Microorganismos ruminales nativos: búsqueda de probióticos con potencial aplicación productiva Mag. Martín Fraga Departamento de Microbiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable PARA RECORDAR Clasificación de los microorganismos 5 reinos (Whittaker, 1969) 3 dominios (Woese, 1970) Monera Protista Hongos Animales Plantas procariotas eucariotas Bacteria procariotas Archaea Eucarya eucariotas EN EL RUMEN • Eucariotas • Procariotas – Arqueobacterias – Bacterias Condiciones • Características de cultivo continuo • “Gran fermentador estable” – Ambiente reducido, anaerobio – Temperatura – pH – Fase gaseosa compuesta de CO2, Metano y Nitrógeno Qué papel juega la microbiota nativa en los rumiantes •Herbívoros (Pasturas y forrajes) • No pueden degradar los enlaces β 1-4 de la celulosa, componente mayoritario de la fibra vegetal, mayor reservorio de C del planeta • La microbiota simbionte es capaz de realizar la fermentación de la fibra •Importancia productiva Carne Leche Derivados Tracto digestivo de los rumiantes El Rumen Intestino Rumen Omaso Retículo • Más de 100 L en un bovino adulto • Temperatura constante, 39ºC Abomaso • pH neutro • Anaerobio Fuente de energía Rumen Fibra Epitelio ruminal 70 60 50 40 Bacterias 30 20 Ácidos Acético Propiónico Butírico 10 Ácidos grasos + Biomasa microbiana Abomaso 0 Ácidos acético, propiónico y butírico representan el 95% del total de AGV en el rumen Pérdidas de energía y carbono como Metano, Dióxido de carbono e Hidrógeno molecular Proteína de buena calidad Van Soest 1994 Microbiota ruminal – Arqueas – Bacterias – Protozoarios – Hongos Microbiota bacteriana fibrolítica • Confiere al rumiante la capacidad de sobrevivir a • • base de forrajes fibrosos Ventaja evolutiva Sensibles a los cambios de pH Microbiota bacteriana asociada a la fibrólisis Ruminococcus albus Ruminococcus flavefaciens Fibrobacter succinogenes Butyrivibrio fibrisolvens Eubacterium celulosolvens Prevotella spp. Pseudobutyrivibrio spp. (Hungate 1950, Montomery et al. 1988, Stewart et al. 1988, Schoep 2004, Shinkai et al. 2010) Microbiota ruminal: modulación •Aumentar el rendimiento productivo •Prevenir trastornos digestivos en rumiantes •Aumentar la degradación de la fibra •Aumentar la producción de AGV •Disminuir la producción de metano y otros gases •Controlar la concentración de lactato y el pH ruminal (Calsamiglia et al. 2005) Probióticos • Cultivo vivo de microorganismos que al administrarse en cantidades suficientes confieren beneficios al huésped • Características -Permanencia -Producción de antimicrobianos -Ser seguros -Nativos (FAO/WHO 2001) Desarrollo de una estrategia de selección de probióticos ruminales para modular la fermentación ruminal Aislamiento de microorganismos Selección de cepas Crecimiento Identidad Campo Exp. Nº2, Libertad. Facultad de Veterinaria Efecto antimicrobiano Ensayos en fermentadores in vitro Ensayos in vivo Ambiente ruminal (AGV ,NH3, pH) Microbiota Metano Digestibiidad Cinética de producción de gas AGV Microbiota Metano Aislamiento, caracterización e identificación de cepas bacterianas nativas Pseudobutyrivibrio Pseudobutyrivibrio ruminis Prevotella bryantii Oribacterium Butyrivibrio hungatei Butyrivibrio fibrisolvens Eubacterium cellulosolvens Selenomas ruminantium Succinivibrio dextrinosolvens Butyrivibrio Oribacterium sp. Lachnospiraceae •Todos organismos anaerobios y asociados al rumen Fraga et al. 2013 Efecto antimicrobiano Cultivo “spot” de la cepa Anaeróbico 24-48 h, 39ºC Agregado de medio de cultivo inoculado con E. coli o S. bovis Observación de la inhibición 24 h, 37ºC E. coli 2% Sin efecto 61% S. bovis 26% Ambos indicadores 11% Experimentos en fermentadores in vitro 39ºC, 96h sustrato + saliva artificial 4ºC, 18h Fluido ruminal fresco Cepa a ensayar (106 cél/mL) •Cinética de producción de gas •pH •AGV •Análisis de microbiota •CH4 Cinética de fermentación con distintos sustratos Celulosa microcristalina 80 Volumen acumulado (mL/g) 90 3C20C 70 4C50C 60 4C55C 50 4C60C 40 3F21C 3F22C 30 4C62C 20 4C50c+4C62C 10 Control 0 0 20 40 60 80 80 3C20C 70 4C50C 60 4C55C 50 4C60C 40 3F21C 30 3F22C 20 4C62C 10 450C+4C62C Control 0 0 100 20 40 60 80 100 Tiempo (h) Tiempo (h) Xilano de avena 100 Volumen acumulado (mL/g) Volumen acumulado (mL/g) Paja de trigo 90 3C20C 80 4C50C 70 4C55C 60 4C60C 50 40 3F21C 30 3F22C 20 4C62C 10 450C+4C62C 0 Control 0 20 40 60 Tiempo (h) 80 100 Ajuste a modelos matemáticos Modelo logístico bicompartimental Vol= Vfr 2+4kdr( L−T ) 1+e + Vfl 1+e2+4kdl( L−T ) Vfr: Volumen de gas producido en la fase rápida Vfl: Volumen de gas producido en la fase lenta Kdr, Kdl: tasas de fermentación L: Fase Lag Vt: Vfr+Vfl Parámetros de fermentación Vfr (mL/g) Kdr (h-1) Vfl (mL/g) Kdl (h-1) L (h) Vt (mL/g) Control 34,17ab 1,48 16,49a 27,85b 0,020a 62,03b 3C20C 39,15a 0,18 15,10a 34,76b 0,022a 37,45b 4C50C 33,14ab 0,11 13,37a 31,90b 0,020a 65,04b 4C55C 30,28ab 0,13 13,17a 25,16b 0,017a 55,43b 4C60C 28,09b 0,09 8,83b 26,36b 0,015ab 54,45b 3F21C 31,58ab 0,07 9,94b 26,83b 0,011ab 58,41b 3F22C 32,02ab 0,10 12,49a 29,36b 0,011ab 61,38b 1,76 0,58 1,05 4,63 0,002 8,91 0,0211 0,0126 0,001 0,0002 0,0017 0,0098 ESM P AGV: Paja de trigo Paja de trigo C on cen tración de AG V totales (m M) 100 a Acético Butírico Propiónico Control 41,2ab 0,2c 13,9a 90 A/P 5,80ab 80 2,97bc 3C20 20C C 44,1a 16,6a 15,1a 5,83ab 4C50 50C C 44,3a 16,2a 15,0a 5,49bc 4C55 55C C 30,6c 8,0b 9,2b 5,87ab 4C60 60C C 32,6bc 11,9ab 9,6b 3F21 21C C 43,9a 16,9a 14,7a 5,88ab 50 3,40ab 5,82ab 40 2,98bc 3F22 22C C 41,8ab 13,3ab 12,0ab 5,88ab 30 3,49a 4C62 62C C 35,9abc 11,6ab 12,1ab 4C50 50C+ C+4 4C62 62C C 35,5abc 11,3ab 12,0ab 1,87 1,12 0,61 5,92a 20 2,99bc 5,37c 2,95bc 10 0,0004 <0,0001 <0,0001 ESM P a a Paja de trigo pH 0,08 60 bc 2,94bc 3,33abc 0,09 0,0009 0 0,0011 C ontrol 4C 55C 3F22C C on cen tración de AG V totales (m M) 70 2,92c abc 100 a 90 a a abc abc abc 80 70 abc abc abc bc c c 60 50 40 30 20 10 0 C ontrol 4C 55C 3F22C 3C 20C 4C 60C 4C 62C 3C 20C 4C 60C 4C 62C 4C 50C 3F21C 4C 50C +4C 62C 4C 50C 3F21C 4C 50C +4C 62C abc Metano No se detectaron diferencias entre los distintos tratamientos ni en la concentración de metano ni en la cantidad de metanogenas (RT-PCR) Comunidad microbiana en los fermentadores 100% Se amplificó la región V1-V2 del ARN 16S y se realizó pirosecuenciación (454 Roche) 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 16Control 17 18 34 4C63C 35 36 523F21C 53 54 704C50C 71 72 884C56C 89 90 106 107 108 1244C58C 125 126 142 143 144 4C79CA 4C55C Cuatro cepas aumentaron la frecuencia de aparición de OTUs afiliados a bacteroidetes Aislmiento e identificación: Se conformó una colección de aislamientos nativos, anaerobios que se afiliaron a distintas especies asociadas al ambiente ruminal. In vitro: •La adición de cepas bacterianas en cantidades de entre 100 y 1000 veces menos al del contenido ruminal provoca cambios en: La cinética de fermentación disminuyendo el volumen total de gas y la colonización de la fibra Producción de ácidos grasos volátiles particularmente induciendo la formación de ácido butírico •No se afectó la producción de metano •Se modificó la comunidad bacteriana Administración in vivo Muestreo 19 días de a dapatacióna la dieta 8 AM Tratamiento cada 48h • 1010 células de P. ruminis 50C x5 • 1010 células de P. bryantii 3C5 x5 • Control x5 8 PM Dieta: fardo de alfalfa ad libitum y maíz (1% del peso metabólico) •Borregos canulados •Jaulas metabólicas •Condiciones controladas AGV, pH, Microbiota ruminal, NH3 Ambiente ruminal:AGV •No hubo diferencias en la concentración total de AGV Ambiente ruminal:AGV •Tratados con Prevotella tienen mayor concentración que el control •En ambos tratamientos la concentración de Ác butírico fue mayor que el control •El grupo tratado con P. ruminis 50C mostró concentraciones de ác propiónico inferiores al control Ambiente ruminal: pH La adminstración de Prevotella bryantii 3C5 induce una disminución de pH sin llegar a valores acodóticos Ambiente ruminal: Amoniáco control 60 50C 3C5 50 NH3(m g/dL) 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 T (h) Se registró una mayor concentración de NH3 en el grupo tratado con Prevotella bryantii 3C5. 20 Microbiota ruminal 100% 90% Se extrajo ADN total de muestras de fluido ruminal de todos lo animales y se amplificó la región V1-V2 del ARN 16S y se realizó pirosecuenciación (454 Roche) 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 1 Los animales tratados con Prevotella bryantii tuvieron una composición similar a la del control. Los animales tratados con Pseudobutyrivibrio ruminis presentaron una mayor abundancia del género Prevotella. P. 50C 5 ruminis 15 24 25 2 Control 8 7 13 17 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 4 18 19 P.Bryantii 20 3C5 26 2 7 8 Control 13 17 Síntesis •La adminstración de bacterias nativas en baja cantidad comparada con la carga microbiana del rumen genera cambios en el ambiente ruminal que pueden ser detectados •Estos cambios podrían ser explicados por la modulación de la microbiota ruminal •Se pudieron ver los mismos cambios tanto in vitro como in vivo lo que refuerza el modelo de screening in vitro • Departamento de Microbiología, IIBCE Pablo Zunino Sofía Fernández • Departamento de Nutrición, Facultad de Veterinaria Cecilia Cajarville MUCHAS GRACIAS