Determinación del Radio de Stokes de proteínas

Bioquímica de Macromoléculas
Estructura y Química de proteínas
Trabajo Práctico
"Determinación del Radio de Stokes de proteínas globulares por cromatografía de
exclusión molecular (SEC-FPLC)"
Objetivos
Determinar los Radios de Stokes de la lisozima en distintas condiciones por cromatografía
de exclusión molecular (Fast Protein size-exlusion liquid chromatography (SEC-FPLC)).
Introducción
El tamaño de una proteína globular medido por cromatografia de exclusión molecular es el
volumen promedio que ésta molécula ocupa en solución y es frecuentemento expresado
como el Radio de Stokes. Este parámetro es especialmente sensible a la forma y a las
propiedades físicas de la proteína. El peso molecular de dicha proteína puede ser estimado
a partir de los dato de la filtración molecular sólo si la columna utilizada es
apropiadamente calibrada con proteínas que tienen aproximadamente la misma forma, las
mismas propiedades fisicas y se conoce por otros métodos su Radiode Stokes y su peso
molecular.
Según lo reportado en la literatura (Uversky, V., Biochemistry, 32 (1993), 13288-13298) el
Radio de Stokes determinado por FPLC se correlaciona con los valores obtenidos por
métodos utilizados frecuentemente, como cálculo a partir de la viscosidad intrínseca de la
solución.
Procedimiento experimental
Equipamiento
Para los experimentos de filtración molecular mencionados, utilizamos un aparato de
FPLC

(Pharmacia, Uppsala, Sweden) equipado con una columna de Superosa

12. El
loop de inyección, posee 100l de capacidad y todas las corridas se realizaran a un flujo de
0.5 ml/min. La detección se realiza a una longitud de onda de 280nm y la sensibilidad del
detector es fijada a 0.1.
Todos los buffers son pasados a través de un filtro de Nylon 66 de 0.2 m (Rainin
Instrument Co.) antes de ser introducidos en la columna. En este caso, todas las corridas se
efectuarán en buffer fosfato de sodio 0.1M pH 7.
Calibración de la columna de Superosa 12
Para la calibración de la columna se utiliza un set de proteínas de peso molecular
conocido. 100l de la mezcla a separar se siembran en la columna y luego se grafica la
dependencia del tiempo de retención con el Log10 del Radio de Stokes. Este último valor,
se obtiene a partir de la siguiente ecuación:
log Rs= 0.369 (log MW) - 0.254
que relaciona el peso molecular de la proteína con su Radio de Stokes.

La mezcla de proteínas a utilizar para calibrar la columna (BIO RAD , Molecular Weight
Markers) consta de:
Thyroglobulin (670 kDa), bovine  globulin (150 kDa), chicken ovoalbumin (44 kDa),
equine myoglobin (17 kDa), vit.B12 (1.35 kDa).
Una vez obtenido el gráfico de log Rs vs tiempo de retención para las proteinas de radio de
Stokes conocido, obtengo la ecuación de la recta ajustada que caracterizará a la columna.
Determinación del Rs de las proteínas problema
Se inyectarán en la columna 100 l de las soluciones de lisozima obtenidas en todos los
puntos del TP ¨Determinación de tioles libres y puentes disulfuro en proteínas", parte B.
En el caso en que las proteínas se hayan obtenido en condiciones nativas (buffer fosfato de
2
sodio), la columna deberá estar quilibrada en el mismo buffer. Si la proteína se encuentra
desnaturalizada (en buffer con clruro de guanidinio), la cromatografia debe realizarse en
las mismas condiciones (se deberá equilibrar previamente la columna en dicho buffer).
De esta manera, se obtendrán el Rs de la proteína reducida, sin reducir, nativa y
desnaturalizada mediante la ecuación de la recta que se obtuvo en la calibración. Esta
ecuación permitirá averiguar el radio de Stokes de la proteína problema a partir de sus
datos de tiempo de retención en la columna.
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