Cuantificacion de pigmentos fotosinteticos 2016

UNIVERSIDAD NACIONAL DE RÍO CUARTO
Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales
Guía de Trabajos Prácticos Nº 6 - AÑO 2016
CUANTIFICACIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS: CLOROFILAS Y
CAROTENOIDES
La energía que posibilita la vida de la mayoría de los seres vivos procede directa o
indirectamente del sol, a través del proceso de fotosíntesis. En las plantas es posible
dividir el proceso de fotosíntesis en etapas: (1) la absorción de luz, (2) el transporte de
electrones que lleva a la reducción de NADP+ a NADPH, (3) la generación de ATP, y (4)
la conversión de CO2 en hidratos de carbono (fijación de carbono). Estas etapas están
estrechamente acopladas y controladas con el fin de producir los hidratos de carbono
requeridos por las plantas.
En el paso inicial de la fotosíntesis -la absorción de luz- los pigmentos fotosintéticos
presentes en los cloroplastos son los responsables de captar la energía de la radiación
fotosintéticamente activa (PAR) que incide sobre la hoja. Estos pigmentos fotosintéticos
están estrechamente asociados a proteínas, ubicándose en la bicapa lipídica de los
tilacoides de los cloroplastos. Según el modelo admitido actualmente, estos complejos
proteína-pigmentos se encuentran empaquetados formando unidades funcionales
denominadas fotosistemas. En las plantas, cada fotosistema contiene entre 200 a 400
moléculas de pigmentos -clorofilas y carotenoides- que tienen por finalidad captar la luz,
formando el llamado complejo antena. Los pigmentos de la antena son los encargados de
absorber la energía lumínica y transferirla por resonancia al centro de reacción. Al recibir
esta energía los pigmentos del centro de reacción pierden un electrón, el cual es transferido
a una serie de transportadores de electrones. Los datos actuales indican que hay dos tipos
de fotosistemas: I (P680) y II (P700). Éstos se diferencian en sus proporciones de
clorofila a y b, en las características de sus centros de reacción y en los transportadores de
electrones que los acompañan.
Las clorofilas son pigmentos fotosintéticos cuya estructura está constituida por un
anillo tetrapirrol que contiene un ión Mg2+ al cual se encuentra unida una cadena
hidrocarbonada: el fitol. Las clorofilas presentan máximos de absorción próximos a los 400
y 600 nm. El principal pigmento implicado en la fotosíntesis es la clorofila a, estando
presente tanto en antenas como centros de reacción. Además de clorofila a, las antenas
contienen otros pigmentos que absorben la luz: la clorofila b en las plantas vasculares, y
los carotenoides en plantas y bacterias fotosintéticas. Los carotenoides que participan en la
fotosíntesis son de dos tipos: carotenos y xantófilas, mostrando su espectro de absorción
máximo entre los 450 nm y 500 nm. Además, los carotenoides tienen una función
protectora, ya que absorben los excesos de energía que podrían dar lugar a la formación de
compuestos nocivos.
Objetivo
Estudiar comparativamente el contenido de clorofila a, b, totales y carotenoides en plantas
crecidas en condiciones de luz y oscuridad.
Materiales
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Plántulas de poroto crecidas en luz y oscuridad
Tubos Falcon de 50 ml
Morteros
Espátulas
Probetas de 25 ml y 10 ml
Pipetas Pasteur de vidrio
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Guantes
Acetona 80%
Hidróxido de sodio 1M
Éter sulfúrico
Espectrofotómetro
Centrifuga
Metodología
La extracción de pigmentos fotosintéticos se llevará a cabo en hojas de plántulas de poroto
crecidas en luz y oscuridad.
Extracción de clorofilas
- Homogeneizar 100 mg de peso fresco de hojas de plántulas crecidas en luz y oscuridad
con nitrógeno líquido en mortero.
- Pasar el extracto a un mortero limpio y morterear con 10 ml de acetona 80%. Transvasar
a tubo Falcon. Dejar reposar 1 hora en heladera.
- Retirar de la heladera y agitar en vórtex durante 30 seg. Centrifugar 5 min a 8000 rpm.
- Pasar el sobrenadante a un tubo Falcon limpio empleando para ello una pipeta Pasteur de
vidrio. Leer la absorbancia en espectrofotómetro a 650 y 665 nm (clorofila a y b
respectivamente). Calibrar previamente el equipo con un blanco de acetona 80% cada vez
que se cambia la longitud de onda.
Extracción de carotenoides
- Al volumen total de la extracción anterior contenido en tubo Falcon agregar 5 ml de
NaOH 1M para saponificar. Agitar en vórtex durante 30 seg.
- Adicionar 15 ml de éter sulfúrico.
- Particionar agitando en vórtex durante 30 seg.
- Dar un spin de 1 min a 8000 rpm. Se formarán dos fases: una acuosa (parte inferior del
tubo) y una orgánica (fase superior del tubo).
- Descartar la fase acuosa (acetona) y transvasar la fracción etérea (superior) a un tubo
Falcon limpio empleando pipeta Pasteur de vidrio.
- Leer en espectrofotómetro a 450 nm (determinación de carotenoides). Calibrar
previamente el equipo con éter sulfúrico.
- Aplicar las fórmulas de Vernon y Mac Kinney para calcular la concentración de
clorofila a, b, totales y carotenoides, como sigue:
Nota: En negrita se indican los factores de corrección.
Clorofila a:
Ejemplo:
Clorofila b:
Ejemplo:
11,63 (Abs 665) - 2,39 (Abs 650)
(11,63 x 1,3) - (2,39 x 1,1) = 12,49 g/ml.
Por regla de tres simple referimos este valor a 1 g de peso fresco (PF):
100 mg peso fresco ----------- 12,49 g
1000 mg peso fresco ------- X = 124,9 g /g PF
20,11 (Abs 650) - 5,18 (Abs 665)
(20,11 x 1,1) - (5,18 x 1,3)= 15,38 g /ml
1000 mg peso fresco ------- 153,8 g /g PF
Clorofilas totales:
Ejemplo:
6,45 (Abs 665) + 17,72 (Abs 650)
(6,45 x 1,3) + (17,72 x 1,1) = 27,87 g /ml
1000 mg peso fresco --------- 278,7 g /g PF
Carotenoides:
Ejemplo:
Abs 450 x Vol x (10/2500) = 0,65 x 15 x 0,004
0,039 mg = 39 μg
100 mg -------------- 39 g
1000 mg ------------ 390 g /g PF
* Confeccionar un gráfico de barras para cada pigmento (clorofila a, b, clorofilas totales y
carotenoides) teniendo en cuenta la planta crecida en condiciones de luz o oscuridad.