PORFIRINAS EN ORINA Lucia

DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE PORFIRINAS
EN ORINA
1. INTRODUCCIÓN.
Las porfirinas son el grupo postético de las cromoporfinas porfirínicas. Esto
quiere decir que son el grupo no proteico, y que gracias a metales presenta coloración.
Están compuestas por un anillo tetrapirrólico con sustituyentes laterales y un
átomo metálico en el centro, unido mediante cuatro enlaces de coordinación. Se
clasifican basándose en los sustituyentes laterales del anillo, de modo que se distinguen
mesoporfirinas, uroporfirinas, etioporfirinas y protoporfirinas. Estas últimas son las más
relevantes. Presentan como sustituyentes 4 metilos, 2 vinilos y 2 grupos propiónicos.
Las porfirinas existen en la naturaleza como parte de tres grupos de compuestos:
clorofila, vitamina B12( cobalamina) y hemo, y cada uno está formado de un tetrapirrol,
la estructura es muy similar y sólo se diferencian porque cada una está unida a un metal
diferente, la clorofila contiene magnesio, la cobalamina cobalto y el hemo hierro.
La vitamina B12 (cobalamina) es necesaria para la maduración de los eritrocitos.
La disminución en la producción de este tetrapirrol produce la anemia perniciosa con
neuropatía periférica.
Las porfirinas son importantes en numerosas actividades metabólicas
fundamentales. Las porfirinas uroporfirinógeno y coproporfirinógeno intermediarios
normales en la biosíntesis del heme, así como sus productos oxidados uroporfirina y
coproporfirina, por sí solos no son tóxicos, pero cuando están presentes en exceso
pueden asociarse a enfermedad y acumularse en el paciente en concentraciones muy
altas. Las alteraciones en el heme pueden afectar la médula ósea o al hígado.
2. FUNDAMENTO DEL MÉTODO.
Las porfirinas totales presentes en la muestra son retenidas por una resina de
intercambio aniónico. Una vez eliminadas las interferencias por lavado, se eluyen las
porfirinas y se cuantifican por espectrofotometría.
3. MATERIAL Y REACTIVOS.
- Espectrofotómetro para lectura a las longitudes: 380 (inicial) hasta 430 (final).
- Reactivo 1: ácido clorhídrico 3M.
- Reactivo 2: Tampón acetato 5M, ph 2,4.
- Microcolumnas: contienen resinas de intercambio aniónico equilibradas.
4. MUESTRA.
Orina de 24 horas. Recoger la orina de 24 horas en un recipiente opaco. Medir el
volumen. Conservar a temperatura ambiente, tapada y en la oscuridad 24 horas antes de
utilizarla.
En ocasiones para conservarla se añade 10 g de carbonato de sodio por litro de
orina.
5. PROCEDIMIENTO.
1. Se preparan una columna para la porfirina total y otra para el uroporfirinas.
2. Destapar las columnas y romper la lengüeta inferior. Bajar el disco superior hasta el
nivel de la resina, evitando comprimirla, con ayuda de una varilla. Dejar pasar todo el
sobrenadante, desechando el eluido.
3. Pipetear en la columna:
Porfirina Total:
Muestra
Agua destilada
2,0 ml
10,0 ml
Desechar eluido.
Desechar eluido.
2,0 ml
20,0 ml
2,0 ml
Desechar eluido
Desechar eluido
Desechar eluido.
Uroporfirinas:
Muestra
Reactivo 2
Agua destilada
4. Colocar la columna de la porfirina total, sobre un tubo de ensayo
Reactivo 1
5,0 ml
Recoger eluido
5. Cuando el nivel del líquido alcance el disco superior, añadir:
Reactivo 1
5,0 ml
Recoger junto con el
anterior.
6. Agitar bien los eluido y leer absorbancia entre 380 nm y 430 nm. El máximo estará
entre 400-407 nm frente al reactivo 1. Si la curva sale plana, la presencia de porfirinas
será negativa. La absorbancia es estable durante al menos 20 minutos.
6. CALCULOS
Porfirina total.
A (380) + A (430) = R1
R1 + 2 x A (Pico) x 3857 (factor) x diuresis = microg/24 horas
En unidades del sistema internacional multiplicamos por 1,43 y obtenemos nmol/24 h
Uroporfirina
A (380) + A (430) = R1
R1 + 2 x A (Pico) x 4266 (factor) x diuresis = microg/24 horas
Coproporfirinas
Total – Uro= Coproporfirinas