CRIOPRESERVACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS

Universidad de la República
Facultad de Veterinaria
Departamento de Reproducción Animal
Area de Biotecnología de la Reproducción
C. Larocca, A. Fernández, R. Aragunde, D. Ricaldoni, M. Crispo
Uruguay, 1999
INTRODUCCIÓN
La criopreservación, mal llamada congelación de embriones, es un
simple paso de la fase líquida a sólida que ha adquirido importancia por tres
motivos:
1-
El hecho de que no hay siempre disponibilidad de receptoras.
2-
La posibilidad de comercializar embriones congelados a grandes
distancias.
3-
La libre importación de embriones que se ha establecido en el
Uruguay.
Existen dos elementos importantes a tener en cuenta en el metabolismo del
embrión:
1) El embrión tiene un contenido de agua del 80%.
2) Su membrana semipermeable, permite que reaccione a las diferencias de
las concentraciones osmóticas en el medio que el embrión se encuentra.
Por ejemplo tenemos un blastocisto excelente y lo sometemos a un proceso de
congelación ultrarápido (de temperatura de laboratorio directamente a nitrógeno
líquido), debido al alto contenido de agua en su interior, hay cristalización y muerte de
la unidad embrionaria como tal.
Si lo sometemos a un proceso ultralento (con una disminución lenta de
temperatura hasta -40 o -50 ºC, también se produce muerte celular debido al llamado
EFECTO SOLUCION, cuando el embrión se congela lentamente en el medio
extracelular hay cristalización. El cristal de hielo se comporta como secuestro de agua,
en el medio extracelular aumenta la concentración del mismo y el embrión reacciona
perdiendo agua para equilibrar, como esta deshidratación es tan brusca, se produce la
muerte embrionaria.
Hay sustancias o agentes en la naturaleza, que tienen la propiedad de disminuir
(no eliminar), la acción deletérea del efecto solución cuando sometemos al embrión a
una disminución lenta de temperatura; son los llamados agentes crioprotectores.
Habitualmente los embriones congelados son descongelados y evaluados luego
de la remoción de la sustancia crioprotectora antes de ser transferidos. Debemos tener
en cuenta que para someter a los embriones a las diferentes técnicas de criopreservación
estos deben ser mórulas compactas o blastocistos de buena o excelente calidad (entre
los días 6 y 8).
Foto 1a: Mórula compacta calidad excelente.
Foto 1b: Blastocisto expandido de calidad buena.
En los últimos años se han desarrollado sistemas más simples que permiten la
transferencia directa de los embriones descongelados sin extraerlos de la pajuela en la
que han sido congelados, en forma similar al procedimiento de inseminación artificial
(Leibo 1984, 1986; Massip y Van der Zwalmen, 1984; Massip y col., 1987; Suzuki y
col.; 1990; Voelkel y Hu, 1992; Dochi y col. 1995).
Por otro lado, el método de vitrificación, aún en experimentación, permite la
preservación de los embriones a través de una extrema elevación de la viscosidad con
altas concentraciones de sustancias crioprotectoras que solidifican sin permitir la
formación de cristales de hielo intracelular.
Este método tiene la ventaja de que no es necesario utilizar congeladores
automáticos programables (Ishimori, H. Y col. 1992).
Se pueden esperar altas tasas de gestación cuando los embriones bovinos son
mantenidos a temperatura de laboratorio durante 12 a 18 horas antes de ser transferidos;
no así cuando los embriones son mantenidos a temperatura de laboratorio durante 4 a 6
horas antes de la congelación, debido a que luego de la descongelación las tasas de
sobrevivencia disminuyen notablemente. Si los embriones son recuperados para ser
sometidos a la criopreservación, estos tienen que ser procesados lo más temprano
posible posterior a la colección, o refrigerados hasta que sea posible congelarlos.
(Manual IETS, 1998)
AGENTES CRIO - PROTECTORES
Los agentes crioprotectores se dividen en:
A) Permeables: Glicerol - DMSO - Etilenglicol, son los más utilizados en
rumiantes. El glicerol y el DMSO deben ser removidos de los embriones antes de ser
transferidos (Jackowsky y col.,1980 ;Schneider y col,1983).
Széll y col. (1989) comunicaron que para embriones bovinos y ovinos el
etilenglicol tiene un coeficiente de permeabilidad mayor que el glicerol. Voelkel y Hu
(1992) encontraron que la viabilidad en cultivo luego de la descongelación fue mayor
para embriones congelados por etilenglicol 1,5M y rehidratados directamente en PBS
suplementado con albúmina sérica bovina, fracción V respecto a embriones congelados
con glicerol 1,4 M, y DMSO 1,5M.
Acción:
- Reducen el efecto solución.
- Reducen la cristalización intracelular.
Condiciones: para actuar deben permanecer en fase líquida cuando la
temperatura disminuye. No deben cristalizar cuando se
formen los primeros cristales de hielo en el medio
extracelular.
B) No permeables: Sucrosa (sacarosa), el más utilizado en rumiantes.
Modifican el balance osmótico del embrión. (Leibo,1984)
Condiciones: La concentración está en el rango de 0,5 a 2 M.
Son efectivos en congelación lenta controlada.
Son efectivos en la congelación rápida.
La utilización de agentes crioprotectores es una condición imprescindible para
el éxito de la técnica.
Otro factor clave es la deshidratación, la cual no es completa. En función de los
diferentes grados de deshidratación, se clasifican las técnicas de criopreservación:
1) Método Convencional
- Impide la cristalización extracelular mediante un proceso de enfriamiento
lento y controlado.
- Una vez que el embrión está parcialmente deshidratado se sumerge en N2
líquido.
Metodología:
Se realiza en varios pasos con distintas concentraciones de glicerol (G).
Protocolo:
CONGELACION
1- Adición a una solución de Dulbecco buffer modificado (PBS) de G a 1,36M,
durante 15 minutos a temperatura ambiente de laboratorio.
2- Aspiración de cada embrión en pajuelas de 0.25 ml (IMV; Francia). El
embrión está en la columna central de solución de PBS - G. La pajuela
tendrá tres columnas separadas por burbujas de aire, 2 solamente de
solución y la central con el embrión en la solución crioprotectora.
3- Se enfrían las pajuelas a –7ºC.
4- Inducción manual de cristales de hielo, en el medio extracelular (seeding,
tocando la pajuela con un forceps previamente enfriado en nitrógeno
líquido); esta operación se realiza a -7ºC, manteniendo las pajuelas 10
minutos a esa temperatura para permitir el equilibrio de las soluciones.
Foto2. Seeding
5- Se desciende la temperatura a una velocidad de 0,3ºC/min. hasta llegar a
–35 ºC.
6- Luego las pajuelas se sumergen directamente en N2 líquido.
Curva Programada de Congelación de Embriones
20ºC
Seeding
-7ºC
-0.3ºC/min. hasta –30ºC
-30ºC
-196ºC
10 minutos
92 minutos
Otra forma de congelar embriones es el método manual, que consiste en
procurar imitar la curva de descenso de temperatura mediante dispositivos manuales (no
automáticos).
Los métodos pueden basarse en el descenso de un dispositivo especial en la
boca del termo, o en el ascenso controlado de un recipiente con N2 líquido.
Foto 3.
Método manual de
congelación en boca de bióstato.
Foto 4. Sistema manual de congelación de embriones
DESCONGELACION
1) Se descongelan las pajuelas al aire a la temperatura de laboratorio, pero no menor
de 25ºC.
2) Se extrae el glicerol pipeteando con pipeta Pasteur afinada, los embriones en una
solución de PBS con Sucrosa 1M durante 15 minutos.
3) Se efectúan 3 lavados de los embriones en PBS más 10% de suero fetal bovino
(FCS,Gibco-Ontario, CANADA) con penicilina y estreptomicina (100.000 U.I.100mg respectivamente; SIGMA, USA).
4) Con un microscopio estereoscópico se realiza la evaluación y clasificación de los
embriones.
5) Se aspira cada embrión transferible en una pajuela en la columna central de
solución crioprotectora, separada de las otras por pequeñas burbujas de aire (3-4
mm) y se deja pronta para el implante.
6) Se realiza el implante no quirúrgico en hembras receptoras sincronizadas respecto
al estado de desarrollo del embrión.
2) Método de Leibo
Es un método de transferencia directa, similar al del etilenglicol.
A través de este método se evita toda técnica de manipulación del embrión en el
laboratorio. Su objetivo final es transferir la pajuela directamente después de su
descongelación.
Se realiza la extracción del glicerol dentro de la propia pajuela mezclando las
columnas mediante un pequeño golpe con los dedos en las burbujas de aire o
agitándolas, por lo tanto no se usa lupa y ponemos la pajuela directamente en la pistola
para implantar.
Tiene la desventaja de disminuir los porcentajes de gestación a un 30%, en
tanto que con el otro sistema es del 45 al 50%.
Ventajas:
- no utiliza lupa.
- transferencia similar a la inseminación artificial.
- practicable a condiciones de campo.
Técnica:
Se carga la pajuela con una gran columna de PBS - Sucrosa 1,08 M, luego una
pequeña columna de aire seguida de otra columna de con PBS - Glicerol con el embrión,
burbuja de aire y una pequeña de PBS - Glicerol 1,5 M.
Disposición de las columnas en método de Leibo
Tapón
PBS-Sucrosa 1.08
PBS-Glic.
PBS-Glic.
Cuando la pajuela está descongelada, la sacudimos para mezclar las columnas y
la ponemos boca abajo (tapón hacia abajo) para que el embrión descienda. Abajo queda
la sucrosa y arriba el glicerol, el embrión queda en contacto con PBS - Sucrosa y pierde
el glicerol que tiene en su interior. Se debe dejar 20 minutos para que se realice el
proceso.
La rehidratación se da directamente en el útero, que le aporta agua.
3) Método con Etilenglicol (EG)
La utilización del etilenglicol como crioprotector es una alternativa práctica.
Este posee un alto coeficiente de permeabilidad celular de tal forma que los embriones
después de descongelada la pajuela se implantan directamente, por tanto no existe la
expansión por sobrehidratación con posterior muerte embrionaria que se observa en el
caso del glicerol o del DMSO.
La posibilidad de estandarizar un método de criopreservación con una tasa
aceptable de gestación, que permita transferir los embriones congelados directamente a
las receptoras luego de la descongelación constituiría sin duda alguna en el método de
elección universal.
Protocolo
CONGELACION
1- Se coloca el embrión en una solución de PBS - EG1,5 M directamente con 10
minutos de equilibración a temperatura de laboratorio.
2- Incorporación de los embriones en pajuelas de 0,25 ml de manera que quede
una columna de PBS - EG separada de 2 columnas de PBS isotónico a través
de 2 pequeñas burbujas de aire.
Aire
Aire
PBS – Isotónico
Algodón
PBS - Isotónico
Embrión en PBS - EG
Sellado A.P.
3- Inmersión de las pajuelas directamente a – 7ºC utilizando un congelador de
embriones programable automática con metanol como medio refrigerante.
4- Inducción manual de cristales de hielo en el medio extracelular (seeding) a
-7ºC manteniendo 10 minutos a esa temperatura para permitir el equilibrio de
las soluciones.
5- Descenso de la temperatura a una velocidad de 0,3ºC/min hasta alcanzar los
– 30ºC.
6- Se equilibra 15 minutos.
7- Se sumerge la pajuela en N2 líquido.
DESCONGELACION
A) se descongela la pajuela a baño maría a 30ºC durante 20 segundos.
B) Se realiza la transferencia por el método no quirúrgico inmediatamente en
receptoras sincronizadas al estado del desarrollo del embrión a implantar.
No deben pasar más de 10 minutos entre la descongelación de la pajuela y el
implante en la receptora. El máximo es 20 minutos, debido a que el Etilenglicol es más
tóxico que el Glicerol. Son de destacar los resultados de nuestro laboratorio (Larocca y
col., 1997).
4) Método de Vitrificación
Es un método que todavía se encuentra en fase de investigación a pesar de que se
han reportado algunos resultados aceptables en la tasa de gestación en el bovino.
En nuestro laboratorio el Dr. Ignacio Lago logró en 1998 la primera gestación
con un embrión bovino obtenido in vivo y vitrificado - descongelado.
Este método tiene como ventajas:
-
la transferencia directa sin remoción del crioprotector así como la
vitrificación, han abierto grandes posibilidades de expansión de la
transferencia de embriones en condiciones de campo.
-
permite así mismo la utilización racional de las receptoras, independizando
el momento de la colecta de los embriones del momento de la
transferencia.
-
desarrollar un sistema de criopreservación alternativo, simple, de bajo
costo y aplicable en nuestras condiciones de campo, adquiere la mayor
importancia.
Expondremos algunos posibles protocolos de vitrificación (V):
PROTOCOLO 1
Se utilizará una solución de vitrificación (SV) que consiste en un 25% (v/v)
etilenglicol y 25% (v/v) de DMSO en mPBS, suplementada con 4 mg/ml de albúmina
sérica bovina (BSA),(Ishimori y col., 1992). Los embriones serán equilibrados en una
dilución al 5% de SV en mPBS durante 1 minuto y luego estarán en la solución SV en
una pajuela (un embrión por pajuela) por 30 segundos a temperatura ambiente (20 a 25
ºC).
Las pajuelas luego serán colocadas en vapores de N2 líquido, del lado del
algodón, durante dos minutos y después sumergidas en N2 líquido.
Para la descongelación en este método las pajuelas se colocarán en agua a 20ºC
por 20 segundos. Se cortarán los extremos de la pajuela y el embrión será colocado en
una caja de petri que contiene una solución de sucrosa 0,5M en PBS por 5 minutos.
Luego serán lavados al menos tres veces en PBS y serán transferidos a las receptoras
cuyos celos fueron sincronizados con el estado de desarrollo del embrión.
PROTOCOLO 2
Este método pretende combinar los beneficios de la vitrificación con los de la
transferencia directa.
La pajuela debe ser preparada previo a cargar el embrión:
Se carga con una columna de PBS y se congela colocando la pajuela en el
congelador programable con metanol a –25ºC. Luego 10 µl de la solución de
vitrificación, conteniendo el embrión, será inyectada con una pipeta de vidrio afinada en
el espacio que dejamos al final de la pajuela, el cual fue equilibrado en una dilución al
50% de la solución de vitrificación en PBS por uno a dos minutos., La pajuela se sella
con un tapón plástico y se enfría en vapor de N2 líquido otros 2 minutos y luego es
sumergida en N2 líquido.
Para la descongelación las pajuelas se pondrán en agua a 20ºC durante 15
segundos, luego se mantiene en forma vertical en aire durante 5 minutos con el tapón de
plástico hacia arriba permitiendo que se unan las soluciones. La pajuelas serán
transferidas directamente a las vacas receptoras.
PROTOCOLO 3
Se utilizan 3 soluciones (SV1, SV2 y SV3):
VS1
VS2
VS3
Glicerol
10%
10%
20%
Etilenglicol
10%
20%
PEG: Polietilenglicol M.W. = 8,000
Diluido en D-PBS
Sucrosa
0.1 M
0.2 M
0.3 M
Xylosa
0.1 M
0.2 M
0.3 M
PEG(w/v)
1%
2%
3%
Las manipulaciones se realizan a temperatura ambiente ( 20ºC). En la solución
SV1 los embriones se equilibran durante 5 minutos, 5 minutos en la SV2 y 1 minuto en la
SV3.
VS1
VS2
5 min.
VS3
N2L
5 min.
1 min.
Cargado de la pajuela: Antes de la equilibración la pajuela debe ser preparada con
una columna de 1cm de solución de sucrosa en solución de PBS separada por una pequeña
burbuja de aire de otra columna de 5 a 6 mm de la solución anterior, separada a su vez por
otra pequeña burbuja de aire de una columna de 5mm de la solución de vitrificación.
Aire
Algodón
Introducido 5
mm
Sucrosa 0,5 M
Aire
Sucrosa 0,5 M
VS3
Después de la equilibración del embrión, en la pajuela se aspira una columna de
10 a 15 mm de la SV3 conteniendo al embrión, la cual está separada por otra pequeña
burbuja de aire de 5mm de SV3, después se dejan 7mm de aire y se sella la pajuela al
calor.
Cargando al embrión:
Aire
7 mm
Embrión
Sucrosa 0,5 M
Sellado con
Algodón
calor
Introducido 5
mm
-
Sucrosa 0,5 M
VS3
VS3 Sellado con
calor
La pajuela se sumerge lentamente en N2 líquido del lado del algodón, cuando
se ve que la columna de sucrosa en PBS está congelada, se sumerge
íntegramente. Después se transfieren las pajuelas a N2 Líquido.
Este es el método de Osaito y Imai (NLBC, 1997).
DESCONGELACION
Los embriones vitrificados almacenados en N2 líquido se depositan en baño
maría a 20ºC durante 20 segundos.
Después que la columna con solución de sucrosa se descongeló, todo el
contenido de la pajuela es descargado en una caja de petri; de esta manera el embrión
queda automáticamente expuesto a la solución de sucrosa.
La dilución de los crioprotectores se realiza a temperatura de laboratorio (20 –
25ºC); en un primer paso se coloca el embrión en una solución de sucrosa 0,5M en PBS +
CS al 20% + Penicilina/estreptomicina ( SIGMA, USA), equilibrándose durante 5
minutos.
En una segunda etapa el embrión se deposita en una solución de sucrosa 0,25M
en PBS + CS al 20%.
Luego de esta operación el embrión es lavado 2 o 3 veces en PBS + CS al 10%,
se aspira en una pajuela y se transfiere a una receptora.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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