SEMINARIO Nº 2: ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS

ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS.
La absorción y emisión de energía radiante que realizan las moléculas y
los átomos constituye el fundamento de muchos procedimientos en Química
Analítica. Los datos obtenidos nos aportan información tanto cualitativa como
cuantitativa. Cualitativamente, porque las posiciones de las líneas o bandas de
emisión o absorción en el espectro electromagnético indican la presencia de
una sustancia determinada. Cuantitativamente porque midiendo las
intensidades de dichas líneas o bandas de emisión o de absorción puede
determinarse la concentración.
RELACIONES CUANTITATIVAS DE LA ABSORCIÓN. LEY DE BEER.
Los principios que rigen la absorción de la radiación se aplican a todas
las regiones del espectro electromagnético. La absorción se mide
determinando la disminución de potencia experimentada por un haz de
radiación como resultado de las interacciones con las especies absorbentes
situadas en la trayectoria de dicho haz.
La Ley de Beer establece que a una  dada, en la que pueda ocurrir
absorción, al aumentar la concentración de la disolución (c) de absorbente,
disminuirá la cantidad de luz transmitida:
A = kbc
Donde k (otras veces “a” ) es la llamada absortividad o coeficiente de
extinción. En el caso de emplear concentraciones molares (c, mol/L) la ley
sería:
A = bc
Donde  es el coeficiente de extinción molar ó la absortividad molar.
La constante k, a, ó , es una medida relativa de la intensidad de
absorción de un compuesto. Depende del disolvente, de la longitud de onda y
de las condiciones experimentales (pH, Tª, etc.), pero es independiente de c y
de b.
La relación entre la transmitancia (T) y la absorbancia (A) sería:
A = log 1/T
%T = T. 100
T = %T/100
A = log 1/%T/100 = 2 – log %T
Un espectro de absorción es una representación gráfica que relaciona
las características de absorción del analito con la  utilizada en su análisis. En
el eje de ordenadas se representa generalmente A, logA, T ó %T, mientras que
en el eje de abscisas se representan unidades de .
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Las curvas a, b, c y d de la siguiente figura representan concentraciones
cada vez mayores de una determinada muestra. La A, aumentará
evidentemente al aumentar la c (ó b), mientras que el %T disminuye.
En la figura se muestra también un ejemplo de una gráfica de la ley de
Beer: al representar A frente a las concentraciones a, b, c y d se encuentra una
función lineal, tal que predice la ley de beer. La pendiente de la recta será  sí b
= 1cm.
La ley de Beer se cumple igualmente para disoluciones que contienen
más de una especie absorbente, siempre que no se produzca interacción entre
dichas especies. Por tanto para un sistema multicomponente se cumplirá:
Atotal = A1 + A2 + ......... + An
Atotal = a1bc1 + a2bc2 + .......... + anbcn
Los subíndices se refieren a las especies absorbentes.
Limitaciones a la ley de Beer.
La relación lineal entre A y b para c = cte. ocurre generalmente en todos
los casos. Sin embargo, se observan frecuentemente desviaciones de la
proporcionalidad directa entre A y c para b=cte. Algunas de estas desviaciones
son importantes y representan limitaciones reales de la ley. Otras desviaciones
ocurren como consecuencia de la forma en que se realizan las medidas de
absorbancia ( desviaciones instrumentales), ó bien como consecuencia de
cambios químicos asociados con cambios de concentración (desviaciones
químicas).
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Reales
Limitaciones
Químicas
Aparentes*
Instrumentales
*Se llaman desviaciones o limitaciones aparentes porque reflejan dificultades
experimentales mas que alguna insuficiencia de la Ley de Beer por sí misma.
Limitaciones reales de la ley de Beer.
La ley de Beer es solamente aplicable a disoluciones en las cuales las
interacciones, dependientes de la concentración, entre moléculas o iones
absorbentes sean mínimas. Estas interacciones, que generalmente comienzan
a aparecer a concentraciones superiores a 0’01M, alteran las absortividades
molares, , y, por tanto, conducen a una relación no lineal entre A y c.
A
=cte a cualquier c< 0’01M
A cte
c>0’01M
tg=b
c<0’01M
c
c
También surgen desviaciones reales debido a que la  de una sustancia
depende del índice de refracción de la disolución, que a su vez es dependiente
de la concentración de analito, cuando las concentraciones son mayores de
0’01M.
Desviaciones químicas.
Se producen desviaciones aparentes de la Ley de Beer cuando las
especies absorbentes experimentan disociación, asociación o reacción con el
disolvente, originando productos con características absorbentes distintas de
las del analito. Estos efectos que producen una alteración del equilibrio químico
pueden ser debidos al pH, presencia de complejantes, reacciones laterales,
etc.
Desviaciones instrumentales.
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La ley de Beer es una ley límite en el sentido de que una linealidad
verdadera entre absorbancia y concentración requiere la utilización de
radiación monocromática (una sola  ). En la práctica, se producen
desviaciones significativas cuando se mide en una banda de absorción que no
se corresponde con el máximo de absorbancia en el espectro (ver figura). En
estas circunstancias se originan grandes cambios de absorbancia en función
de  y la  deja de ser constante produciéndose una curva en vez de una recta
al representar A en función de c.
fig.
También pueden darse desviaciones instrumentales debido a los efectos
de fatiga de los detectores, falta de linealidad de los amplificadores de señal,
inestabilidad de las fuentes de energía radiante etc. Sin embargo, con los
instrumentos modernos para espectrofotometría estos problemas se han
resuelto en gran parte.
Advertencia: Por muy moderno que sea un espectrofotómetro debemos de
verificar el equipo instrumental antes de suponer que se cumple la Ley de Beer
para un sistema químico determinado.
INSTRUMENTACIÓN.
Los instrumentos que miden la absorbancia o la transmitancia de una
disolución se componen de cinco elementos básicos:
1. Fuente estable de energía radiante.
2. Selector de longitudes de onda (para aislar una determinada región
de longitudes de onda de la fuente)
3. Cubetas transparentes para la muestra.
4. Detector de radiaciones o transductor para convertir la energía
radiante en eléctrica.
5. Dispositivo de lectura.
fig
4
La naturaleza y complejidad de un equipo de absorción depende de la
región de  implicada y de cual va a ser el uso principal del instrumento, sí para
medidas cualitativas o bien cuantitativas. Sin embargo la función de cada
componente es siempre la misma.
La primera etapa que debe realizarse siempre antes de cualquier medida
de absorbancia es el ajuste del medidor de señal. En primer lugar se ajusta el
cero de transmitancia bloqueando la radiación antes del detector con un
obturador o introduciendo una cubeta opaca (ajuste del 0 % de T). A
continuación se ajusta el indicador al 100% de T (o cero de absorbancia), este
ajuste se realiza con el disolvente o blanco en la trayectoria del haz incidente.
Para ello, se varía la intensidad de la fuente o bien se altera la amplificación de
señal del detector. Finalmente, la absorbancia o el %T se puede obtener
directamente sustituyendo el disolvente por la disolución que contiene en
analito.
Fotómetros y espectrofotómetros.
Los componentes descritos anteriormente se pueden combinar de
distintas maneras para fabricar docenas de instrumentos para realizar medidas
de absorción. El diseño de estos equipos varía desde los más sencillos a los
más sofisticados, existiendo notables diferencias en su precio. La selección de
un instrumento se debe hacer según el tipo de trabajo para el que va a ser
destinado.
Fotómetros: Un fotómetro es un instrumento sencillo y relativamente barato
para el análisis de absorción. Poseen generalmente una alta resistencia y es
fácil de mantener. Se utiliza principalmente cuando el análisis no requiere una
alta pureza espectral.
fig.
En la figura se muestra un diagrama esquemático de un fotómetro de un
solo haz y lectura directa. El equipo utiliza una lámpara de filamento de
volframio, lentes para proporcionar un haz paralelo de radiación, un obturador,
un filtro, un atenuador de haz en forma de cuña y un detector. El atenuador se
mueve hacia dentro o hacia fuera del haz para variar su intensidad cuando se
hace el ajuste del 100%T.
Una causa importante de inestabilidad en la medida son las
fluctuaciones en la intensidad de fuente (error instrumental). Por esta razón, la
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mayoría de los equipos de haz simple requieren algún tipo de estabilizador de
corriente.
Los instrumentos de un solo haz son particularmente adecuados para
medidas cuantitativas de absorción a una única longitud de onda (medidas
puntuales). Las cubetas que contienen la cubeta y el blanco se sitúan
alternativamente en la trayectoria del haz.
Los fotómetros se suministran con diversos filtros, cada uno de los
cuales transmite en una zona del espectro. La selección del filtro adecuado
determina en gran parte la sensibilidad de las medidas de absorbancia. Por
ejemplo, una disolución de color rojo absorbe radiación verde. (La intensidad
de la radiación verde absorbida será función de la concentración) por tanto
debemos seleccionar un filtro verde (o sea que emita verde que es el que
absorbe el rojo ¡olé!).
En general, el filtro mas adecuado para un método fotométrico será el
del color complementario a la disolución a analizar.
Espectrofotómetros:
Los espectrofotómetros están equipados con un
monocromador de prisma o red, que permite la selección de cualquier longitud
de onda dentro de la capacidad del instrumento. Un diagrama esquemático de
un espectrofotómetro de haz simple sería igual al del fotómetro de filtro de la
figura anterior siendo la diferencia principal la sustitución del filtro por el
monocromador.
La siguiente figura representa un espectrofotómetro de doble haz:
fig.
La luz procedente del monocromador se divide mecánicamente con un
interruptor giratorio ("chopper"), que dirige alternativamente el haz a través de
la muestra y del blanco. El detector por tanto recibe una señal intermitente que
se convierte en una señal eléctrica que es fácilmente amplificada. Se ha de
hacer todo lo necesario para asegurar que la trayectoria recorrida por la luz a
través de las dos cubetas sea idéntica. Dado que esta comparación se realiza
simultáneamente o casi simultáneamente, un aparato de doble haz compensa
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la mayoría de las fluctuaciones transitorias así como el funcionamiento irregular
de la fuente, detector y transductor.
APLICACIONES ANALÍTICAS.
El proceso de absorción. Análisis Cualitativo UV-VIS.
Como todos los seres humanos sabemos, los átomos, iones y
moléculas tienen un número limitado de niveles discretos de energía
cuantizada. Para que se produzca la absorción, la energía del fotón debe
coincidir exactamente con la diferencia de energía existente entre el estado
fundamental de la especie absorbente y uno de sus niveles energéticos
excitados. Estas diferencias de energía son únicas para cada especie y
originan espectros característicos que se utilizan frecuentemente para la
identificación cualitativa y la determinación cuantitativa tanto de sustancias
orgánicas como inorgánicas.
La absorción por moléculas poliatómicas es un proceso complejo ya que
el número de los posibles estados excitados de energía es muy elevado. La
energía total de una molécula viene dada por:
E = Eelectrónica + Evibracional + Erotacional
Eelectrónica = Energía asociada a los electrones de los orbitales externos de la
molécula
Evibracional = Energía de la molécula, considerada como un todo, debida a las
vibraciones
interatómicas
Erotacional = Energía asociada a la rotación de la molécula alrededor de su centro
de gravedad
La Electrónica es generalmente mayor que las otra dos, y las energías
necesarias para producir transiciones de los electrones externos de una
molécula corresponden a radiaciones en las regiones UV y VISIBLE.
Existen numerosos estados de energía vibracional y rotacional para
cada estado electrónico. Por tanto, para un determinado valor de E electrónica,
existirán valores de E que serán solo ligeramente diferentes debido a
variaciones de la Evibracional y/o rotacional. Por ello, el espectro de absorción UV
o VISIBLE de una molécula estará formado por bandas de absorción, como se
muestra en la figura para el vapor de benceno.
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Absorción por compuestos orgánicos.
La absorción de radiación por moléculas orgánicas en la región de  de
180 a 750nm se origina por la interacción de los fotones y aquellos electrones
que o bien participan directamente en el enlace y están, por tanto, asociados a
más de un átomo, o bien están localizados sobre átomos tales como O, S, N,
X.
La  a la que absorbe una molécula orgánica depende de la fuerza con
la que estén unidos sus distintos electrones. Así, los electrones compartidos
con enlaces sencillos C–C o C–H (enlaces) están unidos tan firmemente, que la
absorción ocurre solo en la región del UV–vacio <180nm donde también
absorben los componentes del aire (esta absorción se utiliza raras veces con
fines analíticos).
Los electrones implicados en dobles o triples enlaces de moléculas
orgánicas no están tan fuertemente retenidos, y son, por tanto, más fácilmente
excitados por la radiación. Así pues las especies con enlaces múltiples (dobles
o triples) generalmente presentan unos máximos de absorción útiles. Los
grupos funcionales orgánicos insaturados que absorben en las regiones UV ó
VIS se denominan cromóforos. En la siguiente Tabla se muestran los
cromóforos más comunes y las  aproximadas a las que absorben.
TABLA.
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Los datos de posición e intensidad del máximo deben servir únicamente
como guía orientativa con fines de identificación, ya que ambos están
influenciados por los efectos del disolvente así como por otros detalles
estructurales de la molécula. Además la conjugación entre dos o más
cromóforos tiende a provocar desplazamientos de los máximos de los picos a 
mayores (hacia el VIS).
Los electrones no compartidos en elementos como S, Br, I, etc., están
retenidos menos fuertemente que el par de electrones de un enlace saturado.
Como consecuencia de ello, las moléculas orgánicas que contienen esos
elementos presentan con frecuencia picos de absorción útiles en la región UV.
Absorción por especies inorgánicas.
En general los iones y complejos de las dos primeras series de
transición absorben radiación VIS al menos en uno de sus estados de
oxidación y son, en consecuencia, coloreados. Aquí, la absorción supone
transiciones entre “orbitales d” ocupados y libres. Las diferencias de energía
entre estos orbitales d (y, por tanto, la posición del correspondiente pico de
absorción) dependen de la posición del elemento en el sistema periódico, su
estado de oxidación y la naturaleza del ligando al que está unido.
La absorción por transferencia de carga es de gran importancia desde
el punto de vista analítico, ya que las  de los máximos de transferencia de
carga se encuentran entre las mayores observadas en espectroscopia
(>10.000). Estas  proporcionan por tanto sensibilidades altas. Muchos
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complejos presentan este tipo de absorción y se conocen como complejos de
transferencia de carga. Estos complejos, contienen generalmente un grupo
dador de electrones, y uno aceptor dentro del complejo. La absorción de
radiación implica la transición de un electrón desde el grupo dador al aceptor.
El estado excitado es, por tanto, el resultado de un proceso de oxidaciónreducción interno.
Ejemplos comunes son los complejos de tiocianato, el complejo de Fe(II)
con o-fenantrolina y el complejo de ferrocianuro férrico responsable del color
azul Prusia.
Análisis cuantitativo UV-VIS.
La espectroscopía de absorción en las regiones UV-VIS es una de las
herramientas más ampliamente utilizadas para el análisis cuantitativo. Entre las
características más importantes del método figuran las siguientes:
1. Gran campo de aplicación: Numerosas especies inorgánicas y
orgánicas absorben en la región UV-VIS, y son, por tanto,
susceptibles de ser determinadas cuantitativamente. Además
muchas especies no absorbentes, mediante un tratamiento químico
adecuado se las puede transformar en absorbentes.
2. Elevada sensibilidad: Las altas  comprendidas entre 5.000 y 40.000,
particularmente en complejos de transferencia de carga, permiten
límites de detección en el intervalo 10-4 a 10-5M.
3. Selectividad entre moderada y alta: El paso previo de separación se
hace innecesario si se logra encontrar una región de longitudes de
onda en la que el analito sea la única especie absorbente en la
muestra.
4. Buena exactitud: El error relativo en una medida espectrofotométrica
típica es del orden del 1 al 3%.
5. Facilidad y comodidad: Las medidas espectrofotométricas con los
modernos equipos son rápidas y cómodas. Además los métodos se
prestan frecuentemente a la automatización.
Aplicación a especies absorbentes.
En la Tabla anterior aparecen muchos grupos cromóforos comunes. Es,
por tanto, la determinación espectrofotométrica factible para compuestos
orgánicos que contienen uno o más de estos grupos.
También hay algunas especies inorgánicas que absorben como el MnO4
ó el CrO42 . Muchos iones de metales de transición tienen color en disolución y
por tanto se pueden determinar por medidas espectrofotométricas.
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Aplicación a especies no absorbentes.
Muchos analitos no absorbentes se pueden determinar haciéndolos
reaccionar con reactivos cromóforos, originando compuestos que absorben
intensamente en las regiones UV-VIS. La aplicación adecuada de estos
reactivos formadores de color requiere generalmente que su reacción con el
analito sea completa.
Método analítico.
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El primer paso de cualquier análisis fotométrico o espectrofotométrico es
el establecimiento de las condiciones que den como resultado una relación, a
ser posible lineal entre la absorbancia y la concentración del analito.
1. Selección de la longitud de onda: Para obtener una sensibilidad
máxima, las medidas espectrofotométricas se realizan a una 
correspondiente a un pico de absorción, porque, como ya pusimos de
manifiesto, la variación de la absorbancia por unidad de
concentración es máxima en este punto.
2. Optimización de variables que influyen en la absorbancia: Entre las
variables más comunes se encuentran la naturaleza del disolvente, el
pH, fuerza iónica y la presencia de sustancias interferentes. Los
efectos de estas variables se deben estudiar y se deben elegir
aquellas condiciones del análisis que permitan que la absorbancia no
se vea prácticamente afectada
3. Determinación entre la A y la concentración: Los datos de A pueden
manejarse de diferentes modos en análisis cuantitativo. La escala va
desde 0 a  pero la máxima exactitud se obtiene en el intervalo de
0’1 a 1’0 por lo tanto las condiciones experimentales se deben elegir
de manera que la absorbancia producida ocurra dentro de dicho
intervalo: las disoluciones que originen A demasiado elevadas se
diluyen y las de A baja se concentran. Normalmente esto se prevé
mediante una determinación preliminar.

Comparación con un patrón: Las absorbancias de la muestra
desconocida A1, y del patrón A2, se describen mediante la ley de
Beer;
A1 = 1b1c1
A1/A2 = 1b1c1/2b2c2
A2 = 2b2c2
1 = 2
b1 = b 2
A1 / A2 = c1/c2
Los patrones de calibración para un análisis fotométrico o
espectrofotométrico deben de ser tan semejantes como sea
posible a la composición de las muestras y deben abarcar un
intervalo razonable de concentraciones del analito. En raras
ocasiones, o casi nunca, se puede suponer que se cumple la ley
de Beer y utilizar un patrón único para determinar la absortividad
molar. Aún menos prudente es basar los resultados de un análisis
en un valor de absortividad molar obtenido en la bibliografía.

Método de adición de patrón.
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Podemos encontrarnos con grandes dificultades, incluso
insuperables, para preparar patrones con una composición
similar a la muestra a analizar. En estas circunstancias, el
“Método de la adición de patrón” puede resultar muy útil.
En este método se mide la absorbancia de dos
disoluciones:
-
Disolución A: Contiene una concentración desconocida de
analito c1
Disolución B: Contiene lo mismo que A más un volumen
conocido de patrón de concentración c2
Se comparan a continuación las absorbancias de ambas
disoluciones las cuales vendrán dadas por:
Adisolución A = bc1
Adisolución B = b (v1c1+v2c2)/v1+v2 = b (v1c1+v2c2)/vT
v1 = Volumen de la disolución A en la disolución B
v2 = Volumen de patrón de concentración c2
Dividiendo m.a.m. tendré:
AA /AB = c1/(v1c1+v2c2)/vT

c1 = AAv2c2/vTAB-v1AA
Análisis de mezclas.
Como ya se dijo anteriormente la absorbancia total de una
disolución a cualquier longitud de onda es igual a la suma de
las absorbancias de los componentes individuales de la
disolución. Esta relación en principio hace posible determinar
las concentraciones de los componentes individuales de una
muestra incluso si existe solapamiento total de sus espectros
correspondientes. Por ejemplo, la siguiente figura muestra el
espectro de una disolución que contiene una mezcla de
especies A y B así como los espectros de absorción de los
componentes individuales (obviamente no existe una  a la
que la absorbancia se deba solamente a uno de los
componentes A o B). Para analizar la mezcla se determinan
primero las absortividades molares de A y B a las longitudes
de onda 1 y 2 (con los patrones necesarios para asegurar
que se cumple la ley de Beer en un intervalo de absorbancias
en el que esté incluido la absorbancia de la muestra). Nótese
que las  seleccionadas para el análisis son aquellas en las
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que los dos espectros difieren significativamente. Las
ecuaciones que se dan pueden escribirse del siguiente modo:
A1   A1 bcA   B1 bcB
Si b = 1cm y como
A1   A1 bcA   B1 bcB
cA1 = cA2 = cA
cB1 = cB2 = cB
1
1
1
1
A1 = A1cA + B1cB
A2 = A2cA + B2cB
FIG.
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