ESPECT_guia_practicas v2

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UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA BIOLOGIA MOLECULAR Y FARMACOLOGÍA
LABORATORIO EN BIOQUIMICA -2006
GUIA DE PRACTICAS: ESPECTROFOTOMETRIA
Experimento 1: Ley de Lambert-Beer
Materiales:
1. Placa multipozo de polipropileno
2. Solución concentrada de rojo congo
Procedimiento:
1. Utilizando agua destilada como solvente, preparar las siguientes diluciones, llevando a un volumen final de 1 ml:
a) 1:10
b) 1:50
c) 1: 100
2. Colocar 150 µl de agua en un pozo (blanco), y 150 µl de cada tubo en distintos pozos de la placa. Leer la
absorbancia. Calcular la absorbancia de cada muestra (a,b y c), restándoles la lectura del blanco.
3. Colocar, en distintos pozos de la placa, 50 µl, 100 µl, 150 µl y 200 µl de la dilución 1:100
4. Leer a 450 o 500 nm
5. Leer en una cubeta de 1 cm de paso vs. agua a 488nm, la absorbancia de la dilución 1:100 (c).
Preguntas:
1. ¿Por qué se lee la absorbancia de este compuesto entre 450 y 500 nm?
2. ¿Qué sucede con los valores de absorbancia cuando se leen distintas concentraciones de una muestra? (hacer
la gráfica de absorbancia vs. concentración relativa o grado de dilución)
3. ¿Qué sucede con los valores de absorbancia cuando se leen distintos volúmenes de una muestra? (hacer la
gráfica de absorbancia vs. longitud de paso de la luz o volumen de muestra en el pozo)
4. Calcular la concentración de rojo congo presente en la muestra de dilución 1:100, en base a la absorbancia
obtenida en el punto 5 de procedimiento. Datos: coeficiente de extinción molar = 595 moles -1 cm-1, rojo congo
disuelto en agua, pH 7.3. Considerar que todas las soluciones problema tienen un pH de 7.3
Experimento 2: Espectros de Absorción
Materiales:
1. Cubetas de vidrio o cuarzo
2. Soluciones de rojo congo 1:10 y azul de bromofenol 1:10
Procedimiento:
1. Mezclar proporciones iguales de ambas soluciones en un frasco
2. Leer, usando agua como blanco, el espectro de absorción entre 300 y 600 nm de la solución de rojo congo, de
azul de bromofenol y de la mezcla de ambas.
Preguntas:
1. A qué longitud de onda ocurre el máximo de absorbancia en una solución acuosa de rojo congo?
2. A qué longitud de onda ocurre el máximo de absorbancia en una solución acuosa de azul de bromofenol?
3. ¿Que ocurre con el espectro de absorbancia de la mezcla de ambos compuestos? Explicar.
Experimento 3: Efecto del pH
Materiales:
1. Cubetas de vidrio o cuarzo
2. 1 ml de solución de rojo congo 1:10
3. Solución HCl
Procedimiento:
1. Agregar 10 µl de HCl a 1 ml de la solución de rojo congo 1:10. Hacer lo mismo en otro tubo conteniendo 1 ml de
agua destilada.
2. Leer, usando agua + HCl como blanco, el espectro de absorción entre 300 y 600 nm de la solución de rojo
congo + HCl.
Preguntas:
1. Qué puede decir del espectro del rojo congo a pH neutro vs. el espectro de este mismo compuesto a pH ácido?
¿A qué se deben las diferencias observadas?
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Experimento 4: Determinación de la Concentración de Proteínas por Espectrofotometría
Materiales:
1. Cubetas de cuarzo y de plástico
2. Solución de albúmina 2 mg/ml
3. Solución de albúmina de concentración desconocida
4. Reactivo de ALBUMINA
Procedimiento:
1. Preparar lo siguiente, en tubos de ensayo:
pozo #
blanco
m1
m2
m3
µl albúmina 2 mg/ml
0
30
75
150
µl agua
3000
2970
2925
2850
2. Tomar 500 µl de solución de cada tubo y de la muestra problema, y colocarlos en tubos de ensayo
3. Agregar 500 µl del reactivo de ALBUMINA. Mezclar
4. Leer a 595 nm, vs. la cubeta blanco. Graficar concentración (X) vs. absorbancia (Y). Calcular la concentración
de la muestra problema.
5. Leer la absorbancia de la muestra problema (vs. agua) a 280 nm. Calcular la concentración de albúmina en
base a que una solución de 1mg/ml de albúmina absorbe 0.66 a 280 nm.
6. Leer la absorbancia de los tubos standard (vs. agua) a 215 y 225 nm. Restar cada par de valores para cada
muestra. Graficar concentración (X) vs. abs 215nm - abs 225 nm (Y). Calcular la concentración de la muestra
problema.
Preguntas:
1. Comparar y discutir los resultados obtenidos por los métodos descritos en los puntos 4, 5 y 6 de procedimiento.