PRACTICA No. 13 ENFERMEDADES HUMANAS PRODUCIDAS POR HONGOS OBJETIVOS Apropiar las definiciones y clasificación clínica de las enfermedades producidas por hongos en el ser humano. Conocer las principales técnicas de laboratorio empleadas para el diagnóstico de micosis humanas. Aprender los principales géneros de hongos causantes de micosis en humanos. Identificar las estructuras fúngicas que son útiles para el diagnóstico de las micosis en humanos tanto en el examen directo de muestras clínicas, como en los aislamientos recuperados en el cultivo MARCO TEORICO La incidencia de las enfermedades causadas por hongos es desconocida, pues la mayoría de ellas no se notifican, aunque pueden ser tan frecuentes como la gripa. El hombre es hospedero accidental para los hongos por inhalación, ingestión o introducción accidental de esporas en los tejidos como consecuencia de traumas. Según su mecanismo patogénico, las enfermedades producidas por hongos se pueden dividir en: 1. Alergia Causada por sensibilización a los antígenos de la pared del hongo. Se produce por inhalación de conidias, esporas o fragmentos miceliales de algunas especias fúngicas induciendo una respuesta inmune mediada por IgE o por formación de inmunocomplejos IgG. Esto da lugar a la aparición de sintomatología clínica en forma de rinitis, asma bronquial y alveolitis o neumonitis generalizada. Esta última, conocida clásicamente como el "pulmón del granjero" se ha visto relacionada con la exposición a aires acondicionados, pues las conidias o esporas pueden colonizar los ductos de los mismos. 2. Intoxicación La intoxicación producida por la ingestión de un hongo es conocida como micetismo y la intoxicación producida por la ingestión de alimentos contaminados con toxinas producidas por los hongos se denomina micotoxicosis. 3. Micosis La colonización o invasión en el ser humano por una especie fúngica se denomina micosis. La mayoría se adquieren por inhalación o inoculación de conidias o esporas. El tipo de micosis depende de las propiedades tanto del parásito (capacidad patógena), como del hospedero (inmunidad), así como de la ecología (distribución geográfica y acceso o terreno adecuado). El modo de transmisión puede ser por inhalación, inoculación, contacto y endógena (de tejido a tejido). La mayoría de dermatofitosis se adquieren por contacto interhumano (especies antropofílicas) o por contacto con animales (especies zoofílicas). Las micosis pueden ser producidas por hongos "patógenos" y por "oportunistas". En los primeros, la infección depende de la cantidad de inóculo y la respuesta inmune provocará la aparición de un granuloma como en el caso del histoplasma. En los segundos, influirá la disminución de la respuesta inmune en el hospedero. Clasificación de las micosis Las micosis se pueden clasificar según el grado de profundidad de la lesión en: I. Micosis superficiales II. Micosis subcutáneas III. Micosis sistémicas oportunistas IV. Micosis sistémicas endémicas II. Micosis superficiales: Se pueden subdividir en diferentes grupos, de acuerdo con el agente causal y con algunas características de la enfermedad. 1. Micosis dermatofíticas o tiñas: Infección causada por hongos dermatofitos que invaden el estrato corneo y estructuras queratinizadas como pelo y uñas, generando una respuesta inflamatoria en el hospedero. Causadas por 3 géneros: Epidermophyton: Infecta piel y uñas Trichophyton: Infectan piel, uñas y cabello Microsporum: Infectan la piel y el cabello El diagnostico de estas infecciones se realiza por medio del examen directo del material proveniente del sitio de la lesión y del cultivo de este material en agar Sabouraud y Sabouraud mas cicloheximida (Mycosel). Los hongos dermatofitos crecen en los dos medios y los hongos no dermatofitos crecen en agar de Sabouraud sin antibiótico. Examen directo: Para hacer el diagnostico de las dermatofitosis, al igual que en cualquier entidad clínica, es muy importante realizar una historia clínica completa, en la que se registren antecedentes de importancia y obtener una muestra adecuada del sitio de la lesión. En el caso de la piel, se debe tomar muestra del borde activo de la lesión, a través de raspado con una hoja de bisturí estéril. En muestras de cabello, si hay lesión en cuero cabelludo, tomar escamas con la hoja de bisturí y también cabellos con lesión. Las muestreas de uñas deben tomase realizando previa desinfección con gasa humedecida en alcohol o isodine y tomar muestra de la zona lesionada con ayuda del bisturí, removiendo el detritus subungeal. Se deben tener en cuenta algunas recomendaciones: el paciente no debe ingerir ningún medicamento antimicótico, ni debe aplicarse remedios caseros (hipoclorito, creolina) por lo menos 2 semanas antes del examen; no debe cortar, ni remover el material de la uña en los días previos al examen. En el examen directo se pueden observar hifas, artoconidios o clamidosporas. Características macroscópicas (en medio de cultivo) y microscópicas de los géneros de hongos causantes de dermatofitosis: A continuación se describen las estructuras de reproducción asexual usadas para la identificación de algunos de los dermatofitos aislados con mayor frecuencia en clínica. Mycrosporum: El género se caracteriza por la presencia de macroconidios y microconidos. Los macroconidios son de pared rugosa, de forma elíptica y los extremos pueden ser más delgados en algunas especies. Usualmente tienen de 3 a 15 células. Los microconidos son ovoides pero generalmente escasos. Mycrosporum canis: Macroconidos de 6 a 15 células, pared gruesa, rugosa, ornamentada, con extremos más delgados. Además se pueden observar microconidas. Colonia de reverso amarillo, algodonosa, abundante crecimiento en medio de arroz. Mycrosporum gypseum: Macroconidos elipsoidales simétricos, de pared delgada con 4 a 6 células, extremo distal redondeado extremo proximal (adyacente a la hifa) truncado. Microconidios piriformes presentes. Colonia polvorienta color canela. Epidermophyton floccosum: Presenta solo macroconidios en forma de bate, con extremo distal más ancho que el proximal, poseen de 2 a 5 células. También se observan clamidioconidios. Las colonias son de color amarillo verdoso. Trichophyton: Macroconidos escasos, de pared delgada, forma de lápiz con 3 a 8 células. Solamente algunos aislamientos producen abundantes macroconidios. Microconidios abundantes redondos u ovalados, pueden observarse en grupos o solitarios a lo largo de la hifa. Trichophyton mentagrophytes: Microconidios redondos a ovales, formando frecuentemente grupos, algunas hifas en forma de espiral. Escasos macroconidios de pared lisa y delgada, clavados, multiseptados. Cultivos algodonosos de color blanco a beige que con el tiempo, se vuelven colonias polvorientas. Son ureasa positiva en 2 a 4 días. Trichophyton rubrum: El micelio habitualmente es estéril, con presencia de corpúsculos terminales. Los macroconidios no son frecuentes y si están presentes, son de pared delgada con 3 a 8 células. Presenta escasos microconidios ovoides, piriformes a lado y lado de la hifa. Las colonias producen pigmento rojo en agar PDA y son ureasa negativa hasta 7 días después de sembrada. 2. Micosis no dermatofiticas o dermatomicosis: Infecciones causadas por hongos no dermatofiros a nivel de piel y uñas. Los hongos no dermatofitos que se recuperan con mayor frecuencia son Fusarium, Scopulariopsis, Penicillium, Scytalidium, Aspergillus, entre otros. El diagnóstico se hace a través del examen directo y cultivo e identificación del microorganismo. En preparación con KOH al 10%, es posible por ejemplo, observar hifas dematiaceas, anchas, septadas de Scytalidium dimidiatum a partir de material de uña infectada. Los agentes causantes de dermatomicosis pueden recuperarse como contaminantes de laboratorio, razón por la cual el diagnostico debe estar fundamentado en la observación de estructuras al examen directo, así como también, en el cultivo del agente causal en mas de la mitad de los puntos de siembra en las cajas de agar Sabouraud (recuerde que estos hongos no crecen en Mycosel). Adicionalmente se recomienda en todos los casos, corroborar el diagnostico con una segunda muestra que confirme los resultados previos. 3. Micosis superficiales de climas tropicales: Son las micosis que afectan únicamente la capa mas externa de la piel y son consideradas no invasivas y asintomáticas, aunque de carácter cosmético. Se caracterizan por la escasa o nula respuesta inflamatoria. Pitiriasis versicolor Tiña negra Piedra negra Piedra blanca Pitiriasis versicolor: infección superficial de la piel de tipo cosmético causada por especies del genero Malassezia. El diagnostico de esta entidad se realiza por examen directo del material con KOH 10% y la observación de levaduras y restos de micelio. Esta levadura puede cultivarse en medios enriquecidos con lípidos, sin embargo no es necesario realizar el cultivo para el diagnostico. Se reconocen por lo menos siete especies dentro del genero Malassezia, que solo se pueden diferenciar mediante pruebas adicionales de laboratorio y en este caso se requiere del cultivo para tal fin. Tiña negra: Infección de capas queratinizadas de la piel. Al examen clínico, se observan maculas negras en palmas de manos y plantas de pies. El agente etiológico es Exophiala werneckii. El diagnostico se realiza mediante el examen directo y el cultivo, de ser posible. El examen directo de lesión permite observan hifas dematiaceas septadas y levaduras de dos células características de Exophiala werneckii. Piedra negra: Infección del pelo caracterizada por nódulos pétreos en el cuero cabelludo. El diagnostico se realiza por examen directo, observando la presencia de nódulos en el cabello, en los cuales se evidencia la estructura de reproducción sexual: un ascostroma, con ascos redondos u ovales y ascosporas en forma de banano. El agente etiológico es Piedraia hortae pero no es un hongo cultivable. Esta entidad se presenta en Colombia con más frecuencia en los Llanos Orientales. Piedra blanca: Se caracteriza por la formación de nódulos blancos a cafés en el pelo, especialmente en la región de la barba, axila y pubis. El diagnostico se realiza por examen directo con KOH, en donde se observan artroconidias redondeadas, rodeando el cabello. El cultivo muestra la presencia de artroconidios y blastoconidios características de Trichosporon beigellii. III. Micosis subcutáneas Son infecciones causadas por la introducción traumática del hongo en tejido subcutáneo. Los hongos causantes de estas patologías son ubicuos y habitan en el suelo o en la vegetación. Los diferentes tipos de micosis subcutáneas son los siguientes: Esporotricosis Cromoblastomicosis Micetoma Zigomicosis subcutaneas Rinoentomoftoromicosis Lobomicosis Esporotricosis: Entidad causada por el hongo dimórfico Sporothrix shenckii, El diagnostico se realiza por el aislamiento del hongo y su identificación. El examen directo con KOH no muestra estructuras características. En coloraciones especiales como PAS, platametinamina y otras, en el examen del material de la lesión, es posible observar levaduras pequeñas. El cultivo a 25 ºC, muestra la producción de colonias correosas, que producen conidos en grupos sobre conidioforos. A 37 ºC se observa el desarrollo de colonias levaduriformes, que muestran levaduras muy pequeñas con gemaciones elongadas. Cromoblastomicosis: Entidad causada por hongos de los géneros Fosecaea, Phialophora, Cladosporium, Rhinocladiella entre otros. El diagnostico se realiza por la observación de esclerotes de mediar (estructuras del hongo) en el examen directo con KOH y el cultivo que permite la identificación del microorganismo. En las biopsias coloreadas con hematoxilina-eosina, se observan los característicos cuerpos escleróticos divididos por fisión binaria y no por gemación. IV. Micosis sistémicas endémicas Son enfermedades producidas por hongos dimórficos, que viven saprofiticamente, en forma de hongo filamentoso, en áreas geográficas definidas. Una vez que el hongo ingresa en el hospedero lo parasita y adquiere la forma de levadura. Histoplasmosis: Causada por Histoplasma capsulatum Paracoccidioidomicosis: Causada por Paracoccidioides brasiliensis Coccidioidomicosis: Causada por Coccidioides inmitis Blastomicosis: Causada por Blastomyces dermatitidis Estos agentes causan infección cuando se ponen en contacto con el humano en concentraciones importantes. La mayoría de veces se adquieren por inhalación y el pulmón es el órgano diana, aunque se pueden ver afectados otros órganos, evidenciándose además del compromiso pulmonar, manifestaciones a nivel cutáneo y distintas formas clínicas dependiendo del estado inmune del paciente. Histoplasmosis: Infección micótica intracelular del sistema reticuloendotelial. El 95% de los casos pueden ser inaparentes o subclínicos y el 5% progresan a una forma crónica, que causa enfermedad pulmonar o sistémica, la cual puede llegar a ser fatal. Es causada por Histoplasma capsulatum, un hongo dimórfico. Este hongo es de distribución mundial, pero se encuentra con mayor frecuencia en Estados Unidos, Centro y Sur América. El diagnostico se realiza por la observación de las levaduras del hongo al interior de los macrófagos en el tejido afectado (fase levaduriforme), empleando coloraciones histológicas con hematoxilina-eosina. También se utiliza el cultivo a 37º para la identificación de levaduras y a 25 °C para la identificación del micelio. Adicionalmente, se usan métodos serológicos como la fijación de complemento, la doble inmunodifusión y el ELISA. Los anticuerpos pueden ser detectados 2 a 5 semanas después de la infección. El uso en conjunto de la fijación de complemento y la imnunodifusión puede detectar el 85% de las formas activas de la histoplasmosis. La prueba de ELISA al igual que la de fijación de complemento son semicuantitativas y son de gran valor en el seguimiento del paciente. Paracoccidioidomicosis: Enfermedad granumolmatosa crónica que produce afección pulmonar primaria, algunas veces inaparente y que se disemina para formar ulceras a nivel bucal, nasal y ocasionalmente gastrointestinal. La enfermedad esta restringida a zonas de América Latina desde México hasta Argentina. Es causada por el hongo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. El diagnóstico se realiza por examen directo con KOH de secreciones pulmonares, de mucosas, etc., en donde se observa la fase levaduriforme, evidenciando la presencia de levaduras de gran tamaño, con gemación múltiple. El cultivo del microorganismo se hace a 25 y 37 ºC. Adicionalmente, existen métodos serológicos como la fijación de complemento y doble inmunodifusión para su diagnostico. Estos métodos permiten detectar hasta el 90% de los pacientes con formas activas. Sin embargo, otras pruebas como inmunofluorescencia indirecta y el ELISA, ofrecen resultados un poco más rápidos que las pruebas tradicionales, como la fijación de complemento. Adicionalmente se están empleando técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar el ADN del hongo. Coccidioidomicosis: Infección respiratoria que se resuelve rápidamente dejando una fuerte inmunidad especifica contra reinfección. Sin embargo, en algunos individuos la enfermedad progresar a enfermedad pulmonar crónica o a micosis sistémica que compromete meninges, huesos, articulaciones y tejido cutáneo y subcutáneo. Es una enfermedad endémica en el suroeste de Estados Unidos y noreste de México. El agente etiológico es Coccidioides immitis, un hongo dimórfico. El diagnóstico se realiza por examen directo de secreciones respiratorias (esputo o lavado broncoalveolar) en donde se observan estructuras del hongo conocidas como esferulas con endosporas. El cultivo del microorganismo también es empleado en el diagnóstico. El examen directo se puede realizar con KOH o con coloraciones como Grocott entre otras. El hongo se puede recuperar del tejido en cultivo a 37 ºC, aunque es difícil de hacer. El cultivo a 25 ºC da como resultado la recuperación de la fase micelial donde se observan artroconidias características. Adicionalmente, existen métodos serológicos como la fijación de complemento y doble inmunodifusión, los cuales son de utilidad para la orientación diagnostica de formas pulmonares y meníngeas. Es importante tener en cuenta que en las reacciones serológicas pueden darse reacciones cruzadas con Histoplasma y Blastomyces. Blastomicosis: Enfermedad granulomatosa crónica y supurativa, con un estado pulmonar primario que frecuentemente continua con diseminación a piel o huesos. La enfermedad se creía restringida a Norte América, pero sin embargo se han diagnosticado casos autóctonos en África, Asia y Europa. Es causada por Blastomyces dermatitidis, un hongo dimórfico. El diagnostico se realiza por examen directo de secreciones broncopulmonares o de pus de las lesiones, en donde se observan levaduras con pared gruesa, gemación unipolar que están unidas a la célula madre por un amplio pedículo. El cultivo del microorganismo a 25 °C, muestra un micelio fino, hialino, con conidias únicas, globosas de pared lisa, las cuales pueden nacer directamente de la hifa. Adicionalmente existen métodos serológicos como la doble inmunodifusión, el cual posee una sensibilidad en algunos casos del 80%; el ELISA que es altamente sensible, pero presenta un gran número de falsos negativos y la fijación de complemento que es poco sensible y especifica. Existe otras pruebas que han cobrado gran importancia, como la quimioluminiscencia para detectar el ADN fúngico. Se considera que el diagnostico serológico en esta entidad es menos importante, comparado con la utilidad que ofrece en los casos de histoplasmosis o la coccidioidomicosis. V. Micosis sistémicas oportunistas Se presentan en circunstancias de inmunodeficiencia por cualquier causa. Candidiasis Criptococosis Mucormicosis Aspergilosis Pneumocistosis Candidiasis: Entidad clínica causada por levaduras del género Candida, del cual se conocen 154 especies, 12 de ellas causantes de infecciones oportunistas en el hombre. La infección es generalmente endógena, debido a que estas levaduras pueden ser aisladas como flora normal. La candidiasis se puede manifestar a nivel de piel y faneras, superficies mucosas del tracto digestivo y mucosa vaginal. Adicionalmente, en casos de micosis invasivas, pueden afectar diversos órganos. Actualmente ha crecido el interés en estudiar este género como causante de patologías en cavidad oral como periodontitis apical, entre otras. El diagnostico de estas patologías se realizan de acuerdo con los hallazgos clínicos, el examen directo y el cultivo e identificación de la especie implicada. Adicionalmente existen pruebas para detección de antígenos, pero son poco sensibles. Se han desarrollado técnicas moleculares para diagnósticos de micosis invasivas, en los casos en los que las levaduras presentes en la muestra sean escasas o para diagnósticos rápidos como la PCR. La identificación de levaduras aisladas mediante cultivo puede ser realizada por patrones de asimilación de azucares, evaluación de actividad enzimática y producción de clamidosporas y pseudomicelio (unión de levaduras, que se alargan y parecen hifas verdaderas) y formación de micelio verdadero (tubo germinal). Las especies aisladas con mayor frecuencia en clínica son: C. parapsilosis, C. albicans, C. krusei, C. guillermondii, C.glabrata, C. lusitaniae, C. dublinensis, C. novergensis, C. rugosa y C. famata, C. Tropicales, entre otras. En las tinciones con PAS se puede observar la invasión de vasos sanguíneos por especies de Candida o blastoconidias e hifas ramificadas. Criptococosis: Infección crónica, subaguda o aguda que afecta pulmón y se torna sistémica afectando meninges o incluso otros sitios como huesos, piel y otros órganos. La enfermedad primaria pulmonar es generalmente subclínica y se diagnostica con mayor frecuencia cuando afecta meninges. El agente etiológico es Cryptococcus neoformans. Esta levadura puede ser identificada a partir de muestras clínicas por el examen del material con tinta china (observación de cápsula característica para este genero de levaduras) y el cultivo e identificación. Adicionalmente pueden ser detectados antígenos del hongo en muestras de suero y liquido celaforraquido mediante la prueba de aglutinación con partículas de látex. Actualmente se reconocen tres variedades para este hongo: variedad neoformans (serotipo D), grubii (serotipo A) y gattii (serotipos B y C). Estas variedades pueden identificarse mediante pruebas de laboratorio y cada una de estas tiene características epidemiológicas, geográficas y de virulencia específicas, por lo cual es importante realizar la identificación hasta variedad. Mucormicosis: Infecciones causada por hongos saprofitos ambientales que usualmente afectan a pacientes inmunocomprometidos. La micosis es frecuentemente aguada y fatal. La enfermedad puede tener compromiso orbital, rinocerebral, pulmonar, gastrointestinal y a nivel de piel y tejido subcutaneo, siendo muy frecuente la diseminación. Esta enfermedad es causada por especies de los géneros Mucor, Rhizopus y Absidia, entre otros, el diagnostico se realiza por la observación en el examen de biopsias de hifas no septadas anchas que forman ángulos rectos. Actualmente se desarrollan pruebas de biología molecular para ser empleadas en el diagnostico. Aspergilosis: Las enfermedades causadas por este género incluyen enfermedades alérgicas, colonización de cavidades con invasión de tejidos que producen respuesta inflamatoria y necrotizante e infecciones sistémicas fatales. Actualmente ha cobrado gran importancia especialmente en pacientes con cáncer, SIDA y otros estados inmunosupresores. Las principales especies implicadas son Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus y Aspergillus níger, entre otros. El diagnóstico se puede realizar a través del examen directo con KOH o con coloraciones histológicas de tejido en donde se observan hifas septadas dicotomas en forma de V. También se emplea como método diagnóstico el cultivo e identificación de la especie implicada. Las pruebas serológicas son también utilizadas en el diagnóstico de estas micosis, aunque su sensibilidad es discutida. La inmunodifusión se utiliza para detección de anticuerpos y la aglutinación con partículas de látex para la identificación de antígenos. Por otra lado, las técnicas moleculares están avanzando pero su uso esta limitado por falta de especificidad. Pneumocistosis Entidad causada por Pneumocystis carinii, microorganismo que hasta hace poco era considerado protozoario. Actualmente y con el uso de pruebas moleculares, se sabe que Pneumocystis carinii es un hongo que tiene estrecha relación con el Phylum Ascomycota. Este hongo está distribuido ampliamente en las especies de mamíferos y la enfermedad en humanos está relacionada con diferentes estados de inmunosupresión. Antes de la utilización de la terapia antiretroviral en SIDA, la pneumocistosis era la primera causa de muerte en estos pacientes. El diagnóstico se hace a través de examen directo de muestras de lavado broncoalveolar, biopsia pulmonar o esputo. La tinción de Giemsa permite visualizar las formas de “trofozoítos”, estructuras de 2 a 6 µm de diámetro, de bordes irregulares y núcleo simple. Con las tinciones de azul de toluidina, plata de metenamina o calcofluor, se pueden apreciar los “quistes” o supuesto estado sexual, los cuales son grandes y contienen 4 a 8 núcleos. En esta entidad, el cultivo nunca se usa como herramienta diagnóstica por las dificultades que hay para el mantenimiento de organismos viables. La serología es de utilidad epidemiológica y se emplean anticuerpos monoclonales específicos en examen directo como prueba diagnóstica. PROCEDIMIENTO 1. Observe las preparaciones que encuentra en su mesa de laboratorio. Nota: Las preparaciones en láminas corresponden a material obtenido de cultivo, el cual fue preparado con azul de lactofenol. Se deben observar en microscopio con aumento de 40X. I. Micosis superficiales Dermatofitosis: Dibuje la morfología microscópica y describa la morfología macroscópica de los siguientes hongos dermatofitos causantes de infecciones micóticas superficiales. 1. Trichophyton rubrum 2. Trichophyton mentagrophytes 3. Microsporum gypseum 4. Epidemophyton floccosum Dermatomicosis Dibuje la morfología microscópica y describa la morfología macroscópica de los siguientes hongos causantes de dermatomicosis. 1. Fusarium 2. Scopolariopsis breveucalis 3. Penicillium II. Micosis subcutáneas Observe y dibuje las estructuras microscópicas y describa la morfología macroscópica de los cultivos. 1. Esporotricosis: Sporothrix shenckii 2. Cromoblastomicosis: Phialophora verrucosa 3. Cladosporium carrionii III. Micosis sistémicas Observe y dibuje las estructuras microscópicas y describa la morfología macroscópica de los cultivos. 1. Paracoccidioidomicosis: Paracoccidioides brasiliensis. IV. Micosis oportunistas Observe y dibuje las estructuras microscópicas y describa la morfología macroscópica de los cultivos. 1. Candidiasis: Candida. 2. Criptococosis: Cryptococcus neoformans. 3. Mucormicosis: Rhizopus sp. 4. Aspergilosis: Aspergillus fumigatus. Observe el flujograma utilizado en la diferenciación entre Candida spp. y Cryptococcus spp. EJERCICIO 1. Que es micosis? 2. Cuál es la clasificación de las micosis según el grado de profundidad de las lesiones? 3. Nombre tres dermatofitos y la enfermedad con que se encuentren relacionados