Factores antinutricionales

Alimentos y salud
Facultad de Ciencias Exactas – UNLP
Licenciatura en Ciencia y Tecnología de Alimentos
TP: Determinación de factores antinutricionales
OBJETIVOS
a) Determinar la actividad ureásica y antitríptica en leche de soja y leche de soja control,
analizando el efecto de la temperatura sobre dichos parámetros.
b) Corroborar si la actividad ureásica es un buen indicador de la inactivación de
factores antinutricionales.
Muestras a utilizar: Leche de soja y leche de soja control (preparada a temperatura ambiente).
1) Determinación de la actividad ureásica
Método de la A.A.C.C. (método 22-29). Es un método aplicable a harinas, aunque con
modificaciones puede emplearse para otros productos.
Reactivos
Buffer fosfato 0,05 M pH: 7,00 (usar dentro de los 90 días)
PO4H2K
3,403 g
PO4HK2
4,355 g
H2O(d) c.s.p.
1000 ml
Solución de urea en buffer fosfato 0,05 M pH: 7,00
Urea
15 g
Buffer
500 ml
Ensayo
- Pesar 1,0000 g de muestra en un tubo y adicionar 5 ml de solución de urea, tapar y mezclar.
Colocar la mezcla en un baño a 30°C por 30 min con agitación ocasional (aproximadamente
cada 5 min.).
- Blanco: pesar 1,0000 g de muestra en un tubo y adicionar 5 ml de solución buffer, tapar y
mezclar. Colocar la mezcla en baño a 30°C por 30 min con agitación ocasional
(aproximadamente cada 5 min.).
- Una vez transcurridos los 30 min sacar los tubos del baño, esperar 5 min y medir el pH de la
muestra y blanco.
Expresión de resultados.
Registrar diferencias en términos de pH entre el blanco y la muestra.
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2) Determinación de la actividad antitríptica
Fundamento del ensayo
Las reacciones que ocurren son, de modo simplificado, las siguientes:
PROTEASA (Tripsina) + SUSTRATO (Hemoglobina)
péptidos + aminoácidos
PROTEASA + SUSTRATO + INHIBIDOR
proteasa-inhibidor + sustrato
El complejo proteasa-inhibidor activo no puede producir la hidrólisis del sustrato. El
reactivo de Folin reacciona químicamente con los residuos de tirosina, triptofano, y en menor
grado, con los de cisteína e histidina de las proteínas dando un complejo color azulado. Al
adicionar TCA (acido tricloroacético) al producto de la reacción enzimática, precipitan los
péptidos no hidrolizados (de gran tamaño) quedando en solución los péptidos menores y
aminoácidos, que luego serán determinados espectrofotométricamente utilizando el reactivo
de Folin. Por lo tanto, a mayor porcentaje hidrolizado (muestra sin inhibidor de la proteasa o
con inhibidores inactivados), se producirá mayor coloración.
Reactivos
- Hemoglobina desnaturalizada en urea (Hb)
- H3PO4 1,0 M
- Urea
- NaOH 1,0 N y 0,5 N
- Na2CO3
- Buffer fosfato de sodio 0,2 M, pH 8,0
- Solución de Tripsina bovina 1 mg/ml (conservar en la heladera)
- Reactivo de Folin (diluido en agua, 1 parte Folin: 2 partes agua)
- TCA 5,0% p/v (ácido tricloroacético)
Preparación de la hemoglobina desnaturalizada (Sustrato)
Pesar 2 g de hemoglobina (Hb), y disolverla en 16 ml de NaOH 0,5 N, añadiendo
luego con agitación 64 ml de agua y 36 g de urea. Dejar en reposo durante 1 hora para que la
espuma se destruya, agregar 4 g más de urea y ajustar el pH a 8,0 con solución de H3PO4
(para disolver la espuma). La urea es una agente caotrópico y produce la desnaturalización de
la hemoglobina, lo cual facilitará el ataque de la proteasa durante la reacción. Luego añadir 4
g más de urea y volver a ajustar el pH a 8,0 con H3PO4. Conservar en heladera hasta 30 días.
Preparación de la muestra
Tomar aproximadamente 10 ml de muestra de leche y leche control, centrifugar
durante 10 min a velocidad media en centrífuga Rolco. Tomar 5 ml del sobrenadante y medir
el pH. Llevar a pH 8,0 por agregado de Na2CO3 sólido (es muy poco lo que hay agregar,
puede hacerse con punta de espátula).
Ensayo
Rotular por duplicado un tubo de ensayo para el blanco, otro para el control y uno
para cada una de las muestras.
Seguir el procedimiento experimental de acuerdo al siguiente diagrama de flujo:
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Expresión de Resultados. Cálculos
Una vez llevada a cabo la determinación, se obtendrán tres lecturas de absorbancia, una
para el control (Abs Control), una para la muestra (Abs Muestra) y otra para el blanco (Abs
Blanco). A partir de dichas lecturas, calcular la actividad antitríptica de cada muestra.
(Abs Control – Abs Blanco)------------------100% de actividad de la tripsina
(Abs Muestra – Abs Blanco)-------------------X % de actividad de la tripsina
100 – X % = % inhibición de la tripsina en la muestra
Tomando como muestra de referencia la leche control 100% activa:
(Abs Control – Abs Blanco)------------------100% de actividad de la tripsina
(Abs Muestra de referencia – Abs Blanco)-------------Xref % de actividad de la tripsina
100 – Xref % = % inhibición de la tripsina en referencia
% inhibición de la tripsina en referencia -----------100 % actividad antitríptica
% inhibición de la tripsina en muestra -----------X % actividad antitríptica en la muestra
Analizar los resultados y obtener conclusiones.
Bibliografía
- Bartholomai, G.B., Tosi, E. y González, R. J. Caracterización de compuestos nutritivos, no
nutritivos y calidad proteica. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el
Desarrollo (CYTED). Editorial Eudeba. Universidad de Buenos Aires (2000). Páginas 65-67.
- González, R. y Carrillo, D, Nutrición humana. Manual de prácticas. La Habana – Cuba.
Editorial Pueblo y Educación (1987). Páginas 34-36.
Los docentes de la Cátedra de Alimentos y Salud agradecen al Dr. Jorge Wagner, quien fuera
docente de la Cátedra Nutrición y Bromatología durante varios años, el autorizar y facilitar
las Guías de Trabajos Prácticos actualmente utilizadas en la Universidad Nacional de
Quilmes para su uso en esta Universidad.
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