FORMATO DEL RESUMEN EXPANDIDO

CARACTERIZACIÓN DE LA VÍA DE TRANSPORTE DE PROTEÍNAS DE
RESERVA DE GIRASOL
Molina, MI1, Otegui, M2, Petruccelli, S1
1
CIDCA- Fac.Cs Exactas- UNLP 2 Dep. Botany- Univ. Wisconsin-Madison.
Las proteínas de reserva de semillas se acumulan en un compartimiento especial que no
tiene equivalente en mamíferos y levaduras denominado vacuolas de reserva (PSV). El
estudio de la vía de transporte de proteínas a este compartimiento es de suma
importancia tanto por el rol que tienen estas proteínas en la alimentación humana y
animal como por la posibilidad de acumular en el mismo proteínas de interés en
diagnóstico o terapéutica. La vía de transporte a PSV ha sido bien estudiada únicamente
en arveja y en zapallo. En arvejas las proteínas de reserva son transportadas en vesículas
denominadas
densas
(DV) que se originan en
el cis-Golgi y que no
poseen el receptor de
direccionamiento
vacuolar (VSR) BP-80.
En este sistema este
receptor
intervendría
únicamente
en
el
transporte a vacuolas
líticas (LV) (1). En
cambio en zapallo las
proteínas de reserva son
transportadas
en
vesículas que acumulan
precursores
de
proteínas de reserva
(PAC) cuyo origen es el
retículo endoplásmico
(ER) y que poseen el
homólogo del VSR de
arveja
denominado
VP72 (2). Esta familia
de VSRs ha sido
involucrada en un gran
número de procesos y no está claro su rol en el transporte de proteínas de reservas. El
objetivo del presente trabajo fue determinar el origen de la vía de transporte de proteínas
de reserva de girasol e identificar componentes de la maquinaria de transporte. Como
material de partida se utilizaron semillas inmaduras de Helianthus annuus L, cultivar
TC 3003 que fueron fraccionadas empleando dos métodos (2-3), siguiendo el esquema
mostrado en la Figura 1A. Las fracciones obtenidas por estos métodos fueron
analizadas por Western Blot empleando sueros policlonales anti-11S, anti -TIP
(marcador de PSV), anti -TIP (marcador de vacuolas vegetativas), anti- BiP
(chaperonina, marcador del ER), anti- AtELP1 (VSR de arabidopsis), anti-VP72 (VSR
de zapallo), anti-BP-80 (VSR de arveja). Además se realizaron microscopías
electrónicas de las semillas inmaduras. En primer lugar se determinó el estadío
reproductivo más adecuado para este estudio a través del análisis de la presencia
precursores de proteínas de reserva por Western Blot en semillas con distinto grado de
desarrollo, observándose una mayor acumulación en los estadíos reproductivos I2 e
I3. En consecuencia, estos estadíos fueron utilizados para aislar las vesículas
transportadoras empleando gradientes de Percoll (PAC) y de sacarosa (DV, Figura
1A). El análisis de las fracciones obtenidas muestra la presencia de precursores de
proteínas 11S, y proteínas típicas de vacuolas de reserva -TIP y -TIP (Figura 1B). La
fracción PAC posee BiP en forma similar a lo que ha sido informado para zapallo (2)
que podría atribuirse a la asociación de BiP a proteínas mal plegadas. La fracción DV
carece de BiP. En el estadío I3 empieza a observarse procesamiento de proteínas (TIP). El análisis de la reactividad de estas fracciones con los sueros que reconocen
VSRs, muestra la presencia de dos proteínas que reaccionan con a-VP72.
La reactividad con BP-80
aparece sólo en DV1 y DV2, lo
que es distinto a lo informado en
fraccionamientos de DV de
arveja (3). El suero anti-At-ELP,
a diferencia del anti-VP-72, sólo
reconoce una proteína y su
reactividad con la fracción PAC
es distinta que la que presenta aBP-80. Estos resultados indican
la presencia de dos VSRs en las
vesículas transportadoras de
precursores de proteínas de
reserva de girasol que muestran
homología con los receptores de
zapallo y Arabidopsis.
Por
microscopía
electrónica
se
analizó el origen de la vía
transportadora. Los agregados
electrodensos, que forman las
proteínas de reserva, empiezan a
observarse en el ER (figura 2A).
Las proteínas de reserva sufren una agregación aún mayor al llegar al Golgi donde se
observa la formación de un gran número de agregados (figura 2B) y desprendimiento de
DV. Las DV de girasol están cubiertas por los VSRs de girasol homólogos a VP72 de
zapallo (figura 2C). Estas vesículas dan origen cuerpos multivesiculares (MVB) que
poseen una zona electrodensa, que es reactiva con los sueros anti-11S (Figura 2D), y
que en su membrana poseen los VSRs de girasol (Figura 2E). Teniendo en cuenta el
tamaño de MVB, presencia de VSRs y proteínas parcialmente procesadas, los mismos
podrían corresponder a la fracción aislada con percoll. Los resultados mostrados indican
que la vía transportadora de precursores de proteínas de reserva de girasol se inicia en el
aparato de Golgi siendo los precursores transportados en vesículas densas que contienen
homólogos del receptor de direccionamiento vacuolar de zapallo VP72
Bibliografía
1- Hillmer, S., Movafeghi, A., Robinson, D. G. Hinz, G. (2001) J Cell Biol, 152, 41-50.
2- Hara-Nishimura, I., Shimada, T., Hatano, K., Takeuchi, Y. Nishimura, M. (1998) The
Plant Cell, 10, 825-1.
3- Hinz, G., Hillmer, S., Bäumer, M., Hohl, I. (1999) The Plant Cell, 11, 1509-1524.