENTOS DEL DISPOSITIVO
EXPERIMENTAL
Actualmente , el dispositivo experimental diseñado no existe comercialmente como
tal. Por ello ha sido necesario adquirir, diseñar y construir elementos independientes y
solucionar la adaptación de todos ellos a un sistema integrado multitarea y controlado por
ordenador. Una de las características buscadas en este sistema del sistema es la flexibilidad
para desarrollar diferentes configuraciones experimentales y abrir posibilidades de
incorporación de nuevas aplicaciones en el futuro, como por ejemplo la adaptación de una
sistema de registro y análisis de imágenes celulares.
Es importante describir las necesidades de un experimento estándar para explicar la
función de cada uno de los elementos que componen el dispositivo experimental. Para
obtener registros de las células en cultivo, es necesario primero visualizar las células bajo el
microscopio. Seguidamente se han de aproximar los microelectrodos a las células bajo
control visual (véase Figura 3-1).
Figura 3-1: Imagen tomada del microscopio óptico en el que dos
microelectrodos se acercan a una célula. El microelectrodo de la izquierda es
un microelectrodo de fibra de carbón, mientras que el microelectrodo de la
derecha es una pipeta de “patch-clamp”.
La micromanipulación de los microelectrodos es crítica para evitar roturas de los
microelectrodos y colocarlos sobre la célula elegida sin dañarla. Esta operación requiere que
todo el sistema de micromanipulación y el microscopio se encuentre sobre una mesa
neumática que aísle las vibraciones mecánicas, por ejemplo las producidos por los pasos de
una persona a una distancia de varios metros del sitio donde se encuentra colocado el
dispositivo experimental. La operación también requiere el uso de micromanipuladores
controlados por control remoto que permiten desplazamientos de micras. Los
micromanipuladores han de estar adaptados al microscopio maximizando la estabilidad y
permitiendo fácil manejo por parte del experimentador.
El dispositivo cuenta con una mesa neumática antivibratoria (Technical
Manufacturing Corporation: 63-500) (véase Figura 3-2). Sobre la mesa está colocado un
microscopio invertido (Axiovert 200, Zeiss), que alberga una plataforma móvil sobre la que
se coloca una cámara receptora de fluido donde se encuentran las células vivas.
Figura 3-2: Mesa neumática antivibratoria sobre la
que se encuentra situado el microscopio
Sobre el cuerpo del microscopio se han colocado adaptadores para los
micromanipuladores que mueven los dos preamplificadores (“headstages”) a los que están
conectados los microlectrodos. La conexión de los microelectrodos a los preamplificadores
se realizan mediante unos adaptadores denominados “holder” (véase Figura 3-3).
Figura 3-3: Adaptador o “holder” para conectar los
microelectrodos a las etapas preamplificadoras
Un adaptador es para el preamplificador del amperómetro y el otro para un
preamplificador de un amplificador de “patch- clamp”. Ambos adaptadores están
enfrentados de forma que se puedan utilizar dos electrodos, uno por cada lado (véase
Figura 3-4). Estos adaptadores se describen en detalle más adelante.
Figura 3-4: Adaptadores para los preamplificadores.
Se han ensamblado a cada lado unidades de traslación que permiten el movimiento
en los tres ejes del espacio (UMR, Newport ) que el operador maneja manualmente. En
uno de los adaptadores, el dedicado al preamplificador de “patch-clamp” se ha colocado
además un micromanipulador piezoeléctrico (NV-40 serie PXY, JENA PIEZOSYSTEM)
que permite un grado muy fino de movimiento en los tres ejes por control remoto y que es
necesario para asegurar el contacto de la micropipeta con la membrana celular controlando
la posición y la velocidad de aproximación (véase Figura 3-5).
Figura 3-5: piezoeléctrico de precisión adaptado para el preamplificador de” patch-clamp”
Para solucionar la adaptación de los micromanipuladores al microscopio se ha
contado con la ayuda del Prof. García Lomas y D. Antonio Guillén del Departamento de
Materiales de la Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla. El Sr. Guillén ha colaborado en
el diseño y ha fabricado los componentes mecánicos que se describen a continuación.
Por último los componentes que no deben estar necesariamente cerca del
microscopio se colocan lo suficientemente lejos de la mesa para dejar espacio de maniobra
al usuario, y lo suficientemente cerca para permitir la utilización de estos recursos por
parte del usuario. Por ello, a la derecha de la mesa antivibratoria una estructura metálica
“rack” (ver Figura 3-6). donde se coloca el equipamiento electrónico necesario para la
realización de los experimentos. En esta estructura metálica se encuentra el PC AMD
1GHz sobre el que se implementa el sistema de adquisición de datos, el ‘Screw
Terminal Panel’ al que se conectan todas las señales que van a ser adquiridas por el
sistema de adquisición, el amplificador de amperometría que va a ser utilizado en los
experimentos y que es objeto del presente proyecto y un módulo de estimulación
también construido y diseñado como parte del Proyecto Fin de Carrera. El amplificador
de “patch-clamp” EPC10 se ubica también en esta estructura metálica.
.
Figura 3-6: Estructura metálica donde se ubica el
instrumental electrónico
3.2 DETALLE DESCRIPTIVO DE LOS ADAPTADORES
MECÁNICOS
Los adaptadores mecánicos se componen de tres elementos fundamentales:
Una plataforma perpendicular al eje vertical del microscopio que se adapta
al mástil posterior del microscopio
Dos adaptadores laterales que son brazos móviles que se insertan en la
plataforma previamente descrita. Estos brazos soportan los micromaniopuladores.
Tienen dos configuraciones de movilidad: lateral (izquierda-derecha) y giratoria.
Adaptadores para los “headstages” o preamplificadores constituidos por
una superficie circular donde se coloca una pinza que facilita la sujeción del
“headstage” y su ángulo de inclinación.
Todas las piezas descritas están realizadas en aluminio.
En la Figura 3-7 se muestra la plataforma perpendicular que se fija a presión al
microscopio. Ésta presión se materializa a través de dos tornillos. Para enroscar o
desenroscar estos tornillos no hace falta usar destornilladores, sino que poseen unos
fundas metálicas para hacerlo manualmente (véase Figura 3-8).
Figura 3-7: Plataforma perpendicular que se fija al mástil del microscopio
Figura 3-8: Vista lateral del mástil del microscopio con la
plataforma fijada a través de dos tornillos.
Los brazos laterales
que se acoplan
a la plataforma poseen dos tipos de
movimientos: lateral y rotatorio (véase Figura 3-9). Para poder realizar los movimientos
rotatorios y lineales se dispone de dos tornillos (uno para cada brazo). De nuevo para
enroscar o desenroscar estos tornillos no hace falta usar destornilladores, sino que poseen
unos fundas metálicas para hacerlo manualmente (véase Figura 3-10). A estos brazos
metálicos se acoplan los micromanipuladores donde se situarán los “headstage”. Éste
acoplamiento se realiza a través de tornillos. Los micromanipuladores se atornillan a una
plataforma que posee movimiento lineal a lo largo del brazo.
Figura 3-9: Detalle descriptivo del brazo lateral que se acopla a la plataforma
Figura 3-10: Brazo lateral sobre el que se atornilla
el micromanipulador. Vista lateral del adaptador
para las etapas preamplificadoras.
Los adaptadores para los “headstage” permiten la fijación a presión de cajas de
diferentes dimensiones (véase Figura 3-11). De nuevo, la materialización de la presión se
realiza a través de dos tornillos con fundas metálicas (véase Figuras 3-10, 3-4).
Figura 3-11: Detalle descriptivo del adaptador para las etapas preamplificadoras
Además se ha construido una plataforma rectangular para la mesa del microscopio
que aloja la camarita donde se colocan las células (véase Figuras 3-12, 3-13) Esta
plataforma también está construida en aluminio y cubierta con una plancha de acero
inoxidable ferrítico para poder fijar a ella determinados elementos con imanes, como por
ejemplo, un electrodo de plata clorurada que fija el potencial de la solución donde se
encuentra la célula a tierra.
Figura 3-12: Detalle descriptivo de la plataforma magnética para alojar la camarita
Figura 3-13: Plataforma magnética para alojar la camarita
4 DISEÑO Y CONSTRUCCIÓN DE UN AMPLIFICADOR
DE SEÑALES AMPEROMÉTRICAS
Uno de los co-tutores de este Proyecto Fin de Carrera, el Prof. Rafael FernándezChacón, trabajó durante su tesis doctoral en un sistema de detección electroquímica aplicado
al estudio de la exocitosis en células aisladas bajo la dirección del Prof. Guillermo Álvarez de
Toledo en el Departamento de Fisiología Médica y Biofísica, pionero e inventor de métodos
de alta resolución aplicados al estudio de la liberación de neurotransmisor. La experiencia y
los conocimientos adquiridos en aquel proyecto han sido de gran utilidad para la orientación
de este Proyecto Fin de Carrera, en especial lo referente al diseño del amplificador
electroquímico o amperómetro.
4.1 DESCRIPCIÓN DEL AMPLIFICADOR DE AMPEROMETRÍA
El amplificador de amperometría (véase Figura 4-1) consta de dos módulos
físicamente diferenciados:
un conversor corriente-voltaje (generalmente denominado
“headstage” o preamplificador ) y el amplificador principal. El amplificador principal está
formado a su vez por diferentes etapas: estimulación, restador, corrección de nivel de
offset, ganancia y filtrado. El amplificador posee su propia fuente de alimentación de bajo
ruido que se describirá en detalle posteriormente.
Figura 4-1: Amplificador de amperometría
El esquema básico de interconexión de las diferentes etapas se describe en la Figura
4-2. En los apartados posteriores se describen en detalle las características electrónicas de
cada una de esas etapas. Los bloques básicos o configuraciones de los diferentes
amplificadores operacionales (sumador inversor, inversor, restador, convertidor corrientevoltaje y seguidor de tensión) utilizados en el diseño de las distintas etapas se describen en
detalle (esquemas y función de transferencia) en el Anexo IV.
ESTIMULACIÓN
CORRIENTE
DE ENTRADA
ALIMENTACIÓN
CONVERTIDOR
CORRIENTE-VOLTAJE
LED
RESTADOR
CORRECCIÓN DE OFFSET
GANANCIA
FILTRADO
VOLTAJE DE
SALIDA
Figura 4-2: Diagrama de conexiones de las etapas del amplificador de amperometría
4.1.1 CONVERTIDOR CORRIENTE-VOLTAJE
El convertidor corriente voltaje se encuentra en una pequeña caja metálica
(“headstage” o preamplificador) a 5-10cm de la preparación celular y se conecta con el
amplificador principal a través de un cable de 1.5m. Es necesario colocar el preamplificador
cerca de la preparación para evitar decaimiento de la señal a través del cable de conexión.
Las señales generadas en este tipo de preparaciones son de muy pequeña magnitud
(picoamperios) y el diseño descrito es crítico para optimizar las condiciones de registro.
La conexión del convertidor corriente-voltaje con el electrodo de fibra de carbono se
realiza a través de un conector BNC. La fibra de carbono está adaptada a través de un
sistema especial de sujeción (“holder”) a este tipo de conexión. La conexión del convertidor
con el amplificador se realiza a través de un cable de ocho vías con un conector circular.
Las ocho vías de las que dispone el cable se utilizan para alimentación (3 vías), estimulación
(1vía), selección de la resistencia de realimentación (3 vías) y por último voltaje que se
obtiene de la conversión (1 vía). Además el “headstage” posee una salida de tierra para
conectar la tierra del amplificador a la tierra común de todo el dispositivo experimental.
La función del convertidor corriente-voltaje es doble. Por un lado nos permite fijar el
voltaje que se va aplicar a la fibra de carbono ( generalmente entre 600 y 900mV) y por el
otro nos permite registrar y amplificar la corriente de oxidación generada por el sustrato
que se pretende medir.
Rf
Ip
+
VOUT
VOUT = −i ⋅ R f + Vest
Vest
Figura 4-3: Esquema y función de transferencia del convertidor corriente-voltaje.
La amplificación se ha configurado con dos resistencias de realimentación de
diferentes valores intercambiables desde un interruptor que se encuentra en la caja del
amplificador. La resistencia pequeña tiene un valor de 10 M Ω y se utiliza cuando se hace
voltametría donde las corrientes esperadas son de mayor magnitud (nanoamperios). La
resistencia de mayor valor es de 1 G Ω y se utiliza para registrar en modo amperométrico
corrientes de picoamperios. El amplificador operacional que realiza la conversión es de
bajo ruido y alta precisión (OPA111AM, Burr Brown). Los detalles de esta etapa están
recogidos en el esquemático que se muestra en el Capítulo 4.2.2 dedicado a los
esquemáticos del amplificador.
Dado el alto valor de la mayor de las resistencias de realimentación (1 G Ω ), es
necesario estudiar la capacidad parásita en paralelo asociada a dicha resistencia y determinar
las limitaciones que se imponen a la respuesta en frecuencia del convertidor corrientevoltaje. A continuación se describe el proceder experimental llevado a cabo para determinar
la capacidad parásita asociada a la resistencia de realimentación.
100K
pulso
1G
C=?
Figura 4-4: Circuito para determinación de la capacidad parásita ( C) de la resistencia de
realimentación (1 Ω ). Se ha añadido un componente de resistencia en serie (100K Ω )
El experimento consistió en aplicar a través del circuito RC descrito en la Figura 4-4
una serie de pulsos cuadrados de voltaje de 1V de amplitud. La diferencia de potencial que
se establece entre los dos extremos de la resistencia de realimentación en el estado
estacionario se alcanza con una constante de tiempo (τ), que viene dada por τ =RC, donde
C es la capacidad parásita que pretendemos calcular y R es la resistencia de realimentación.
Las formas de ondas resultantes de este experimento se muestran en la figura 4-5.
Figura 4-5. Diferencia de potencial (trazo amarillo) obtenida al aplicar un pulso cuadrado de
voltaje (trazo rojo) a través del circuito de la Figura 4-4
Del análisis de estas ondas se puede deducir que la constante de tiempo τ = 0.02 ms
luego:
τ=
C
= 0.02 pF
R
siendo el ancho de banda del filtro asociado:
B = 1 = 50 KHz
τ
Este ancho de banda es suficientemente amplio para el tipo de señales que se van a
adquirir, por lo tanto no es necesario implementar una etapa de corrección en frecuencia.
Por otra parte, se ha dotado al amplificador de un sistema sencillo de monitorización
de saturación del convertidor corriente-voltaje, de forma que el operador puede detectar
inmediatamente si la señal que se está intentando adquirir es demasiado grande y saturante.
Este sistema consta de dos diodos LED en el panel exterior del amplificador. Uno de ellos
de color rojo se ilumina cuando el voltaje de salida del convertidor alcanza el voltaje de
saturación superior del amplificador operacional que realiza la conversión. Esto ocurre
cuando el voltaje supera los 11’8 V. El otro LED de color verde se ilumina cuando el
voltaje de salida del convertidor alcanza la saturación inferior del amplificador operacional
(-11.8 V).
Como se ha descrito previamente, el convertidor corriente-voltaje fija un potencial
constante Vest en el electrodo. Este potencial es suministrado por otra etapa del
amperómetro que se describe a continuación.
4.1.2
ESTIMULACIÓN
El objetivo de esta etapa es la generación del estímulo. Para utilizar el amplificador
en el modo amperométrico se fija un nivel constante de voltaje desde este módulo a través
de un potenciómetro situado en el panel externo. El rango de voltaje es de –1000 mV a
1000 mV y la precisión es de 1 mV. Este potencial se visualiza a través de un panel LED
situado en el panel externo. Para utilizar el amplificador en modo voltamétrico el estímulo
se genera sumando el potencial constante a una forma de onda. La forma de onda procede
del exterior de un generador de ondas y se introduce en el amplificador a través de un
conector BNC ( entrada de voltaje o “voltage input”). Se dispone de un interruptor para
permitir el paso de la onda al sumador, controlando de esta manera el modo de
funcionamiento amperométrico o voltamétrico. Se dispone además de una salida BNC en
el panel (monitorización del voltaje o “command monitor”) para monitorizar la estimulación
bien desde un osciloscopio, o bien adquiriendo esta señal con el sistema de adquisición
diseñado que se describe más adelante y que también forma parte de este Proyecto Fin de
Carrera. Los detalles de esta etapa están recogidos en el esquemático que se muestra en el
Capítulo 4.2.2 dedicado a los esquemáticos del amplificador.
4.1.3 RESTADOR
La función del restador es sustraer la señal de estimulación a la salida del
convertidor corriente-voltaje. De esta manera se consigue que después de esta etapa el
voltaje de salida (Vres) sea directamente proporcional a la corriente de oxidación.
Vres = −i ⋅ R f
Ecuación 4-1: voltaje a la salida del restador de estimulación
Después de efectuar la sustracción se pueden calcular las ganancias respectivas para
cada resistencia de realimentación. Aplicando la función de transferencia previamente
descrita en la ecuación 4-1 se obtiene que para la resistencia de realimentación de 10M Ω , 1
nA de corriente producirá un voltaje de salida de –10mV. Esto resulta una ganancia del
conversor corriente voltaje de –10mV/nA. Con la resistencia de realimentación de 1G Ω ,
la relación de ganancia del conversor será de –1 mV/pA.
Los detalles de este restador están recogidos en el esquemático que se muestra en el
Capítulo 4.2.2 dedicado a los esquemáticos del amplificador.
4.1.4 CORRECCIÓN DEL OFFSET
El amplificador se ha dotado de un sistema de control de la corriente de base del
electrodo. La corriente de base del electrodo puede variar dependiendo de sus
características y puede monitorizarse antes de comenzar el registro de la señal
electroquímica propiamente dicha. En determinadas ocasiones la corriente de base puede
ser especialmente elevada y superar el rango de voltaje del conversor analógico-digital
utilizado en la adquisición de las corrientes electroquímicas. El objetivo de esta etapa es,
precisamente, cancelar el exceso indeseado de voltaje (“offset”) debido a la corriente de
base. El usuario tiene la opción de activar el sistema de corrección de offset a través de un
interruptor, y regularlo con un potenciómetro que se encuentra en el panel exterior. El
rango de voltaje que puede sustraerse es de –10V a 10V. la configuración básica de esta
etapa es la configuración de restador. Esta etapa de sustracción se encuentra situada detrás
del restador de estimulación. Como el resto de las etapas, los detalles de este restador están
recogidos en el esquemático que se muestra en el Capítulo 4.2.2 dedicado a los
esquemáticos del amplificador.
4.1.5 GANANCIA
Como se ha descrito previamente, la corriente electroquímica se amplifica
inicialmente en el convertidor corriente-voltaje. No obstante es conveniente disponer de
una etapa posterior de ganancia que permita niveles adicionales de amplificación. La etapa
de ganancia la constituye un amplificador operacional en la configuración de inversor con
ganancia. En esta etapa, el valor de la resistencia de realimentación es variable y se fija
desde un conmutador bipolar situado en el panel exterior para obtener la ganancia deseada.
Los valores de ganancia de que dispone la etapa son: 0.5 (diseñada para atenuar señales de
gran tamaño), 1, 2, 5, 10, y 20.
Esta etapa se ha optimizado añadiendo un sistema de monitorización del nivel de
ganancia seleccionado. Para ello se ha implementado una salida BNC en el panel exterior
denominada monitorización de la ganancia (“gain monitor”) que da un voltaje
determinado dependiendo del nivel de ganancia seleccionado según se muestra en la Tabla
4-1.
Ganancia seleccionada
Gain monitor (V)
X0.5
0
X1
1
X2
2
X5
3
X10
4
X20
5
Tabla 4-1: Correspondencia entre la ganancia seleccionada y el
nivel de voltaje en la salida “gain monitor”.
Esta correspondencia entre ganancia y voltaje en la salida “gain monitor” se obtiene
mediante un interruptor bipolar. Las diferentes opciones del interruptor conmuntan al
mismo tiempo, por un lado, la resistencia de realimentación del inversor y por otro lado
diferentes valores de resistencia de un divisor de voltaje, dando lugar a las correspondencias
descritas en la tabla 4-1. El esquemático de este circuito se muestra en la Figura 4-6 .
Vmonitor
+5V
R/2
R
R
2R
10R
6
5
4
3
2
1
R
7
8
9
10
11
12
R
13
20R
GAIN
14
5R
SW2
R
4
5
+Vcc
2
7
1
3
R
6
+
R
-
Vin
Vout
-Vcc
Figura 4-6: Esquemático del diseño de la monitorización de la ganancia
En la Figura 4-6 se aprecia cómo el interruptor bipolar selecciona simultáneamente
la resistencia de realimentación de la configuración ganancia con inversión, y la resistencia
de salida del divisor de tensiones.
Con el objeto de mantener positiva la polaridad de la señal, tras la etapa de ganancia
se ha colocado un inversor con ganancia 1. Los detalles de los inversores que componen
esta etapa de ganancia están recogidos en el esquemático que se muestra en el Capítulo
4.2.2 dedicado a los esquemáticos del amplificador.
4.1.6 FILTRADO
Para los experimentos amperométricos el análisis de las señales se realiza en el
dominio del tiempo, no en el de la frecuencia. Por este motivo es importante que los filtros
contribuyan con la mínima distorsión en la característica temporal de la señal. En general,
los mejores filtros para los análisis en el dominio del tiempo son los filtros Bessel, porque
introducen una sobreoscilación menor del 1% en los pulsos.
La etapa de filtrado es la última que incorpora el amplificador y está compuesta por
cinco filtros Bessel de tercer orden con las siguientes frecuencias de corte: 20 Hz, 200Hz,
1KHz, 3KHz y10 KHz.
El usuario puede activar a través de un interruptor la etapa de filtrado de la señal de
salida y posteriormente, con un interruptor rotatorio bipolar, elegir la frecuencia de corte
del filtro que se quiere aplicar.
PROCEDIMIENTO DE DISEÑO
Para el diseño de los filtros paso baja Bessel de 3º orden se ha usado la topología de
Sallen-Key (Mark Sauerwald, 1997). El circuito de segundo orden Sallen-Key se muestra en la
Figura 4-7:
n²C
Vin
m²R
7
1
V+
R
3
2
Vout
6
4
5
C
+
V-
Rf
Rg
Figura 4-7:Circuito de segundo orden Sallen-Key
Este filtro se caracteriza (como cualquier otro filtro de segundo orden) por tres
parámetros: K, w0 y Q. K es la ganancia en DC del filtro. w0 es una medida de la frecuencia
de corte del filtro y Q es una medida de cuál es la separación de los polos del filtro en el
plano S. Los valores de K, Q y w0 vienen dados por :
K =1+
Rf
Rg
mn
1 + m² + (mn)²(1 − K )
1
w0 =
mnRC
Q=
Ecuación 4-2
Q y K son adimensionales y w0 viene dado en rad/s. Dividiendo w0 por 2 π lo
pasamos a Hz.
La función de transferencia de este filtro viene dada por:
k
Vout
(mnRC )²
=
Vin
s 
1
1 
1
s² +
1 − K + 1 +
  +
RC 
n ²  m²   (mnRC )²
Ecuación 4-3
La metodología de diseño de un filtro en particular comienza por seleccionar el orden
del filtro y los valores de K,Q y w0 y después usar las ecuaciones descritas más abajo para
obtener los valores de las resistencias y las capacidades. Q se obtiene usando la Tabla 4-2 de
diseño de filtros Bessel donde w0 es la frecuencia de corte deseada del filtro, ajustada por un
factor que aparece en la tabla de diseño de filtros Bessel anterior y K es otro parámetro que
elegimos según nuestras necesidades.
N
w1
Q1
w2
Q2
w3
Q3
W4
2
1.274
0.577
3
1.453
0.691
1.327
4
1.419
0.522
1.591
0.806
5
1.561
0.564
1.760
0.917
1.507
6
1.606
0.510
1.691
0.611
1.907
1.023
7
1.719
0.533
1.824
0.661
2.051
1.127
1.685
8
1.784
0.506
1.838
0.560
1.958
0.711
2.196
Tabla 4-2: Parámetros de diseño de los filtros Bessel
El procedimiento a seguir es el siguiente:
Q4
1.226
1) Seleccionar Rf y Rg para obtener el valor deseado de K.
2) Arbitrariamente seleccionar un valor de n. Este valor debe ser pequeño para
filtros con valores bajos de Q y alto para valores altos de Q. Hay que tener en
cuenta que los valores de las capacidades están limitadas por unos valores
estándar.
3) Determinar el valor de m requerido usando la siguiente ecuación y usando el
valor de Q encontrado en las tablas de diseño:
2
n
n
±   − 4(1 + n 2 (1 − K ))
Q
Q
m=
2(1 + n 2 (1 − K ))
Ecuación 4-4
4) Si no se consigue un valor real de m tenemos que seleccionar otro valor de K o
n y volver al paso 1.
5) Arbitrariamente seleccionar un valor de C.
6) Determinar el valor de w0 a usar multiplicando la frecuencia de corte deseada
por el valor de w encontrado en la tabla de diseño de filtro.
7) Determinar el valor de R requerido usando la siguiente ecuación:
R=
1
w0 mnC
Ecuación 4-5
8) Si R es demasiado alto o demasiado pequeño, seleccionar otro valor de C y
volver al paso 7. Si R es demasiado alto seleccionar un valor más alto de C y si
R es demasiado pequeño seleccionar un valor más pequeño de C.
Los filtros de orden mayor se pueden realizar poniendo en cascada filtros de orden
menor. Para filtros de orden par n se pueden poner en cascada n/2 filtros de orden 2 usando
el método descrito anteriormente, y localizando los polos del filtro con ayuda de la Tabla 4-2
de diseño de filtros activos Bessel.
Si se desea un filtro de orden impar, el último polo se añade con un filtro pasivo RC a
la salida del filtro activo. Para el caso particular de un filtro de orden 3 tendríamos la siguiente
topología (véase Figura 4-8):
n²C
Vin
m²R
7
1
V+
R
3
2
6
Vout
R3
-
C3
4
5
C
+
V-
Rf
Rg
Figura 4-8:Prototipo filtro 3º orden
siendo la función de transferencia de este filtro:
k
Vout
(mnRC )²
=
Vin
1
1 
1
s 
s² +
1 − K + 1 +
  +
RC 
n²  m²   (mnRC )²
1
R3C3

1 
 s +

R
C
3 3 

Ecuación 4-6
En la Tabla 4-3 se muestran los valores de las resistencias y condensadores para las
diferentes frecuencias de corte de los filtros diseñados para el amplificador:
20 Hz
200 Hz
1KHz
3KHz
10KHz
C
100 nF
10 nF
10 nF
1 nF
1 nF
n²C
470 nF
33 nF
33 nF
2.2 nF
2.2 nF
R
8K Ω
11K2 Ω
2K3 Ω
11K5 Ω
3K5 Ω
m²R
79 K Ω
77 K Ω
15K8 Ω
52K8 Ω
15K8 Ω
C3
100 nF
10 nF
10 nF
1 nF
1 nF
R3
60 K Ω
60 K Ω
12 K Ω
40 K Ω
12K Ω
Tabla 4-3: Valores de los componentes de los filtros diseñados para el amplificador de
amperometría
SIMULACIÓN DE LOS FILTROS DISEÑADOS
A continuación se muestran los diagramas BODE en magnitud y fase de los filtros
diseñados. Éstos diagramas se han obtenido simulando el circuito de cada filtro con el
programa WinSpice.
Filtro Bessel 3º orden 10 KHz
Filtro Bessel 3º orden 3 KHz
Filtro Bessel 3º orden 1 KHz
Filtro Bessel 3º orden 200 Hz
Filtro Bessel 3º orden 20 Hz
4.1.7 ALIMENTACIÓN
Para alimentar todo el circuito se ha optado por una fuente de alimentación de bajo
ruido, regulada, encapsulada y diseñada para su montaje dentro del equipo, de forma que se
minimicen las interferencias con las señales de pequeño amperaje que se pretenden registrar
(véase Figura 4-9). El voltaje que proporciona dicha fuente es: +15V, 0V y -15V. En el panel
exterior del amperómetro se proporciona conexión a estas tensiones a través de conectores
bananas, para poder alimentar otros circuitos de consumo pequeño. La conmutación de la
alimentación se realiza a través de un interruptor en el panel posterior. Este interruptor posee
un indicador luminoso que se enciende cuando el circuito está alimentado.
Figura 4-9: Fuente de alimentación
4.2 IMPLEMENTACIÓN DEL SISTEMA DISEÑADO.
ESQUEMÁTICOS Y TRAZADO DE PISTAS.
Para el diseño del amplificador de amperometría se ha usado el programa ORCAD.
Para los esquemáticos se ha utilizado el ORCAD Capture y para el trazado de pistas el
ORCAD Layout. Para el diseño del trazado de pistas se ha optado por usar una placa de una
sola cara negativa. El proceso de revelado y taladrado se ha realizado en los laboratorios del
Departamento de Electrónica en la Escuela de Ingenieros.
En el Anexo I se recogen las hojas de especificaciones de todos los componentes
empleados para la fabricación del instrumental objeto de este Proyecto Fin de Carrera.
Los amplificadores operacionales usados en el amplificador principal del
amperómetro son LF356N. Para la soldadura de los componentes, se han usado zócalos
que permiten una fácil sustitución de componentes en caso de fallo. La conexión de los
cables procedentes del panel exterior a la placa se ha llevado a cabo a través de conectores
roscados.
Para ajustar perfectamente las etapas de inversión, sumadores y restadores, ha sido
necesario implementar algunas de las resistencias de estas configuraciones con
potenciómetros.
El convertidor corriente-voltaje se ha montado sobre una caja de aluminio de
dimensiones 37 mm x 75 mm x 87 mm (véase Figura 4-10 ):
Figura 4-10: Montaje del convertidor corriente-voltaje en el “headstage”
La placa resultante del amplificador junto con la fuente de alimentación se han
montado sobre una caja de aluminio de dimensiones 304.8 mm x279.4 mm x88.1 mm, tal
como puede apreciarse en la Figura 4-11.
Figura 4-11: Montaje del amplificador en la caja de instrumentación
4.2.1 DESCRIPCIÓN DEL PANEL FRONTAL
El diseño del panel exterior se ha diseñado para que un usuario moderadamente
experimentado pueda identificar fácilmente las diferentes opciones operativas y de control
del amplificador. En la figura 4-12 se muestra un esquema del panel de control.
A continuación se explican los diferentes elementos del panel de control:
Headstage : es el conector de ocho vías para el convertidor corriente-voltaje. Los dos
diodos LED situados encima del conector indican saturación, uno para saturación positiva
(rojo) y el otro para saturación negativa (verde).
Amplification Max-Min : es el interruptor de selección de las dos resistencias de
realimentación del headstage: max para 1 G Ω y min para 10 M Ω .
Offset correction On-Off : es el interruptor que selecciona la opción del restador de
corrección de offset.
Offset correction: es el potenciómetro que selecciona el voltaje a restar cuando el
interruptor anterior está en On.
Gain (mV/pA): es el selector de ganancias. Si estamos usando la resistencia de
realimentación de 10 M Ω , tenemos que dividir las magnitudes por 100.
Filter On-Off: es el interruptor que selecciona la opción de filtrar la señal de salida.
Filter: es el selector de la frecuencia de corte del filtro Bessel cuando el interruptor anterior
está en On.
+15 , 0, -15: Son unas salidas de alimentación con conectores banana jack.
Voltage On-Off: es el interruptor que selecciona la opción de sumar al offset seleccionado
un voltaje externo.
DC Level: es el potenciómetro que selecciona el voltaje Dc de estimulación. El valor de
este voltaje puede verse en la pantalla LED en unidades de mV.
Stimulus Input: Es un conector BNC donde se introduce el voltaje que queremos sumar a
la señal de offset, siempre que el interruptor anterior esté en On.
Current Monitor: Es la salida del amplificador.
Gain Monitor: Es una salida BNC cuyo voltaje depende de la ganancia seleccionada en el
selector correspondiente. (ver tabla 4-1)
Command Monitor: Es una salida BNC cuyo voltaje es el voltaje que estamos
imponiendo en el microelectrodo.
88.1 mm
279.4 mm
Figura 4-12: Panel exterior
4.2.2 ESQUEMÁTICOS Y TRAZADO DE PISTAS
A continuación se muestran los esquemáticos de todas las etapas del amplificador.
Estos esquemáticos están conectados entre a través de puertos, para facilitar la
interconexión.
El trazado de las pistas se presenta a tamaño natural y también se presenta la
situación de los componentes del diseño respecto al trazado de las pistas.
2
2
3
1
POT INT 1K
3
2
SW1
1
POT INT 1K
VOLTAGE INPUT SWITCH
2
J6
WAVE
1
R23
1
R18 1K
3
3
R16 1K
6
2
+
R24
U7
6
7
1
LED
3
1
3
1
LF356
6
1
2
3
4
3
R26
POT INT 1M
COMMAND MONITOR
R27
100K
7
1
R22
1
2
4
5
2
+
2
J9
JP2
2
U5
-
R21
POT EXT 10K
4
5
70K
6
7
1
+5V
3
U16
LF356
+
2
-
-15
VEST
7
1
3
U6
+
1K
R20
70K
-
2
-
+15
4
5
4
5
R17
Title
Size
A
Date:
ETAPA DE ESTIMULACION
Document Number
Monday, November 20, 2000
Rev
Sheet
1
of
1
VHEAD
R55
30K
+15
R29
25K
R56
1
SW6
POT EXT 100K
R28
D2
10K
2
1
DIODE
OFFSET CORRECTION SWITCH
2
+15V
R53
25K
3
2
7
1
3
3
D1
DIODE
U17
+
6
VSAT
LF356
4
5
-15
-15v
Title
Size
A
Date:
OFFSET CORRECTION
Document Number
Monday, November 20, 2000
Rev
Sheet
1
of
1
ALIMENTACION(+15,0,-15)
+15
JP3
1
2
3
SW5
AMPLIFICATION MAX-MIN
1
2
3
5
1
2
R25
POT INT 2K
2
+
6
R30
POT
3
-
2
2
LF356
7
1
6
3
U8
U9
+
6
LF356
4
4
5
4
5
2
3
1
8
HEADSTAGE
7
1
7
1
VHEAD
JR1
3
R33
R32
1K
3
VEST
1K
R34
1K
R35
1K
VSAT
-15
R39
R38
1K
J10
+5V
GAIN MONITOR
1
2K
R47
2K
R19 20K
2
R40
2K
R48
20K
3
2
1
SW2
7
8
9
10
11
12
13
R15 50K
6
5
4
3
2K
1K
R44
2
R49
U11
+
6
LF356
2K
R50
1
2K
3
4
5
R46
7
1
+
3
-
2
VGAN
4
5
R43
10K
14
GAIN
R42
7
1
4K
2
R41
1K
R51
6
2K
Title
LF356
U10
ETAPA DE RESTADOR, CORRECCIÓN DE OFFSET Y GANANCIA
Size
A
Date:
Document Number
Monday, November 20, 2000
Rev
Sheet
1
of
1
C12
C15
2.2nF
+15
3
2
C13
U14
+
6
R72
R66 40K
-
15K8
LF356
4
5
1nF
3
2
C16
1nF
10KHz
U15
+
R70 12K
6
CURRENT MONITOR
J12
LF356
1
4
5
C11
1nF
-15
C14
2
-15
R71 3K4
7
1
R67 11K5
52K8 R68
+15
7
1
3KHz
2.2nF
1nF
R65
10K
R69
10K
SW4
3
6
5
4
15K8
3
2
C10
10nF
+
3
2
1
U13
R62
6
12K
FILTER
C19
+15 470nF
VGAN
C8
10nF
79K
C6 33nF
-15
+15
8K
C18
100nF
3
2
U4
+
6
60K
LF356
4
5
1KHz
R60
R59
77K
200Hz
11K2
C7
10nF
3
2
U12
+
6
60K
-
-15
R58
C17
100nF
C5
10nF
LF356
20Hz
4
5
R61
10K
FILTER ON-OFF
10
11
12
LF356
2
13
2K3
1
7
8
9
7
1
R63
4
5
R64
7
1
+15
SW3
7
1
33nF
14
C9
-15
R57
10K
10K
Title
Size
A
Date:
FILTROS BESSEL 3º ORDEN A 10KHz, 3KHz, 1KHz, 200Hz, 20Hz
Document Number
Monday, November 20, 2000
Rev
Sheet
1
of
1
8
1
7
2
6
3
5
R4
R1 10 M
4
CIRDIN_8-P
4
8
1
U1
2
3
6
7
5
2
OPA111/TO
+
1
-
J2
BNC
Title
Size
A
Date:
CONVERTIDOR CORRIENTE-VOLTAJE
Document Number
Saturday, November 18, 2000
Rev
Sheet
1
of
1
4.3 ANÁLISIS DEL RUIDO
Dada las pequeñas magnitudes de las señales que se miden en amperometría, el
análisis del ruido que introduce el amplificador es muy importante. En la etapa de diseño,
se ha tenido muy en cuenta, para minimizar, en todo lo posible, el ruido introducido por
los componentes. Éstos ruidos son de diversa naturaleza y pueden producir alteraciones en
las medidas experimentales. Tras la fabricación del sistema se han realizado diversas
medidas para medir el nivel de ruido intrínseco del amplificador.
4.3.1 RUIDO EN LAS MEDIDAS ELECTROFISIOLÓGICAS
En el sentido más general, se define ruido como cualquier perturbación que interfiere
con la señal medida deseada. En las medidas electrofisiológicas estas ruidos pueden proceder
de los propios preparativos, los electrodos que se utilizan para la medida de la señal, el
instrumental electrónico (p.e., el amperómetro), interferencias de fuentes externas (p.e.,
acoplamientos electrostáticos y electromagnéticos procedentes de las líneas de alimentación
50Hz, luces fluorescentes, ruido asociado a vibraciones mecánicas, etc.), y si la medida es
digitalizada, de la naturaleza del propio proceso de digitalización (p.e., ruido de cuantización y
aliasing).
Las interferencias procedentes de fuentes externas se pueden cancelar conectando
todos los componentes del sistema experimental a un punto de tierra común. También es
importante tener apantallados todos los cables de conexión por donde se transmite la señal.
Si nos centramos en los mecanismos de ruido procedentes de las propiedades físicas y
eléctricas de los materiales usados en los experimentos tenemos que básicamente los
principales tipos de ruido son: ruido térmico, ruido de disparo y ruido dieléctrico. Especial
importancia tiene también el ruido procedente de los amplificadores operacionales, dado el
gran número de operacionales que hay en el amplificador.
Todos estos tipos fundamentales de ruido son completamente aleatorios por
naturaleza. La medida más conveniente de la amplitud de ruido es el rms (root-mean-square).
Muchas señales de ruido pueden caracterizarse mediante una distribución gaussiana. El área
bajo la curva de distribución gaussiana representa la probabilidad de que se produzca un
evento ruidoso de una amplitud particular, siendo el área total la unidad. La probabilidad de
que una señal de ruido sobrepase una vez su valor rms es de 0.32.
También es importante conocer la banda de frecuencias sobre la cual se observa la
señal de ruido. Algunas señales ruidosas son por naturaleza restringidas en banda, pero la
gran mayoría de las señales ruidosas requieren el uso de filtros para restringirlas en banda.
Las diferentes fuentes de ruido debido a su carácter aleatorio pueden considerarse
como no correlacionadas, con lo cual el valor rms de ruido total vendrá dado por la
Ecuación 4-7:
ET = E12 + E22 + E32 + ...
Ecuación 4-7
A continuación se describe brevemente los tipos de ruido más importantes:
1. Ruido térmico
El ruido térmico es resultado del movimiento aleatorio de los portadores de carga
excitados térmicamente en un conductor. Se le suele denominar también ruido Johnson o
ruido Nyquist. Para una resistencia el ruido térmico se puede modelar como una fuente de
voltaje en serie o como una fuente de intensidad en paralelo tal como se representa en la
Figura 4-13.
R no ruidosa
Eth
R no ruidosa
Ith
Figura 4-13: Circuito equivalente de ruido de una resistencia
La densidad espectral de potencia (PSD) del ruido térmico no varía con la frecuencia,
es decir es blanco. Su valor S2thV o el equivalente para la intensidad S2thI viene dado por:
2
S thV
= 4kTR con unidades (V ² / Hz )
2
=
S thI
4 KT
con unidades ( A² / Hz )
R
Ecuación 4-8
donde K es la constante de Boltzmann (1.38x10-23 J/ºK), T es la temperatura en grados
Kelvin y R es la resistencia en ohmios. La varianza (potencia de ruido) dentro de un ancho
de banda B(Hz) viene dada por:
2
ETH
= 4 KTBR con unidades (V²)
2
=
I TH
4 KTB
con unidades (A²)
R
Ecuación 4-9
y el ruido rms dentro de una banda de frecuencia B vendrá dado por:
Eth = 4 KTRB con unidades (V rms)
I TH = 4 KTB
R
con unidades (A rms)
Ecuación 4-10
En la Tabla 4-4 se representan para diferentes valores de resistencias y diferentes
anchos de banda los valores más relevantes:
1kHz
10kHz
1kHz
10kHz
voltaje
intensidad
ruido V
ruido V
ruido I
ruido I
densidad
densidad
(uV rms)
(uV rms)
(pA rms)
(pA rms)
(nV/Hz1/2)
(nV/Hz1/2)
100 Ω
0.040
0.126
400
1260
1.26
12.6
1K Ω
0.126
0.40
126
400
4.0
4.0
10K Ω
0.4
1.26
40
126
12.6
1.26
100K Ω
1.26
4.0
12.6
40
40
0.4
1M Ω
4.0
12.6
4.0
12.6
126
0.126
10M Ω
12.6
40
1.26
4.0
400
0.040
100M Ω
40
126
0.40
1.26
1260
0.0126
1G Ω
126
400
0.126
0.40
4000
0.004
Valor
Tabla 4-4: Valores típicos de ruido térmico para diferentes valores de resistencias y diferentes
anchos de banda
2. Ruido de disparo
El ruido de disparo aparece cuando la corriente atraviesa una barrera de potencial, por
ejemplo en las uniones p-n presentes en los dispositivos semiconductores. El valor rms del
ruido de disparo en una banda B viene dada por la ecuación 4-11:
I sh = 2qIB con unidades (A rms)
Ecuación 4-11
donde q es la carga del electrón (1.6x10-19 culombios) e I es la corriente en DC medida
en amperios.
Un ejemplo importante de ruido de disparo es el producido en los amplificadores
operacionales por la corriente de entrada en sus terminales (Input Bias Current). En la Tabla
4-5 aparece el valor rms del ruido de disparo para diferentes valores de corriente en los
amplificadores operacionales.
Op Amp Bias Current
1 KHz ruido de disparo
10 Khz ruido de disparo
(pA rms)
(pA rms)
1 µA
18
57
100 nA
5.7
18
10 nA
1.8
5.7
1 nA
0.57
1.8
100 pA
0.18
0.57
10 pA
0.057
0.18
1 pA
0.018
0.057
0.1 pA
0.0057
0.018
Tabla 4-5: Valores típicos de ruido de disparo para diferentes corrientes de entrada en
amplificadores operacionales
3. Ruido dieléctrico
En una capacidad ideal sin pérdidas no se produce ruido térmico, sin embargo en los
materiales dieléctricos reales aparecen pérdidas debida a ruido térmico. Para dieléctricos con
relativamente bajas pérdidas, la densidad espectral de este ruido se puede describir en
términos del factor de disipación D y la capacidad CD del dieléctrico:
S D2 = 4kTDC D (2πf ) con unidades (A²/Hz)
I D = 4kTDC DπB ² con unidades (A rms)
Ecuación 4-12
El ruido dieléctrico en condensadores de calidad alta (D<0.0001) es prácticamente
despreciable, del orden de 0.032 pA rms. La fuente de ruido dieléctrico más importante
procede del adaptador o “holder” del microelectrodo y se detallará más adelante.
4. Ruido en los amplificadores operacionales
El ruido intrínseco en un amplificador operacional puede ser modelado por una fuente
de voltaje equivalente En a la entrada del amplificador en serie con el terminal – de entrada, y
una fuente de corriente equivalente entre los terminales - y + de entrada (véase Figura 4-14).
En
In
+
Figura 4-14: Modelo de ruido de un amplificador operacional
De todos los amplificadores operacionales que tiene el circuito, aquél donde se
presenta con mayor intensidad el ruido, es el que realiza la conversión corriente voltaje en el
“headstage”. El modelo de esta configuración se presenta en la Figura 4-15.
ef
Rf
En
In
Cg
+
Figura 4-15: Modelo de ruido simplificado del conversor corriente-voltaje
En este modelo ef representa el ruido térmico de la resistencia de realimentación Rf, y
Cg es una capacidad de incluye la capacidad de entrada del amplificador y la capacidad
asociada al microelectrodo. La densidad espectral de potencia de ruido a la salida del
amplificador viene dada por:
2
S OUT
( f ) = in2 R 2f + e 2f + en2 (1 + 4π 2 f 2 R 2f C g2 ) en unidades V²/Hz
Ecuación 4-13
Es importante representar esta densidad de potencia en términos de corriente para
comparar el ruido con la señal de corriente que se mide en el amplificador. El ruido a la
entrada se puede obtener dividiendo la Ecuación 4-13 por Rf²:
S (f)=i +
2
in
2
n
e 2f
R
2
f
+ en2 (
1
+ 4π 2 f 2C g2 ) en unidades A²/Hz
R 2f
Ecuación 4-14
Por lo general in (ruido de disparo) en y ef (ruido térmico) dependen de la frecuencia,
pero asumiendo que son independientes de la frecuencia podemos integrara la Ecuación 415 sobre una banda de frecuencia B y obtener el ruido rms:
I in = in2 B +
e 2f
R
2
f
B + en2
B 4 2 2 3
+ π Cg B
R 2f 3
Ecuación 4-15
4.3.2 FUENTES DE RUIDO EN EL AMPLIFICADOR DE
AMPEROMETRÍA
Los componentes del amplificador de amperometría introducen ruido que pueden
llegar a afectar a las medidas, dado la pequeña magnitud de éstas. Los ruidos más
importantes proceden, sin duda, de los primeros elementos del sistema de medida, es decir,
el microelectrodo, el adaptador o “holder” y el convertidor corriente-voltaje.
Microelectrodo
El microelectrodo de fibra de carbón se puede modelar como una resistencia en
serie con una capacidad. Para minimizar el ruido debido al electrodo es necesario minimizar
la resistencia eléctrica del mismo ( 20-100 Ω ). El ruido introducido dependerá pues de la
calidad del electrodo que se esté utilizando, por ejemplo, para el electrodo comercial ProCfe (Dagan Corporation, EE.UU.) el ruido máximo introducido es de 0.11 pA rms medido en
un ancho de banda de 5KHz.
Adaptador o “holder”
El adaptador contribuye al ruido incrementando la capacidad de entrada del
convertidor corriente-voltaje. El ruido introducido por el adaptador es del orden del 10%
del ruido en circuito abierto del convertidor corriente-voltaje. Por ejemplo, el adaptador
comercial Axopatch 200A (Axon Instruments, EE.UU) introduce un ruido máximo de
0.075 pA rms medido en un ancho de banda de 5KHz.
Convertidor corriente-voltaje
El ruido introducido por esta etapa, procede fundamentalmente de la resistencia de
realimentación de alto valor óhmico . Tal como puede consultarse en la Tabla 4-5, el valor
introducido por esta resistencia oscila en torno a 0.1-0.3 pA rms.
4.4 VALIDACIÓN DEL AMPLIFICADOR DE AMPEROMETRÍA
Para validar el correcto funcionamiento del amplificador de amperometría se han
realizado una serie de experimentos que se describen a continuación. Estos experimentos
son útiles tanto para medir el nivel de ruido que introduce el amplificador en las medidas,
como para calibrar todos los potenciómetros de ajuste que tiene el sistema.
El experimento consistió en conectar al convertidor corriente-voltaje una resistencia
de valor conocido ( véase Figura 4-16). Imponiendo una diferencia de potencial en los
bornes de esta resistencia, se puede calcular la corriente que circulará por ella. Esta
corriente es la misma que circulará por la resistencia de realimentación, con lo cual
podemos obtener el valor del voltaje esperado a la salida del convertidor ( véase Ecuación
4-16).
Convertidor
corriente-voltaje
Rf
-Vcc
4
8
1
i
Rp
Vhead
7
5
Vest
OPA111/TO
6
+
3
-
2
+Vcc
Figura 4-16: Esquemático del sistema de validación para el amplificador de amperometría
Vhead = i ( R f + R p ) )
i=
VEST
Rp
Ecuación 4-16
Tras la etapa de conversión se encuentra la etapa de restador de estimulación,
corrección de offset (no se ha utilizado en estos experimentos), ganancia y filtrado.
Aplicando las funciones de transferencia de primer orden de todas estas etapas, concluimos
que el voltaje obtenido a la salida del amplificador viene dado por la Ecuación 4-17.
Vout = i ⋅ R f ⋅ G
Ecuación 4-17
Siendo G el factor de ganancia aplicado (los filtros no introducen ganancia, dado que
se han diseñado con ganancia =1).
La magnitud de resistencia con que se realiza esta prueba ha de ser del orden de la
resistencia de realimentación del convertidor corriente-voltaje, para que el voltaje que se
obtenga a la salida del restador sea lo suficientemente alto y se pueda amplificar con el
amplificador. Esto supone tener que usar una resistencia de alto valor óhmico ( G Ω ) para
poder experimentar con la resistencia de mayor magnitud. La resistencia de alto valor
óhmico de prueba se convertiría de esta manera en un elemento ruidoso que se sumaría al
ruido introducido por el propio amplificador. Por ello, el nivel de ruido medido con esta
configuración, no se correspondería con el ruido que se pretende medir.
A continuación se presentan las tablas de ruido medidas con la resistencia de
realimentación de menor valor, para dos resistencias de prueba diferentes y filtrando la
señal de salida o no.
RESISTENCIA DE REALIMENTACIÓN 10 Mohm
RESISTENCIA DE PRUEBA 1.720 Mohm
VOLTAJE DE ESTIMULACIÓN 800 mV
SIN FILTRADO
Ganancia
Valor
(mV/pA)
esperado(V) mínimo(V) máximo(V) pico(V)
(pA)
0.5/100
2.326
2.249
2.258
0.009
1.8
1/100
4.651
4.506
4.519
0.013
1.3
2/100
9.302
8.723
8.751
0.028
1.4
5/100
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
rango
rango
rango
rango
rango
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
rango
rango
rango
rango
rango
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
rango
rango
rango
rango
rango
10/100
20/100
Voltaje
Voltaje
Voltaje pico- Ruido
RESISTENCIA DE REALIMENTACIÓN 10 Mohm
RESISTENCIA DE PRUEBA 1.720 Mohm
VOLTAJE DE ESTIMULACIÓN 800 mV
CON FILTRADO 20Hz
Ganancia
Valor
(mV/pA)
esperado(V) mínimo(V) máximo(V) pico(V)
(pA)
0.5/100
2.326
2.132
2.144
0.008
1.6
1/100
4.651
4.241
4.262
0.021
2.1
2/100
9.302
8.214
8.244
0.040
2
5/100
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
rango
rango
rango
rango
rango
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
rango
rango
rango
rango
rango
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
rango
rango
rango
rango
rango
10/100
20/100
Voltaje
Voltaje
Voltaje pico- Ruido
RESISTENCIA DE REALIMENTACIÓN 10 Mohm
RESISTENCIA DE PRUEBA 10.025 Mohm
VOLTAJE DE ESTIMULACIÓN 800 Mv
SIN FILTRADO
Ganancia
Valor
Voltaje
Voltaje
Voltaje pico- Ruido
(mV/pA)
esperado(V) mínimo(V) máximo(V) pico(V)
(pA)
0.5/100
0.339
0.383
0.393
0.010
2
1/100
0.798
0.771
0.781
0.010
1
2/100
1.596
1.491
1.513
0.021
1.15
5/100
3.99
3.799
3.838
0.039
0.78
10/100
7.98
7.779
7.850
0.071
0.71
20/100
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
rango
rango
rango
rango
rango
RESISTENCIA DE REALIMENTACIÓN 10 Mohm
RESISTENCIA DE PRUEBA 10.025 Mohm
VOLTAJE DE ESTIMULACIÓN 800 Mv
CON FILTRO 20 Hz
Ganancia
Valor
Voltaje
Voltaje
Voltaje pico- Ruido
(mV/pA)
esperado(V) mínimo(V) máximo(V) pico(V)
(pA)
0.5/100
0.339
0.363
0.373
0.010
2
1/100
0.798
0.721
0.733
0.012
1.2
2/100
1.596
1.400
1.414
0.014
0.7
5/100
3.99
3.589
3.609
0.020
0.4
10/100
7.98
7.343
7.383
0.040
0.4
20/100
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
Fuera de
rango
rango
rango
rango
rango
5 DISEÑO Y CONSTRUCCIÓN DE UN SISTEMA DE
ADQUISICIÓN DE SEÑALES AMPEROMÉTRICAS
5.1 CARACTERÍSTICAS DEL SISTEMA
Las señales que se registran durante la experimentación deben ser cuidadosamente
adquiridas y almacenadas. El sistema de adquisición de señales diseñado permite la captura
simultánea por tres canales diferentes de:
la salida del amplificador
la señal de estimulación
la ganancia del amperómetro
En conjunto, la información adquirida es absolutamente relevante para el análisis
posterior del experimento.
Dada la naturaleza analógica de la señal que se pretende adquirir, existen diversos
parámetros referentes a la adquisición que el experimentador ha de controlar: la tasa de
muestreo de las señales y el tiempo que dura la adquisición. Por otro lado es fundamental
monitorizar en tiempo real las señales que se están adquiriendo.
Además es relevante el formato en que se va a guardar la información. El formato
debe ser compatible con los programas que se usan para el análisis posterior de la
información. El usuario debe tener la opción de dar nombre al archivo donde se almacenan
los datos. Dado que vamos a adquirir tres canales de información se ha optado, para
facilitar la migración de los datos, usar un solo archivo para guardar los tres canales, de
manera que cada canal ocuparía una columna en el archivo final donde cada punto estaría
sincronizado con los puntos de los otros dos canales.
5.2 IMPLEMENTACIÓN HARDWARE DEL SISTEMA DE
ADQUISICIÓN
El sistema se basa en la tarjeta de adquisición DT302 de Data Translation. Se trata de
una tarjeta de adquisición de bajo costo y multifunción que se conecta al bus PCI. Las
características técnicas de esta tarjeta pueden consultarse en el Anexo II de este Proyecto
Fin de Carrera. A continuación se describen las características fundamentales de este
modelo:
ENTRADAS ANALÓGICAS
CANALES
RESOLUCIÓN
RANGOS DE ENTRADA
TASA MÁXIMA
DE MUESTREO
16 simples/
± 1.25, 2.5, 5, 10 V
12 bits
8 diferenciales
225 kS/s
0 - 1.25, 2.5, 5, 10 V
SALIDAS ANALÓGICAS
CANALES
RESOLUCIÓN
2
12 bits
RANGOS DE SALIDA
±
5, 10 V
0 - 5, 10 V
ENTRADAS/SALIDAS DIGITALES
LINEAS DE ENTRADA/SALIDA COUNTER/TIMER
23
4
Tabla 5-1 :Características de la tarjeta de adquisición DT302
Conjuntamente con la tarjeta de adquisición, se adquirió un panel de conexiones
STP68 “Screw Terminal Panel” (véase Figura 5-1), y un cable apantallado de 68 pines y
2metros de longitud EP305. Éste cable conecta el “Screw Terminal Panel” con la tarjeta de
adquisición.
Figura 5-1: “Screw Terminal Panel” montado en una caja de
instrumentación
El “Screw Terminal Panel” posee conectores roscados para todas las conexiones de la
tarjeta de adquisición. Dado que se pretendía tener un sistema fácil de usar con conectores
estándar, se montó el Screw Terminal Panel en una caja de instrumentación. Esta caja se
muestra en la Figura 5-2 y proporciona:
8 de las 16 entradas analógicas que posee la tarjeta con conectores BNC de
75 Ω .
8 de las 23 entradas-salidas digitales que posee la tarjeta con conectores BNC
de 75 Ω . Cada uno de los canales tiene un led que visualiza el estado del canal;
se enciende si el canal está a ‘1’ y se apaga si está a ‘0’.
2 salidas analógicas con conectores BNC de 75 Ω .
1 salida con conexión a tierra mediante un conector banana.
Estas conexiones son más que suficientes para el sistema de adquisición, que tan sólo
utiliza tres entradas analógicas. El resto de conexiones que se han implementado en la caja
de instrumentación del “Screw Terminal Panel” podrán ser usadas para posteriores
ampliaciones en el sistema experimental de electrofisiología.
Figura 5-2: Caja de instrumentación del “Screw Terminal Panel”
5.3 IMPLEMENTACIÓN SOFTWARE DEL SISTEMA DE
ADQUISICIÓN
Para programar la adquisición se ha usado el programa HPVEE de Hewlet Packard
version 5.0. Este programa es el que recomienda Data Translation para usar conjuntamente
con sus tarjetas. Se necesitó además instalar los drivers de la tarjeta y el programa DT-VPI
que proporciona las herramientas necesarias y específicas para la adquisición.
5.3.1 DESCRIPCIÓN DEL HPVEE
El HPVEE es un lenguaje de programación gráfico orientado a objetos. El tiempo
de aprendizaje es relativamente corto debido a las facilidades que ofrecen los lenguajes de
programación gráficos. El uso de objetos complejos hace, por un lado, que el tiempo de
programación disminuya, dado que algunas funciones complejas ya están implementadas en
el propio lenguaje. Por otro lado los objetos complejos no permiten la especialización de
los programas; por ello, hacer tratamientos muy específicos podría resultar tremendamente
complicado.
Para la elección del programa de adquisición se tuvo en cuenta, además de las
recomendaciones de los fabricantes de la tarjeta de adquisición, las facilidades y
dificultades que ofrecen otros lenguajes de programación. Como opciones al HPVEE se
contemplaron los programas LabVIEW y el Visual C++.
A pesar de que HPVEE y LabVIEW son ambos lenguajes de programación gráfica,
la ejecución de aplicaciones en estos dos entornos se realiza de manera completamente
diferente. LabVIEW es la implementación gráfica de un lenguaje de programación textual
estándar. Conceptualmente, LabVIEW substituye simplemente cada comando de un
lenguaje textual por un icono. Aunque esta estrategia es visualmente más orientativa que un
lenguaje de programación textual estándar, comparte muchas de sus desventajas. En
particular estos lenguajes de programación de bajo nivel son difíciles de aprender,
requiriendo al programador recordar, no solamente un enorme número de comandos, sino
además cómo deben ser unidos sin generar errores. Los lenguajes de programación de bajo
nivel llevan consigo un tiempo de programación alto, requiriendo una gran cantidad de
líneas de código o iconos para formar una función relativamente simple.
El HPVEE utiliza una estrategia diferente. Las aplicaciones se basan en una serie de
bloques comunes u objetos de alto nivel que se utilizan en múltiples ocasiones a lo largo del
programa principal, suponiendo un ahorro importante en la generación de código. De este
modo lo implementado con 20 o 30 líneas de código en C++, equivalente a 20 o 30 iconos
de LabVIEW, se puede implementar con solamente 3 o 4 objetos en HPVEE.
Aunque las señales experimentales que se quieren adquirir son señales
tremendamente específicas, la aplicación en sí de la adquisición de los datos experimentales
es totalmente general. Por ello un lenguaje de programación gráfico de alto nivel es el
entorno más apropiado, y el HPVEE cumple todos estos requisitos.
5.3.2 PROGRAMACIÓN EN HPVEE
La programación en HPVEE se basa en la conexión de una serie de objetos
predefinidos. Los objetos constan de entrada/salida de flujo de datos y de entrada/salida
de flujo de control (véase Figura 5-3).
Entrada de control
TÍTULO DEL OBJETO
Salida de datos
Entrada de datos
Salida de control
Figura 5-3: Objetos de HPVEE
El flujo de datos está relacionado con la función del objeto, mientras que el flujo de
control está relacionado con el orden en que se ejecutan los diversos objetos. Si no se
programa flujo de control, es el flujo de datos el que determina el orden de ejecución de los
objetos.
5.3.2.1 DIAGRAMA DE FLUJO
En el siguiente esquema se muestra el diagrama de flujo sobre el que se baja el
programa diseñado:
INICIO
Configuración de los canales de entrada
Tasa de muestreo
Tiempo del experimento
Archivo donde se guardan los datos
INICIO ADQUISICIÓN
Adquisición de datos de los
tres canales
Monitorización de los tres
canales
NO
¿tiempo
consumido?
SI
FIN ADQUISICIÓN
Almacenamiento en archivo seleccionado
FIN
A continuación se describe detalladamente los objetos utilizados en la programación
para cada una de las fases que aparecen en el diagrama de flujo.
CONFIGURACIÓN DE LOS CANALES DE ENTRADA
Esta etapa está implementada mediante el objeto ‘A/D Config’. El cuadro de diálogo
de este objeto (véase Figura 5-4) se utiliza para construir una lista de canales en la cual se
especificarán:
los canales sobre los que se va a realizar la adquisición (CH0, CH1 y CH2).
la tasa de muestreo de cada uno de los canales (no será configurada en este
objeto).
una ganancia proporcionada mediante programación y que por conveniencia
pondremos a 1.
el rango de voltaje de entrada (-10,10V) y el tipo de canal (Single-Ended), tal
como aparece en la Figura 5-4.
Para nuestro propósito no es necesaria la configuración de los demás parámetros.
Figura 5-4: Cuadro de diálogo ‘A/D Config’
TASA DE MUESTREO
Para la configuración de la tasa de muestreo, si bien podríamos haber utilizado el
objeto anterior, es más cómodo para el usuario hacerlo de manera independiente. Para ello
tenemos un objeto ‘Constant Real’ donde el usuario introduce la tasa de muestreo de los
canales que desee. Por conveniencia se ha elegido una misma tasa de muestreo para los tres
canales, aunque podrían programarse sin dificultad tasas de muestreo diferentes. Así, por
ejemplo, se podría disminuir la tasa de muestreo de una señal poco cambiante, como la
ganancia, durante el transcurso del experimento.
Dos objetos más se utilizan para configurar la tasa de muestreo ‘Get Config’ y ‘Set
Config’. El primero de ellos se usa para obtener los datos del sistema (la lista de canales,
ganancias, tasas de muestreo, etc.) y el segundo para imponer valores de estos parámetros
en el sistema. Por ello, el objeto ‘Constant Real’ lo imponemos como parámetro en el ‘Set
Config’ (véase Figura 5-5).
Figura 5-5: Imposición del Sampling rate
TIEMPO DEL EXPERIMENTO
Para ajustar el tiempo de adquisición usaremos otro objeto ‘Constant Real’ sobre el
cual el usuario introduce el tiempo de adquisición deseado. La conexión de este objeto
dentro del programa se explicará mas adelante.
ARCHIVO DE ALMACENAMIENTO DE LOS DATOS
Para seleccionar el archivo donde queremos guardar los datos usamos un objeto ‘To
File’ (véase Figura 5-6). En este objeto configuramos el formato con que se quiere guardar
los datos así como el archivo donde se quiere guardar los datos. El formato de datos se
elige de manera que sea un archivo transportable a otros sistemas para el posterior análisis
de los datos del experimento.
El archivo donde se quiere almacenar los datos no es necesario que exista
previamente. En caso de existir, se eliminará el archivo anterior para guardar los datos
nuevos.
Figura 5-6: Objeto ‘To File’
INICIO DE ADQUISICIÓN
Una vez configurados todos los parámetros anteriores el usuario no tiene más que
pulsar el botón ‘start’ y comenzará la adquisición de los datos.
ADQUISICIÓN DE DATOS DE LOS TRES CANALES
Para la adquisición propiamente de los canales se utilizará el objeto ‘Get Data
Function’ (véase Figura 5-7). Hemos de especificar como parámetros:
el canal de donde tomar los datos
el número de datos que se desea tomar
la configuración de la adquisición.
Tenemos pues tres objetos ‘Get Data Function’, uno por cada canal. Para saber el
número de datos a tomar, no tendríamos más que multiplicar la tasa de muestreo por el
tiempo de experimento.
Figura 5-7: Objeto ‘Get Data Function’
MONITORIZACIÓN DE LOS TRES CANALES
La programación en HPVEE hace imposible controlar simultáneamente la tasa de
muestreo y monitorizar en tiempo real los datos que se van adquiriendo. Para controlar la
tasa de muestreo es necesario usar un objeto ‘Get Data Function’ y este objeto no descarga
los datos que está adquiriendo hasta que no completa el número de muestras que le
especificamos como entrada. Luego, al no conocer los datos que se van adquiriendo, es
imposible monitorizarlos en tiempo real. Podemos monitorizar la señal una vez
completado el tiempo de adquisición de datos. Sin embargo, esto sólo nos resulta útil si
queremos ‘echarle un vistazo’ a las señales que se han adquirido.
Para monitorizar en tiempo real necesitaríamos utilizar otro objeto llamado ‘Get Single
Value’, que tal como su propio nombre indica toma un solo valor de un canal determinado.
Esto implica que la tasa de muestreo tendría que venir controlada externamente activando
el objeto ‘Get Single Value’ cada vez que se cumpliera la tasa de muestreo. Para tasas de
muestreo altas, del orden de Hz, no hay ningún problema porque existen objetos
adecuados para la activación de objetos, hasta un máximo de 50 ms. Pero para tasas de
muestreo altas, que son las que nosotros necesitaremos, estos objetos no funcionan, ya que
a partir de 50 ms no se asegura la correcta activación.
La solución que se ha tomado es utilizar un objeto ‘XY Trace’ (véase Figura 5-8) para
monitorizar los datos y conseguir que el contenido de este objeto se refresque cada
segundo. Esto implica que cada segundo se deben activar los objetos ‘Get Data Panel’
mediante un objeto ‘For Count’ (véase Figura 5-9), y que el número de muestras las tenemos
que calcular para un segundo, y no para el tiempo completo de adquisición. También
tenemos que calcular el número de veces que deben activarse los objetos ‘Get Data Panel’.
Todos estos cálculos se realizan con objetos ‘Formula’.
Figura 5-8: Objeto ‘X-Y Trace’
Figura 5-9: Objeto ‘For Count’ actuando sobre objetos ‘Get Data Function’
FIN ADQUISICIÓN
La adquisición concluye cuando se han activado los objetos ‘Get Data Panel’ tantas
veces como impone el tiempo de experimento. Una vez finalizada la adquisición se dispone
a preparar los datos para guardarlos en el archivo especificado. Si el usuario durante el
transcurso del experimento decide abortar la adquisición, no tiene más que parar la
ejecución del programa. En este caso no se generará ningún archivo de datos.
ALMACENAMIENTO EN ARCHIVO SELECCIONADO
Por simplicidad para el usuario se ha creído conveniente almacenar todos los datos
en un mismo fichero. Para ello se ha configurado el sistema de forma que se guarden los
datos de cada canal por columnas. El objeto usado es el ya mencionado ‘To File’. En este
objeto, una vez seleccionado el archivo y el formato de los datos, sólo hay que esperar a
que lleguen los datos en una matriz y para que sean almacenados en el archivo
correspondiente. Existen dos inconvenientes para conseguir esto:
Por un lado tenemos tres fuentes de datos diferentes que deben ser organizados por
columnas en una matriz para que el almacenamiento se haga tal y como lo tenemos
previsto.
Por otro lado los datos de cada uno de los canales vienen en forma de ráfagas debido
al refresco cada segundo, y tenemos que alinearlos en un solo vector para formar
correctamente la matriz de la que hemos hablado anteriormente.
Para solucionar ambos problemas se han utilizado una serie de objetos como
‘Collector’, ‘Build Record’, ‘Unbuild Record’ y ‘Unbuild waveform’ (véase Figura 5-10). La función
de cada uno de estos objetos es formar las construcciones de vectores y matrices
anteriormente explicadas, muy sencillas de comprender pero difícil de implementar.
Figura 5-10: Implementación de la formación de la matriz de datos
5.3.2.2 PROGRAMA DE ADQUISICIÓN
El programa diseñado se llama Acquisition.vee y consta de dos paneles.
En el primero de ellos se detalla el flujo de datos y de control y se visualizan las
conexiones entre los diversos objetos (véase Figura 5-11). Es por lo tanto un panel de uso
exclusivo del programador. En este panel se encuentran las conexiones de todos los
objetos anteriormente explicados.
Figura 5-11: Acquisition.vee panel de programador
El segundo de ellos es un panel de usuario (véase Figura 5-12), en el que aparecen los
objetos que han de ser configurados por el usuario y los objetos que sirven para visualizar
el estado del experimento. En este panel además de los objetos que hay que configurar y el
display para monitorizar los canales, hemos añadido dos datos que son de interés para el
usuario: el tiempo de muestreo y el número de puntos por canal que se adquiere. Además
hemos insertado un panel donde de detallan los pasos a seguir para una correcta
adquisición.
Figura 5-12: Acquisition.vee panel de usuario
Una vez finalizada la adquisición podemos visualizar los datos en multitud de
programas, como Excel o Igor Pro. Para una correcta visualización es necesario conocer el
tiempo de muestreo de la señal. Por ese motivo en el panel de usuario se ha introducido un
‘Alphanumeric Display’ en el que aparece este dato concreto.
Usando el programa Igor Pro se recuperan los datos y se almacenan en un formato
propio de este programa, lo que permite una gran versatilidad para análisis y
representaciones gráficas. En la Figura 5-13 se puede ver la representación final de los
datos.
2
1
V oltage
0
-1
-2
0
1000
2000
3000
ms
4000
5000
6000
Figura 5-13: Visualización de los datos con Igor Pro
Los datos que aparecen en la Figura 5-13 corresponden a la adquisición durante 6
segundo a una tasa de muestreo de 10 KHz de los canales CH0, CH1 y CH2. En estos
canales se introdujeron por orden: una señal constante de –1100 mV, una señal constante
de 0V, y una señal cuadrada de amplitud 4.5V y offset –500 mV procedente del módulo de
estimulación diseñado y construido como parte del Proyecto Fin de Carrera.
6 DISEÑO Y CONSTRUCCIÓN DE UN MÓDULO DE
ESTIMULACIÓN
El diseño y construcción del módulo de estimulación se ha realizado conjuntamente
con Jose Castañeda, estudiante de 5º de Telecomunicación y actualmente realizando el
proyecto fin de carrera bajo la tutela de Dr. Risco en el laboratorio de Fisiología Médica y
Biofísica de la Facultad de Medicina. La razón por la que hemos trabajado conjuntamente
responde a una misma necesidad en la estimulación. Tanto en su proyecto fin de carrera
como en el presente, la unidad de estimulación es un componente básico para la realización
de experimentos.
En un principio, la idea era poder generar diferentes formas de ondas a través de la
tarjeta de adquisición DT302, dado que esta posee dos salidas analógicas. Sin embargo tras
múltiples intentos infructuosos y tras consultar directamente con el equipo técnico de Data
Translation en Alemania, se concluyó que no es posible usar estas dos salidas para generar
formas de ondas.
Las salidas analógicas sólo están preparadas para generar datos en DC. Esto quiere
decir que no poseen buffers ni registro de salidas, de manera que sólo es posible usar el
objeto ‘Put Single Value’ de HPVEE para controlar estas dos salidas. Este objeto es similar
al ‘Get Single Value’ ya explicado anteriormente. Con el objeto ‘Put Single Value’ no se puede
controlar la descarga de datos a través de las salidas analógicas a una tasa de muestreo baja
(<50 ms). En particular, para los experimentos de estimulación de neuronas se necesita
generar pulsos de 2 ms de ancho, y este tipo de ondas no es posible generarlas con
fiabilidad usando las herramientas que proporciona el HPVEE.
Para solucionar este problema se decidió construir un módulo de estimulación
autónomo utilizable en diferentes montajes experimentales y controlable en algunas de sus
propiedades a través de tensiones TTL o tensiones constantes, pudiendo suministrarse
éstas tensiones a través de la tarjeta de adquisición DT302.
El primer paso para el diseño del generador consistió en investigar las diferentes
posibilidades que existen para la implementación y determinar cuál de ellas se adapta mejor
a las necesidades. Las tres posibilidades estudiadas fueron las siguientes:
El circuito integrado ICL8038 de Harris Semiconductor
El circuito integrado MAX038 de Maxim
El uso de componentes discretos
Los circuitos integrados fueron evaluados usando los siguientes criterios por orden de
importancia: ancho de banda, coste, número de componentes y simplicidad de uso. En la
Tabla 6-1 se puede ver un estudio comparativo de las tres posibilidades estudiadas.
Nombre
Ancho de
Coste estimado
Banda
ICL8038
Hasta 100 KHz
Número de
Simplicidad de
componentes
uso
20
7
10 €
potenciómetros
necesitan ajuste
MAX038
Hasta 20MHz
20€
45
5
potenciómetros
necesitan ajuste
Componentes
Hasta 100 KHz
25 €
discretos
70
Se necesitan
ajustar tanto
capacidades
como
potenciómetros
Tabla 6-1: Tabla comparativa entre las diferentes opciones para la implementación del generador
de ondas
El diseño con componentes discretos fue rechazado, por su elevado coste y la
dificultad de diseño. Finalmente de decidió utilizar el ICL8038 por la capacidad de obtener
formas de ondas a frecuencias muy bajas (< 100 Hz), frente al MAX038, que tiene un
mayor ancho de banda, pero peor respuesta a baja frecuencia.
6.1 DESCRIPCIÓN DEL GENERADOR DE ONDAS
El generador de ondas diseñado (véase Figura 6-1) está basado en el circuito
integrado ICL8038 de Harris Semiconductor (EE.UU.). Las características técnicas de este
integrado pueden consultarse en el Anexo I, de este documento.
Figura 6-1: Módulo de estimulación
El generador de ondas presenta unas características de funcionamiento un tanto
particulares además de las generales que presenta cualquier generador de onda comercial.
Éstas particularidades permiten controlar parte del funcionamiento del generador desde el
PC usando la tarjeta de adquisición DT302.
El ICL8038 es un circuito integrado que genera cinco tipos diferentes de formas de
ondas: cuadradas a través del pin9 (“square wave out”) (véase Figura 6-3), pulsos a través del
pin 9 (“square wave out”) (véase Figura 6-4), sinusoidales a través del pin 2(“sine wave out”)
(véase Figura 6-5), triangulares a través del pin 3(“triangle wave out”) (véase Figura 6-6), y
rampas a través del pin 3 (“triangle wave out”) (véase Figura 6-7), con baja distorisión (<1%)
y alta linealidad (0.1%). En la Figura 6-2 se muestra la descripción de los pines del
ICL8038.
Figura 6-2: Descripción de los pines del ICL8038
Figura 6-3: Forma de onda cuadrada
generada por el módulo de estimulación
Figura 6-5: Forma de onda senoidal
generada por el módulo de estimulación
Figura 6-4: Forma de onda pulso
generada por el módulo de estimulación
Figura 6-6: Forma de onda triangular
generada por le módulo de estimulación
Figura 6-7: Forma de onda rampa
generada por el módulo de estimulación
Los pulsos y las rampas poseen “duty cicle” variable a través de los pines 4-5(“duty
cycle frecuency adjust”) (véase Figura 6-2) . El rango de variación del “duty cicle” comprende
1%-50% del periodo de la señal y se selecciona mediante un potenciómetro en el panel
exterior. Para que las señales generadas tengan el menor nivel de distorsión que
proporciona el ICL8038, se dispone de una serie de potenciómetros de ajuste para las
señales senoidales que actúan sobre los pines 1 y 12 (“sine wave adjust”) del ICL8038.
La amplitud de las señales que genera el ICL8038 es fija para cada tipo de señal.
Para poder variar esta amplitud se ha implementado una etapa de ganancia variable, de esta
manera podemos seleccionar la amplitud de la señal desde el panel exterior a través de un
potenciómetro. Además se ha implementado un atenuador de 20 dB para poder obtener
señales de baja amplitud. Para ello se dispone de un interruptor en el panel exterior.
En algunas aplicaciones es interesante seleccionar el nivel de DC de las formas de
ondas generadas. El diseño implementa también esta posibilidad generando un nivel de DC
y sumándoselo a la señal con la amplitud seleccionado por el usuario (ver figura 6-8).
Mediante un interruptor en el panel exterior, el usuario decide si incluir offset en la señal
generada y el offset se selecciona mediante un potenciómetro en el panel exterior. El rango
de variación del offset es de –1V a 1V.
+12V
C11
0.1UF
R34
OFFSET 10K
2
3
1
C9
2
7
1
3
R28
500R
+
6
-
3
1
OFFSET ON-OFF
2
LF356
0.1UF
4
5
R29
500R
U2
-12V
C10
0.1UF
Figura 6-8 : Esquemático de la generación de offset
También existe la posibilidad de invertir la señal de salida. Ésta opción se
implementó después de la construcción del generador, de ahí que tenga un esquemático y
un layout independiente.
La frecuencia de la señal de salida puede seleccionarse controlando el potencial
aplicado en el pin 8 (“FM sep input”) del ICL8038 (véase Figura 6-2). Se ha diseñado dos
modos de funcionamiento para seleccionar el voltaje aplicado a dicho pin: manualmente o
externamente. Manualmente, el usuario selecciona un rango de frecuencia a través de un
interruptor giratorio en el panel externo que actúa sobre el pin 10( “timming capacitor”) del
ICL8038, y dentro de ese rango de frecuencias selecciona la frecuencia deseada a través de
un potenciómetro situado también en el panel externo. Los rangos de frecuencia que se
abarcan desde el potenciómetro manual aparecen en la Tabla 6-2. En esta tabla las
posiciones 1º-7º corresponden a distintas marcas orientativas situadas en el panel exterior.
Posición
X100
x1K
x10K
x100K
1º
5.57 (Hz)
66.89(Hz)
671.14(Hz)
6250
2º
18.94(Hz)
195.70(Hz)
1980.20(Hz)
X
3º
35.59(Hz)
378.79(Hz)
3703.70(Hz)
X
4º
53.05(Hz)
571.43(Hz)
5555.56(Hz)
X
5º
74.07(Hz)
757.58(Hz)
7692.31(Hz)
X
6º
87.34(Hz)
900.90(Hz)
9523.81(Hz)
X
7º
107.07(Hz)
1123.60(Hz)
11111.11(Hz)
X
Tabla 6-2: Frecuencias de salida de las formas de ondas generadas en el módulo de estimulación
para los diferentes rangos de funcionamiento
Externamente el usuario dispone en el panel exterior de un conector BNC. La
frecuencia de la señal de salida dependerá del voltaje que introduzcamos a través de este
conector y que llega al pin 8 del ICL8038. El rango de voltaje debe ser seleccionado, en
todo caso, manualmente. Esta funcionalidad permite controlar la frecuencia de salida a
través del PC usando la tarjeta de adquisición de datos y uno de los canales analógicos de
salida que posee.
Para determinar la ecuación que relaciona el voltaje en este conector y la frecuencia
de salida de la señal se han realizado una serie de experimentos y se ha concluido en que se
trata de una ecuación lineal. Para determinar los coeficientes de esta ecuación se han
realizado unas rectas de regresión para cada rango. Los resultados de estos experimentos se
presentan en el Anexo III y las ecuaciones lineales resultantes se muestran en la Tabla 6-3:
100Hz
Vpin8 = 11.3150863 - 0.02641687*F
1KHz
Vpin8 = 11.3403647 - 0.00264259*F
10KHz
Vpin8 = 11.3217024 - 0.00026294*F
100KHz
Vpin8 = 11.3974355 - (3.0364e-5) * F
Tabla 6-3: Ecuaciones lineales que permiten calcular el voltaje a aplicar
en el pin8 dada la frecuencia deseada de la onda
El ICL8038 genera la forma de onda siempre que tenga alimentación. Para decidir
nosotros el momento de inicio de la onda hemos implementado un trigger externo con
señal de control TTL (véase Figura 6-9). Este trigger se puede controlar, por ejemplo, con
una de las salidas digitales de la tarjeta de adquisición.
+12V
R9
4K7
J1
2
TRIG
R1
1
2
1K
D2
3
Q1
1
2N3904
1N914
Figura 6-9: Esquemático del trigger externo
Para alimentar todo el circuito se dispone de una fuente de alimentación lineal y
encapsulada de 5W que proporciona +12V,0,-12V. Ésta fuente se suelda directamente al
PCB y se muestra en la figura 6-10.
Figura 6-10: Fuente de alimentación lineal y
encapsulada utilizada para alimentar el
módulo de estimulación
El ICL8038 se alimenta con +12V (pin 6) y con –12V (pin 11). En el panel exterior del
generador se proporciona conexión a éstas tensiones y a la tierra GND a través de conectores
bananas, para poder alimentar otros circuitos de consumo pequeño. La conmutación de la
alimentación se realiza a través de un interruptor en el panel posterior. Éste interruptor posee
un indicador luminoso cuando el circuito está alimentado.
6.2 IMPLEMENTACIÓN DEL SISTEMA DISEÑADO.
ESQUEMÁTICOS Y TRAZADO DE PISTAS.
Para el diseño del generador de ondas se ha usado también el programa ORCAD.
Para los esquemáticos he utilizado el ORCAD Capture y para el layout el ORCAD Layout.
Para el diseño del trazado de las pistas se ha optado por usar una placa de una sola cara
negativa. El proceso de revelado y taladrado lo he realizado en los laboratorios del
Departamento de Electrónica en la Escuela de Ingenieros.
Para la soldadura de los circuito integrados, se ha usado unos zócalos para permitir
una fácil sustitución de este tipo de componentes en caso de fallo. Así mismo para la
conexión de los cables procedentes del panel exterior a la placa he usado unos conectores
roscados.
Los amplificadores operacionales utilizados en todas las etapas son LF356N.
La placa resultante junto con la fuente de alimentación se han montado sobre una
caja de aluminio de dimensiones 304.8 mm x279.4 mm x88.1 mm, tal como puede
apreciarse en la Figura 6-11.
Figura 6-11: Montaje del generador en la caja de instrumentación
6.2.1 DESCRIPCIÓN DEL PANEL FRONTAL
El diseño del panel exterior se ha diseñado para que un usuario moderadamente
experimentado pueda identificar fácilmente las diferentes opciones operativas y de control
del amplificador. En la Figura 6-12 se muestra un esquema del panel de control.
A continuación se explican los diferentes elementos del panel de control:
Control de frecuencia manual-externo: es el interruptor que selecciona el origen del
voltaje que se aplica en el pin 8 del ICL8038 del que depende la frecuencia de la señal de
onda generada.
Frecuencia: es un conector BNC por el que se introduce el voltaje a aplicar en el pin 8 del
ICL8038 cuando estamos funcionando con control de frecuencia externo
Trigger: es un conector BNC por el que se introduce la señal TTL para controlar el inicio
de la generación de la forma de onda.
Rango de frecuencia: es el selector de los distintos rangos de frecuencia. Los rangos
disponibles son:
x10 Hz
x100 Hz
x1KHz
x10KHz
x100 KHz
Ajuste de frecuencia: es el potenciómetro que selecciona la frecuencia cuando se funciona
en modo control de frecuencia manual.
Amplitud: es el potenciómetro que varía la amplitud de la forma de onda generada
Forma de onda: es el selector de la forma de onda que se quiere generar. Hay cinco
formas de ondas disponibles:
seno
cuadrada
triangular
pulso
rampa
Atenuación 0dB -20dB: es el interruptor que selecciona si atenuar la señal de salida 20 dB
o no.
Duty cycle: es el potenciómetro que selecciona el duty cycle que se quiere aplicar a la señal
de salida rampa y pulso. El rango de selección varía entre el 1% y el 50%.
Salida: es un conector BNc por el que se accede a la señal generada.
Offset On-Off: es un interruptor para seleccionar si se quiere sumar un nivel de DC a la
forma de onda generada por el ICL8038.
Control Offset: es un potenciómetro que selecciona el nivel de Dc que se va a sumar a la
onda generada, siempre que el interruptor anterior esté en On.
Inversión On-Off: es el interruptor para seleccionar si se quiere invertir o no la señal de
salida.
+12V, GND, -12 V: son conectores banana jack que permiten el acceso a las señales de
alimentación.
88.1 mm
279.4 mm
Figura 6-12: Panel frontal del módulo de estimulación
6.2.2 ESQUEMÁTICOS Y TRAZADOS DE PISTA
A continuación se muestran los esquemáticos y el layout del diseño implementado.
Se muestran dos esquemáticos junto con sus dos layout de manera independiente, porque
tal como se explicó anteriormente, la etapa inversora se realizó posteriormente al diseño del
generador de funciones. La integración de esta etapa fue posible gracias a que existía
espacio suficiente dentro de la caja de instrumentación del generador de ondas.
El layout resultante para el proceso de isolación de la placa se presenta en papel
transparente, así como la localización de los componentes en el diseño.
J3
FREQ
1
SW6 3
1
FREQ MANUAL-AUTO
2
2
+12V
R2
SIN ADJ 100K
2
C2 0.1UF
R1
1
TRIG
R6
22K
R9
4K7
3K3
2
2
D3
4
5
10
6
11
R8
10K
R21
SWADJ
SWADJ
SWOUT
DCFADJ
DCFADJ
TOUT
SWOUT
FMBIAS
FMSIN
13
4
5
6
R24
4K7
SW4
12
11
10
14
9
8
7
R26 4K7
2
3
R25
3K9
R19 10K
3
R16
10R
R27
AMPLITUDE 10K
2
9
R22 1K2
J5
R23
TC
R30
680R
V+
V-/GND
820R
1
2
3
4
5
ALIMENTACION AC
FUENTE DE ALIMENTACION
J7
C11
0.1UF
1
2
3
3
2
R13 5K
1
R14 5K
1
R15 5K
3
2
1
10
11
12
C4 0.0047UF
R29
500R
C5 0.047UF
2
7
1
U2
6
-
3
OFFSET ON-OFF
2
1
LF356
0.1UF
2
U3
+
1
6
BNC
R33 1K
-
J2
LF356
10K R31
R32
10K
C6 0.47UF
C7 4.7UF
FREQ RANGE
3
4
5
7
8
9
+
+-12V-0V
2
C9
SW2
1
14
6
5
4
OFFSET 10K
2
3
13
3
1
2
3
R11 5K
1
R12
2
3
C3 470PF
1
2
3
R34
4
5
-12V C8
100UF
7
1
3
R28
500R
1
2
J4
ICL8038
+12V
1N914
2
D2
1
12
7
8
1N914
3
Q1
1
2N3904
2
1
R10
3
1K
1K (SYM)
3
2
SIN ADJ 100K
FREQ 5K
3
U1
3
1
2
R17
12M
1
2
3
DUTY CICLE 10K
D1
1N914
1K3
J1
1
1
R7
R20
1
C1
100UF
2K7
3
1
R18
2
WAVEFORM SELECT
10R
R35
1K
SW8
3
1
2
GANANCIA MAX-MIN
-12V
C10
0.1UF
Title
Size
A
Date:
GENERADOR DE FUNCIONES
Document Number
Monday, November 20, 2000
Rev
Sheet
1
of
1
J1
4
3
2
1
R1
1K
CON4
R2
4
5
2K
2
3
LF356
6
SW1
3
J2
2
1
1
2
7
1
3
+
1
-
2
U1
SW MAG-SPDT
Title
Size
A
Date:
CON2
INVERSOR DE GENERADOR DE FUNCIONES
Document Number
Tuesday, September 10, 2002
Rev
Sheet
1
of
1
6.2.3 PROGRAMACIÓN EN HPVEE
Para controlar la frecuencia en modo externo se ha diseñado un programa en
HPVEE. Este programa es completamente independiente del programa de adquisición
diseñado para amperometría, pudiéndose ejecutar conjuntamente si es necesario.
El programa comienza con la configuración del canal analógico de salida. El usuario
introduce la frecuencia de la onda que necesita y entonces el programa calcula el rango al
que pertenece ese dato. Aplicando la ecuación lineal correspondiente a ese rango se obtiene
directamente el voltaje que es necesario aplicar y entonces sólo tenemos que sacar ese
voltaje por la salida analógica que hayamos configurado.
El programa comienza su ejecución cuando el usuario introduce el valor de la
frecuencia deseada y finaliza cuando el usuario activa el botón ‘Stop’ que aparece en la
barra de herramientas del HPVEE.
6.2.3.1 DIAGRAMA DE FLUJO
En la Figura 6-13 se muestra el diagrama de flujo sobre el que se baja el programa
diseñado.
INICIO
Configuración del canal
analógico de salida
Frecuencia de la onda
Rango =
100 Hz
SI
Calcular voltaje para
rango 100 Hz
SI
Calcular voltaje para
rango 1KHz
NO
Rango =
1KHz
NO
Rango =
10KHz
SI
Calcular voltaje para
rango 10KHz
NO
Calcular voltaje para
rango 100KHz
Generación del voltaje
FIN
Figura 6-13: Diagrama de flujo del programa generador.vee
A continuación se describe detalladamente los objetos utilizados en la programación
para cada una de las fases que aparecen en el diagrama de flujo.
CONFIGURACIÓN DEL CANAL ANALÓGICO DE SALIDA
La configuración de los canales de salida se realiza con el objeto ‘D/A Config’, de
características similares al ya conocido ‘A/D Config’.
Figura 6-14: Cuadro de diálogo del objeto ‘D/A Config’
FRECUENCIA DE LA ONDA
Para calcular el voltaje hay que introducir la frecuencia deseada. Para ello se utiliza el
objeto ‘Real Slider’ (véase Figura 6-15). Éste objeto está activo desde el inicio del programa
a través de un objeto ‘Until Break’ de manera que cuando el usuario introduce la frecuencia
deseada el programa comienza automáticamente su ejecución.
Figura 6-15: Objeto ‘Real Slider’
También se dispone de un objeto ‘Meter’ (véase Figura 6-16) como visualización
alternativa de la frecuencia seleccionada.
Figura 6-16: Objeto ‘Meter’
RANGO DE LA FRECUENCIA
Una vez que el usuario introduce la frecuencia deseada, el programa calcula el rango
de frecuencias al que pertenece, para aplicarle una la ecuación correcta. Ésta decisión se
realiza con el objeto ‘If/Then/Else’ (véase Figura 6-17).
Figura 6-17: Objeto ‘If/Then/Else’
CÁLCULO DEL VOLTAJE
Hay un objeto ‘If/Then/Else’ por cada rango de frecuencia. El objeto ‘If/Then/Else’
que cumpla que la frecuencia se encuentra en su rango activará el cálculo de la ecuación
correspondiente. El cálculo se realiza con un objeto ‘Formula’ (véase Figura 6-18).
Figura 6-18: Objeto ‘Formula’
GENERACIÓN DEL VOLTAJE
Para sacar el dato a través de la salida se usa un objeto ‘Put Single Value’ (véase Figura
6-19).
Figura 6-19: Objeto ‘Put Single Value’
A este objeto se le especifica el canal por donde generar el voltaje (por defecto se
usa el canal 0) y el valor del voltaje que se quiere sacar. Este valor procede de los objetos
‘Formula’ y hay un objeto ‘Formula’ por cada rango. Dado que sólo se activa uno de estos
objetos durante la ejecución del programa, se usa el objeto ‘Junction’ (véase figura 6-20) para
hacer llegar al objeto ‘Put Single Value’ un solo dato.
Figura 6-20: Objeto ‘Junction’
6.2.3.2 PROGRAMA DE ADQUISICIÓN
El programa diseñado se llama Generador.vee y consta de dos paneles. En el
primero de ellos se detalla el flujo de datos y de control y se visualiza las conexiones entre
los diversos objetos (véase Figura 6-21). Es por lo tanto un panel de uso exclusivo del
programador. En este panel se encuentran las conexiones de todos los objetos
anteriormente explicados.
El panel de programador es el siguiente:
Figura 6-21: Panel de programador de Generador.vee
El segundo de ellos es el panel de usuario (véase Figura 6-22) donde aparece el
selector de frecuencia y a título informativo la señal de voltaje que hay que aplicar.
Figura 6-22: Panel de usuario de Generador.vee
7. CONFIGURACIONES DE FUNCIONAMIENTO
En este capítulo se describen las diferentes configuraciones que se pueden realizar con
los módulos electrónicos diseñados y construidos para el presente proyecto Fin de Carrera.
Éstas diferentes configuraciones cubren un amplio espectro de posibilidades en la
experimentación electrofisiológica y comprenden tanto los módulos diseñados y
construidos para el presente Proyecto Fin de Carrera, como otros sistemas comerciales (por
ejemplo el amplificador de “patch-clamp”). Las diferentes configuraciones con sus
respectivos usos son:
(a) Configuración integrada. Uso para el estudio fisiólogico y molecular de células excitables
secretoras de neurotransmisores oxidables (por ejemplo células cromafines de la médula adrenal,
células tumorales PC12 o neuronas dopaminérgicas). En este caso el estimulador puede
controlarse desde la tarjeta para generar pulsos despolarizantes a través de un
amplificador de “patch-clamp” sincronizados por la tarjeta con el registro de señales
electroquímica desde el amperómetro.
(b) Configuración simple 1. Uso para el estudio fisiológico y molecular de células no
excitables secretoras de neurotransmisores excitables (por ejemplo células cebadas de ratón y
células de la línea tumoral “rat basophilic leukaemic cells” RBL-2H3). En este caso la
estimulación
puede
hacerse
mediante
sustancias
químicas
aplicadas
extracelularmente y no es necesario el módulo estimulador. Las señales se
registran con el amperómetro y se adquieren con la tarjeta.
(c) Configuración simple 2. Uso para el estudio fisiológico y molecular de células excitables
secretoras de neurotransmisores no oxidables (por ejemplo las neuronas de hipocampo de ratón).
La liberación de neurotransmisor se monitoriza a través de las corrientes
postsinápticas. El generador se utiliza para estimular a través de un amplificador
de “patch-clamp” que registra las corrientes que se adquieren sincronizadamente
a través de la tarjeta.
Los módulos diseñados en este Proyecto Fin de Carrera pueden también utilizarse
independientemente. El estimulador y el amperómetro se pueden utilizar de forma flexible
integrados en otros sistemas de adquisición d datos diferentes al de este proyecto. Por otra
parte la tarjeta y el programa de adquisición y control se pueden utilizar para otras tareas
dentro o fuera del laboratorio de electrofisiología. En particular, se podrá utilizar en el
futuro para controlar un sistema de cierre y apertura de electroválvulas y el movimiento de
un brazo mecánico para administrar diversos tipos de fármacos y evaluar su acción sobre la
liberación de neurotransmisores en células aisladas.
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN................................................................................ 1
1.1
COMUNICACIÓN NEURONAL Y LIBERACIÓN DE
NEUROTRANSMISORES EN LA SINAPSIS ........................................................... 1
1.2
VESÍCULAS SINÁPTICAS: MICROMÁQUINAS MOLECULARES PARA
ALMACENAR Y LIBERAR NEUROTRANSMISORES.......................................... 4
1.3
CUANTIFICACIÓN DE LA LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISORES7
1.3.1
DETECCIÓN ELECTROQUÍMICA ....................................................... 8
1.3.1.1 PRINCIPIOS DE LA DETECCIÓN ELECTROQUÍMICA ............... 9
1.3.2
OTROS MÉTODOS EMPLEADOS EN EL ESTUDIO DE LA
LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISOR ......................................................... 18
2
OBJETIVOS ....................................................................................... 20
3
DISPOSITIVO EXPERIMENTAL .................................................. 22
3.1
DESCRIPCION DE LOS ELEMENTOS DEL DISPOSITIVO
EXPERIMENTAL ..................................................................................................... 23
3.2
DETALLE DESCRIPTIVO DE LOS ADAPTADORES MECÁNICOS ..... 27
4
DISEÑO Y CONSTRUCCIÓN DE UN AMPLIFICADOR DE
SEÑALES AMPEROMÉTRICAS .......................................................... 32
4.1
DESCRIPCIÓN DEL AMPLIFICADOR DE AMPEROMETRÍA............... 32
4.1.1
CONVERTIDOR CORRIENTE-VOLTAJE ......................................... 34
4.1.2
ESTIMULACIÓN .................................................................................. 37
4.1.3
RESTADOR ........................................................................................... 38
4.1.4
CORRECCIÓN DEL OFFSET .............................................................. 39
4.1.5
GANANCIA........................................................................................... 39
4.1.6
FILTRADO ............................................................................................ 41
PROCEDIMIENTO DE DISEÑO ..................................................................... 41
4.1.7
ALIMENTACIÓN ................................................................................. 48
4.2
IMPLEMENTACIÓN DEL SISTEMA DISEÑADO. ESQUEMÁTICOS Y
TRAZADO DE PISTAS. ........................................................................................... 49
4.2.1
DESCRIPCIÓN DEL PANEL FRONTAL............................................ 51
4.2.2
ESQUEMÁTICOS Y TRAZADO DE PISTAS..................................... 54
4.3
ANÁLISIS DEL RUIDO ............................................................................... 64
4.3.1
RUIDO EN LAS MEDIDAS ELECTROFISIOLÓGICAS ................... 64
4.3.2
FUENTES DE RUIDO EN EL AMPLIFICADOR DE
AMPEROMETRÍA ................................................................................................ 71
4.4
VALIDACIÓN DEL AMPLIFICADOR DE AMPEROMETRÍA ................ 72
5
DISEÑO Y CONSTRUCCIÓN DE UN SISTEMA DE
ADQUISICIÓN DE SEÑALES AMPEROMÉTRICAS....................... 76
5.1
CARACTERÍSTICAS DEL SISTEMA......................................................... 76
5.2
IMPLEMENTACIÓN HARDWARE DEL SISTEMA DE ADQUISICIÓN 77
5.3
IMPLEMENTACIÓN SOFTWARE DEL SISTEMA DE ADQUISICIÓN . 79
5.3.1
DESCRIPCIÓN DEL HPVEE ............................................................... 79
5.3.2
PROGRAMACIÓN EN HPVEE ........................................................... 80
5.3.2.1 DIAGRAMA DE FLUJO................................................................... 81
5.3.2.2 PROGRAMA DE ADQUISICIÓN .................................................... 89
6
DISEÑO Y CONSTRUCCIÓN DE UN MÓDULO DE
ESTIMULACIÓN ..................................................................................... 92
6.1
DESCRIPCIÓN DEL GENERADOR DE ONDAS ...................................... 94
6.2
IMPLEMENTACIÓN DEL SISTEMA DISEÑADO. ESQUEMÁTICOS Y
TRAZADO DE PISTAS. ......................................................................................... 100
6.2.1
DESCRIPCIÓN DEL PANEL FRONTAL.......................................... 101
6.2.2
ESQUEMÁTICOS Y TRAZADOS DE PISTA................................... 105
6.2.3
PROGRAMACIÓN EN HPVEE ......................................................... 111
6.2.3.1 DIAGRAMA DE FLUJO................................................................. 111
6.2.3.2 PROGRAMA DE ADQUISICIÓN .................................................. 115
7
CONFIGURACIONES DE FUNCIONAMIENTO ....................117
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................119
ANEXO I HOJAS DE DATOS TÉCNICOS DE LOS
DISPOSITIVOS ELECTRÓNICOS ................................................... I-1
I-01
I-02
I-03
I-04
AMPLIFICADOR OPERACIONAL LF356N ................................................I-2
AMPLIFICADOR OPERACIONAL OPA111AM ......................................I-25
GENERADOR DE ONDAS ICL8038 ...........................................................I-39
RESISTENCIA DE 1 G Ω ................................................................................I-61
ANEXO II DATOS TÉCNICOS DE LOS COMPONENTES DEL
SISTEMA DE EXPERIMENTACIÓN .............................................. II-1
II-01 TARJETA DE ADQUISICIÓN DT302 .................................................... ...II-2
II-02 MICROSCOPIO AXIOVERT 200 ..........................................................….II-13
II-03 SISTEMA DE CONTROL PIEZOELÉCTRICO SERIE PXY
PIEZOSYSTEM JENA ...............................................................................................II-23
II-04 MICROMANIPULADOR DE PRECISIÓN SERIE UMR ................ ...II-29
II-05 MESA NEUMÁTICA ANTIVIBRATORIA 65-300 ...................................II-39
ANEXO III TEST DE FUNCIONAMIENTO DEL GENERADOR
DE ONDAS ......................................................................................... III-1
III-01 HOJAS DE DATOS Y RESULTADO DE LA REGRESIÓN ..............III-2
III-02 RESUMEN DATOS REGRESIÓN PARA RANGO 100 Hz .................III-3
III-03 RESUMEN DATOS REGRESIÓN PARA RANGO 1 kHz .................III-4
III-04 RESUMEN DATOS REGRESIÓN PARA RANGO 10 kHz ...............III-5
III-05 RESUMEN DATOS REGRESIÓN PARA RANGO 100k Hz .............III-6
ANEXO IV BLOQUES BÁSICOS DE DISEÑO CON
AMPLIFICADORES OPERACIONALES ...................................... IV-1
IV-01 CONVERSOR CORRIENTE-VOLTAJE ..................................................IV-2
IV-02 SEGUIDOR DE TENSIÓN..........................................................................IV-3
IV-03 INVERSOR........................................................................................................IV-3
IV-04 SUMADOR INVERSOR ...............................................................................IV-4
IV-05 RESTADOR ......................................................................................................IV-5
IV-06 GENERADOR DE NIVEL DE CONTÍNUA ..........................................IV-6