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Fundada en 1973
ISSN 0716-0135
REVISTA CHILENA DE
TECNOLOGIA MEDICA
VOLUMEN 21 – Nº 2 – DICIEMBRE 2001
Revista Indizada en:
Index Medicus Latinoamericano (IMLA) de la Biblioteca Regional de Medicina y Ciencias de la Salud
(BIREME) - LILACS
Rev. Chil. Tecnól. Méd. 21(2), 945-949, 2001.
ARTICULO ORIGINAL
INMUNOREACTIVIDAD DE ENOLASA EN EL EPITELIO
SEMINIFERO SENIL HUMANO
IMMUNOREACTIVITY TO ENOLASE IN THE HUMAN SENIL
SEMINIFEROUS EPITHELIUM
T.M. Juan Carlos Araya1; Adolfo Ríos2; Patricio Torres2; Dr. Enrique Ossandón2; MV. Héctor Rodriguez2.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -(1) Laboratorio Histopatología Histomed
(2) Programa de Morfología. ICBM. Facultad de Medicina. Universidad de Chile
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -RESUMEN
El metabolismo energético intracelular compartimentalizado, activa la enzimo enolasa para formar ácido pirúvico.
Este, como substrato energético, debe ingresar a las mitocondria para continuar hacia el ciclo de los ácidos
tricarboxílicos. Sin embargo, durante la proliferación del epitelio seminífero ocurre una redistribución y pérdida
citoplasmática progresiva y disposición de las mitocondria a nivel del flagelo inicial.
En el presente estudio se describe la inmunoreactividad de la enzimo enolasa en las diferentes poblaciones
celulares del epitelio seminífero, en testículo humano senil.
Se trabajó con un paciente de 70 años, sometido a orquiectomía subcapsular terapéutica. El tejido testicular fue
fijado inmediatamente en Formalina tamponada al 10% y mantenido por 12 horas. Luego se procesó por técnicas
histológicas corrientes e incluyó en parafina para obtener secciones de 5 um. Posteriormente se procedió a la
reacción inmunohistoquímica para enolasa y revelación con complejo avidina-biotina. Finalmente se cuantificaron
las distintas poblaciones celulares del epitelio seminífero con reacción positiva o negativa.
Los resultados preliminares se expresan en porcentajes de células positivas respecto del total de células contadas
(40x. Se observó que la totalidad de las células de Sértoli presentaron reacción negativa a enolasa. En el epitelio
seminífero se encontró que el 76% de las gonias (gonias tipos A y B) mostraron reacción positiva a enolasa,
mientras que en Citos I se redujo al 10% y ausencia total en espermátidas y espermatozoides.
Por lo tanto, las células somáticas (de origen mesodérmico), del epitelio seminífero presentarían isoenzimas
enolasas de reactividad diferente en relación con la línea germinal (espermatogonias). Adicionalmente, en la línea
germinal la inmunoreactividad a enolasa disminuye mientras progresa la espermatogénesis.
Palabras clave: espermatogénesis, enolasa, epitelio seminífero, inmunohistoquímica.
ABSTRACT
The energetic intracelular metabolism distributed in compartiments, activates enolase enzyme to form piruvic acid. This, as
energetic substract, must enter to the mitochondria to continue through the tricarboxilic acids cycle. However, during the
proliferation of the seminiferous epithelium, there is a progressive redistribution and loss of the cytoplasm and a
mitochondryal disposition al the initial flagellum.
The present study describes immunoreactivity of enolase enzyme in various cell population of the seminiferous epithelium, in
senile human testicle.
A seventy years old patient was selected, subjected to therapeutic subcapsular orchiecthomy. The testicular tissue was
immediately tamponated formalin-fixed and keeped for 12 hours. Posteriorly, it was processed by means histologycal
techniques and paraffin embedded to obtain sections of 5 m. Afterwards it was applied the immunohistochemistry reaction
for enolase and revelation with avidin-biotin-complex. Finally, the various cell population of the seminiferous epithelium were
quantified, with positive or negative reaction.
Preliminary results are expressed in terms of percentage of positive cell related to the total cell counted (40x). It was
observed that the totality of Sertoli cell showed a negative reaction to enolase. In the seminiferous epithelium it was found
that 76% of gonias (type A & B) reacted positively to enolase, while in Citos I it was reduced to 10%, showing a total
absence in spermatide and spermatozoid.
Therefore, somatic cell (with mesodermic origin) of the seminiferous epithelium would present a different reactivity of
isoenzymes enolase when related to the germinal line (spermatogonium). Additionally, in the germinal line, immunoreactivity
to enolase decrease while spermatogenesis increase.
Key words: Spermatogenesis, enolase, seminiferous epithelium, immunohistochemistry.
945
INTRODUCCION

Epitelio Seminifero
Los túbulos seminíferos están conformados
por células germinales proliferantes y células
de sostén no proliferantes. Las primeras
corresponden a las espermatogonias y la
segundas, a las de Sértoli y mioides o
peritubulares.
Las espermatogonias se
hallan en contacto con la membrana basal
del túbulo seminífero y se van acercando
hacia el lúmen del mismo en tanto ocurren
los distintos estadíos de su maduración, lo
que constituye la espermiogénesis; así
podemos observar Gonias A pálida y A
oscura, gonias B, Citos, espermátidas y
(1,2,3)
espermatozoides
y cuya presencia va
variando de acuerdo a los distintos estados
fisiológicos del individuo adulto, aunque se
considera
que
el
proceso
de
la
espermatogénesis abarca aproximadamente
(1)
un período de 3 meses. Todo esto se
encuentra regulado en mayor o menor
medida por la influencia de hormonas
gonadotropas, en especial la FSH, que actúa
a nivel del epitelio seminífero y es parte
(2)
activa en su maduración y conservación.

Senilidad
Es evidente que con la edad los procesos
citados tienen alteraciones morfológicas
importantes y que son capaces de interferir
con la función normal del epitelio seminífero,
tales como reducción del diámetro tubular y
de la altura epitelial, una notoria disminución
de las células de Sértoli, una leve reducción
del número de espermatogonias, alteración
en
la
relación
gonia/Sértoli,
menor
porcentaje
de
espermátidas
y
espermatozoides por túbulo, mayor grado de
vacuolización y soluciones de continuidad
epitelial
en
los
túbulos
seminíferos
(47)
seniles,
siendo algunos
de estos
cambios histológicos atribuíbles a un patrón
predeterminado
de
envejecimiento
y
(4)
apoptosis celular;
variaciones a nivel
hormonal de FSH, LH, estradiol y
testosterona en el plasma, alteraciones en el
eje hipotalámico - pituitario - testicular,
implicarían disminución del lumen de los
túbulos,
esclerosis
e
insuficiencia
(8,9)
vascular.
No obstante lo anterior, estas
modificaciones
parecen
no
influir
suficientemente en la espermatogénesis y el
sujeto conserva su capacidad fecundante,
con
espermatozoides
móviles
de
(4,10)
características aparentemente normales.

Inmunoreactividad
Es innegable que la Inmunohistoquímica
(IHQ), desde que comenzó a ser utilizada
como un método rutinario en los laboratorios,
se ha convertido en un elemento decisivo
importante para resolver algunos problemas
(1119)
biológicos. Sus técnicas
están basadas
en la visualización de antígenos o
anticuerpos, mediante la formación del
complejo antígeno-anticuerpo, el cual se
pone en evidencia por: a) la conjugación de
un colorante fluorescente; o, b) la detección
de una enzima en una etapa posterior. Tanto
en una como en otra, es requisito
fundamental tener presente tres etapas: 1)
Preparación del tejido para conservar los
antígenos o anticuerpos; 2) Precipitación de
estos para su visualización posterior; 3)
Preparación del conjugado fluorescente o
complejo enzimático, según sea el método
utilizado para evidenciar.

Enolasa
La Enolasa Neurono Específica es la más
acídica isoenzimo de las enzimas glicolíticas
enolasa y es utilizada como un marcador
citoplasmático de neuronas y tejido
(20)
neuroendocrino.
Por lo anterior, se
encuentra presente normalmente en las
(21,22)
neuronas cerebrales
, nervios periféricos,
islotes de Langerhans del páncreas, células
de
Merkel
y
células
del
sistema
neuroendocrino (pulmón, páncreas, tracto
gastrointestinal,
adrenal,
pituitaria
y
melanocitos); y patológicamente en tumores
de las células de Merkel, feocromocitoma,
paraganglioma, neuroblastoma, adenomas
de la pituitaria, melanoma, neurofibroma,
schwannoma, carcinoide, nevos, tumores de
las
células
granulares,
gastrinoma,
carcinomas de ovarios y de mama, léntigo
(23)
maligno y nevus celular azul.
Igualmente
(2427)
se ha descrito en células de Leydig
y
(28,29)
tumores puros y mixtos de testículo.
946
HIPÓTESIS

El metabolismo energético intracelular
compartimentalizado, activa
la enzimo
enolasa para formar ácido pirúvico. Este,
como sustrato energético, debe ingresar a las
mitocondria para continuar hacia el ciclo de
los ácidos tricarboxílicos.
Sin embargo,
durante la proliferación del epitelio seminífero
ocurre
una
redistribución
y pérdida
citoplasmática progresiva, así como también
de las mitocondria que se sitúan a nivel del
flagelo inicial. Se plantea entonces que si la
Enolasa participa en este proceso en la
catalización de la deshidratación irreversible
en la vía glicolítica de 2-fosfoglicerato a agua
y fosfoenolpiruvato, precursor directo del
ácido pirúvico metabolito fundamental para
el aporte energético del ciclo de los ácidos
tricarboxilicos, ésta debería estar presente
en la línea germinal testicular.
Los bloques de tejido fueron fijados por
inmersión en formalina tamponada al 10%
incluídos en parafina, cortados en micrótomo
rotatorio a 5 m de espesor y montados en
portaobjetos pretratados con una solución de
Vectabond (Vector Labs).
Los cortes
obtenidos fueron divididos para estudio
morfohistológico topográfico corriente y
teñidos con Hematoxilina.-Eosina (H/E); y
para evaluación inmunohistoquímica (IHQ),
los cuales fueron pretratados con una
solución recuperadora de antígenos y luego
se incubaron por 10 minutos a temperatura
ambiente con el anticuerpo primario de
Enolasa, como marcador.
Después se
procedió a su revelado siguiendo la técnica
estandar con el complejo de avidina-biotina
(ABC). La reacción antígeno-anticuerpo fue
puesta en evidencia mediante el cromógeno
3-amino-9-etilcarbazol (AEC), las muestras
se montaron en medio hidrófilo permanente
Faramount (Dako, S3025) y la verificación de
la especificidad de la reacción fue
comprobada con controles positivos externos
e internos, considerando para esto último a
las células de Leydig presentes en los
mismos cortes tratados, y controles
negativos. Todos los especímenes fueron
inhibidos de peroxidasa endógena mediante
una exposición previa al proceso de
incubaciones, por 5 minutos con peróxido de
hidrógeno al 3%.
OBJETIVO
Este
estudio
pretende
describir
la
inmunoreactividad a Enolasa en las
poblaciones celulares de testículo senil
humano.
MATERIALES Y METODOS

Biológico
Tejido testicular obtenido de un paciente de
70
años,
sometido
a
orquiectomía
subcapsular terapeútica por neoplasia
prostática sin tratamiento previo.

Reactivos
-
Formalina tamponada al 10%
Hematoxilina de Harris
Eosina al 1%
Enolasa Neurona Específica (Dako,
N1516), anticuerpo primario aislado de
conejo en 0.05M de buffer Tris-HCl, pH
7.6, con un vehículo proteíco y 15 mM de
azida de sodio como preservante y cuyo
inmunógeno es un homodímero de 90 kD
de peso medio.
Su reacción es
predominantemente con subunidades
gamma de origen neuronal y no presenta
reacción cruzada con subunidades alfa.
Kit de revelado avidina-biotina-complex
(LSAB-2, Dako, K0677).
-
Procedimientos
Posteriormente se procedió a cuantificar el
número de células positivas según tipo de
población celular, en los túbulos seminíferos
cortados transversalmente presentes en las
muestras de tejido, siendo n=32.
RESULTADOS
La inmunoreacción pone en evidencia que en
los cortes transversales de los tubulos
seminíferos seniles humanos, las células de
Sertoli presentan negatividad a la enzimo
Enolasa, en tanto que la línea germinativa
mostró una positividad de 76% en las gonias
A y B, de 10% en espermatocitos I y
ausencia
total
en
espermátidas
y
espermatozoides, como se muestra en la
Tabla siguiente:
947
CELULAS ENOLASA POSITIVA (%)
Túbulos
Totales
32
Gonias A + B
Positivas
76
Cito I
Paquiteno
10
Espermátidas
Espermatozoides
0
Sértoli
0
Las fotomicrografías destacan en un fuerte color rojo, dado por el cromogeno 3 – amino – 9 –
etilcarbazol (AEC), la inmunoreacción positiva en las células señaladas precedentemente y en las
células de Leydig utilizadas como control positivo interno de la reacción.
Foto 1: La microfotografia muestra 4 campos
con cortes transversales de túbulos seminíferos
humanos seniles, teñidos con Hematoxilina –
Eosina, que permiten observar la arquitectura
que estos presentan (10x).
Foto 3: Fotomicrografía que muestra un corte de
epitelio seminífero con positividad (rojo) para
enolasa neurono específica (ENE) (40x).
Foto 2: Microfotografía con un corte de túbulo
seminífero humano senil, mostrando células de
Leydig marcadas inmuhistoquimicamente con
ENE (+), puestas en evidencia mediante AEC en
color rojo brillante en el citoplasma y que fueron
utilizadas como control positivo interno de la
reacción (40x).
Foto 4: Corte de túbulo seminífero humano senil,
en el que se observan Espermatogonias A y B (+)
a la inmunoreacción con enolasa neurono
específica (ENE) en color rojo (40x).
CONCLUSIONES
seminífero, presentarían isoenzima Enolasa
de reactividad diferente en relación a la que
se encuentra presente en la Línea germinal
(espermatogonias).
De acuerdo con los resultados obtenidos, es
posible postular que las células de Sértoli,
derivados
mesodérmicos
del
epitelio
948
Por otra parte, en concordancia con la propia
línea germinal, se comprueba que la ENE
está presente en las células proliferativas en
cantidades que están en directa proporción
con el estadío de maduración y que la
inmureactividad a Enolasa claramente
disminuye
mientras
progresa
la
espermatogenensis.
Lo anterior estaría de acuerdo con lo
señalado por diversos investigadores en el
sentido
de
que
las
alteraciones
experimentadas por el tejido testicular
durante el envejecimiento, se encuentran
relacionados con cambios en la expresión de
los genes que codifican sus diversas
estructuras e igualmente, la presencia de
enzimas clave para el desarrollo y
reproducciòn celular pueden variar la
composición molecular y su distribución en
los distintos tipos celulares, aún cumpliendo
la misma función.
REFERENCIAS
1)
Bustos Obregón, E.. Andrología. Universitaria,
Santiago, 1999
2) Ferner, H. Embriología Humana, Herder, Barcelona
,1972.
3) Davidoff, M.; Breucker, H..; Holstein, A.; Seidl, K.
Cellular architecture of the lamina propria of human
seminiferous tubules. Cell. Tissue Res, 262: 253261, 1999.
4) Ravaglia, G.; Forti, F.; Scali, RC.; Boschi, F.;
Pratelli, L; Pizzoferrato, A.; Gasbarrini, G. Hormonal
changes in male - subjects over ninety. Boll. Soc.
Ital. Biol. Sper, 71: 133-139, 1995.
5) Johnson, L.; Nguyen HB.; Petty CS.; Neaves WB.
Quantification of human spermatogenesis: germ cell
degeneration during spermatocytogenesis and
meiosis in testes from younger and older adult men.
Biol. Reprod, 37: 739 -747, 1987.
6) Paniagua, R.; Nistal, M.; Sáez, FJ.; Fraile, B..
Ultraestructure of the aging human testis.
J.
Electron. Microsc. Tech, 19: 241-260, 1991.
7) Johnson, L.; Petty, CS.; Neaves, WB. Age relatad
variation in seminiferous tubules in men. A
stereologic evaluation. J. Androl, 7: 316-322, 1986.
8) Taitouras, P.D; Bulat, T.. The aging male
reproductive system. Endocrinol. Metab. Clin. North.
Am, 24: 297 - 315, 1995.
9) Paniagua, R., Martin, A.; Nistal, M.; Amat, P..
Testicular involution in elderly men: comparison of
histologic quantitative studies with hormone
patterns. Fertil. Steril, 47: 671-679, 1987.
10) Vermeulen, A.. Environment, human reproduction,
menopuse, and andropause.
Environ. Health
Perspect, 101, Suppl 2: 91-100, 1993.
11) Bourne, Janice. Handbook of immunoperoxidase
staining methods. Dako Co., California, 1983.
12) Naish S.; Boenisch, T.; Farmilo, A.J. and Stead,
R.H..
Handbook immunochemical staining
methods. Dako Co., California, 1989.
13) Müller-Hermelink, H.K. and Hansmann, M.L..
Immunohistochemical procedures: application and
problems. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22. 953958, 1984.
14) Faline, B. and Taylor, C.R.. New developments in
immunoperoxidase techniques and their application.
Arch. Path. Lab. Med. 107, 105-117, 1983.
15) Davidoff, M.; Schulze, W.. Combination of the
peroxidase antiperoxidase (PAP) and the avidinbiotin-peroxidase complex (ABC) techniques: an
amplification alternative in immunocytochemical
staining. Histochemistry, 93: 531-536, 1990.
16) Hsu, S.M.; Raine, L. and Fanger, H.. The use of
avidin-biotin-peroxidase
complex
(ABC)
in
immunoperoxidase techniques: a comparison
between ABC and unlabeled antibody (PAP)
procedures. J. Histochem. Cystochem. 29, 577580, 1981.
17) DeLellis, R.A.. Diagnostic Immunohistochemistry.
Masson Publishing, New York, 1981.
18) Araya, JC.. Inmunohistocompatibilidad entre
anticuerpos primarios y secundarios de diversa
procedencia comercial. Rev. Chil. Tecnol. Méd. 20
(1-2), 865-870, 2000.
19) Araya
JC..
Inmunohistocompatibilidad
entre
anticuerpos primarios de distinta procedencia
comercial y kit universal secundario. Rev. Chil.
Tecnol. Méd. 20 (1-2), 871-876, 2000.
20) Sato, T.. Sensory and endocrine characteristics of
the avian pineal organ. Microscopy Res. and Tech.
53 (1), 2-11, 2001.
21) Marangos, PJ; Zis, AP; Clark, RL; Goodwin, FK;
Neurona, nonneuronal and hybrid forms of the
nervous system specific protein 14 – 3 – 2 from rat
brain.
Purification, subunit composition and
comparison to the beef brain protein. J. Biol. Chem.
250: 1884 – 1891, 1978.
22) Moore, BW; Mac Gregor, D. Chromatographic and
electrophoretic fractionation of soluble proteins of
brain and liver. J. Biol. Chem. 240: 1647 – 1650,
1965.
23) Fujita, T.. Present status of paraneuron concept.
Arch. Histol. Cytol, 52: Suppl, 1-8, 1989.
24) Schulze, W.; Davidoff, MS.; Ivell, R.; Holstein, AF..
Neuronspecific enolase-like immunoreactivity in
human Leydig cells. Andrología, 23: 279-283, 1991.
25) Middendorff, R.; Davidoff, M.; Holstein, A.
Neuroendocrine marker substances in human
Leydig cells - changes by disturbances of testicular
function. Andrología, 25: 257-262, 1992.
26) Davidoff, MS; Schulze, W; Middendorff, R; Holstein,
A-F. The Leydig cell of the human testis –a new
member of the diffuse neuroendocrine system. Cell
Tissue Res. 271: 429-439, 1993.
27) Davidoff, MS; Middendorf, R; Holstein, A-F. Dual
nature of Leydig cells of the human testis.
Biomedical. Rev. 6: 11-41, 1996.
28) Sturm, U.; Kunze, KD.; Kelly, LU.. Primary carcinoid
of the testis. Z. Pathol, 137: 376-378, 1991.
29) Zavala-Pompa, A.; Ro, JY.; El-Naggar, A.; Ordoñez,
N.; Amin, M.; Pierce, P.; Ayala, A..
Primary
carcinoid tumor of testis. Immunohistochemical,
Ultraestructural, and DNA Flow Cytometric study of
three cases with a review of the literature. Cancer,
72: 1726-1732, 1993.
949