Laboratorio TPN8

INMUNOFLUORESCENCIA
Que es la fluorescencia?
…..Es la propiedad de una sustancia de emitir
luz cuando es expuesta a radiaciones de baja
longitud de onda y alta energía (UV – Rx). Las
radiaciones absorbidas (invisibles al ojo), son
transformadas en luz visible, o sea de una
longitud de onda mayor a la incidente.
Como se produce la fluorescencia?
La absorción de luz por parte de la molécula de
fluorocromo la eleva a un estado de exitación en el cual
contiene mayor energía.
La molécula permanece en el estado de exitación por un
período de tiempo muy corto.
El retorno a un nivel de energía menor es acompañado por
emisión de luz (fluorescencia)
Inmunofluorescencia Directa
El procedimiento se realiza en un paso básico de reacción.
La muestra clínica que presuntamente contiene
antígenos del microorganismo bajo estudio es puesta en
contacto con un anticuerpo monoclonal dirigido contra
dicho microorganismo conjugado con fluoresceína. Si el
antígeno esperado está presente se formará un
complejo antígeno-anticuerpo. La reacción positiva en
forma de fluorescencia verde manzana puede verse con
la ayuda de un microscopio de fluorescencia.
Esquema de la técnica
Inmunofluorescencia Indirecta
Es una técnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin
marcar directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza
por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado con
fluorocromo
El proceso consta de dos etapas:
Primera etapa: se fijan sobre un portaobjetos los antígenos que
constituyen el substrato conocido específico (células que
contiene virus, T. gondii, T. pallidum, etc.) sobre él se coloca
el suero de quien se sospecha la presencia de anticuerpos
específicos, si la reacción es positiva se dará formación de
complejo antígeno-anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no
estaba marcado
Segunda etapa: se agrega una anti-inmunoglobulina humana
marcada, que reaccionará con el anticuerpo del complejo
producido en la primera etapa.
Inmunofluorescencia Indirecta
La técnica se realiza en dos etapas
PRIMERA ETAPA
SEGUNDA ETAPA
Microscopio de
inmunofluorescencia
Fuente de luz (lámpara de mercurio)
Filtros
Espejo dicroico
Excitación - Emisión
Tipos de filtros
Fluorocromos
Sustancias que emiten un fotón cuando
son excitados por un fotón incidente.
Formen uniones con las proteínas (Ac)
pero sin afectar los grupos de
combinación específica del anticuerpo.
La reacción de unión ocurre entre los
grupos amino y carboxilo de la
proteína y los grupos tiocianato o
cloruro de sulfonilo de los colorantes
El pH afecta la fluorescencia y por
esta razón se debe trabajar a pH
estable y adecuado dependiendo del
colorante : fluoresceína (pH 8),
rodamina (pH 7),
DANS (pH 1.6-14)
PARÁMETROS DE FLUORESCENCIA
Afinidad
Selectividad
Especificidad
Intensidad (brillo)
Estabilidad
Competitividad
Ventajas y desventajas
VENTAJAS
- Se pueden obtener resultados rápidos.
-No es necesario realizar cultivos.
-Se puede identificar microorganismos específicos en un grupo mixto.
-Determina la identidad de un organismo muerto. Es sensible.
Nota: La figura muestra un ejemplo de fagocitosis.
DESVENTAJAS
-Costos en reactivo y equipo
-Debe ser realizado por personal muy especializado.
-Los resultados no son 100% específicos
Photobleaching
Es la disminución de la intensidad de emisión de
la muestra debido a la descomposición
irreversible de la fluorescencia de las
moléculas.
Este fenómeno esta directamente relacionado
con la intensidad de excitación y y con el tiempo
durante el cual estamos excitando la muestra.
Para reducir este efecto podemos utilizar “anti
fading” (glicerina) en la preparación de la
muestra.
Detección de Anticuerpos AntiCándidas por Inmunofluorescencia
1 -Colocar 10 µl de una suspensión de 106 cándidas en cada wells
de un portaobjeto de 7 wells. Dejar secar.
2- Agregar 20µl de suero diluído 1/16- 1/32- 1/ 64- 1/128- 1/2561/512- negativo en cada wells. Incubar 30 minutos a temperatura
ambiente en cámara húmeda.
3- Lavar 5 minutos con PBS. (Repetir 2 veces). Secar los bordes.
4- Agregar 20ul de suero anti Fc- FITC (dilución 1/100). Incubar 30
minutos a temperatura ambiente en oscuridad en cámara húmeda.
5- Lavar 5 minutos con PBS. (Repetir 2 veces). Secar los bordes.
6- Montar con 1 gota de glicerina bufferada.
7- Observar en microscopio de Inmunofluorescencia. La imagen es
positiva si permite ver fluorescente el contorno de la levadura.
Para recordar…..
APLICACIONES
Técnicas analíticas (cuali-y cuantitativas) en Química
y Bioquímica.
Métodos inmunológicos de diagnóstico médico.
Procedimientos microscópicos en Microbiología,
Genética, Histología, Histoquímica, Biología Celular,
Biología Molecular, Biología del Desarrollo, Patología
(sondas vitales, ensayos de viabilidad, indicadores,
inmunofluorescencia, FISH).
Análisis poblacional de células (citofluorimetría de
flujo).
APLICACIONES
Treponema Pallidum agente etiológico de la Sífilis. Determinación
por inmunofluorescencia donde se observa la forma de espiroqueta
Dengue
Las células
fluorescentes
representan células
infectadas con el virus
dengue. Infección
evidenciada con
anticuerpos
monoclonales para
cada serotipo.
Biopsias renales :
Anticuerpos contra Membrana basal glomerular de tipo IgG
Virus Respiratorios
Virus Influenza B (IFD detección de antígeno)
Serotipificación
Anticuerpos anti Toxoplasma gondii, agente etiológico de la
toxoplasmosis. El sustrato antigénico utilizado es una suspensión
de Toxoplasma gondii. Detecta antígenos de membrana .
ANCA C
ANCA P
Fluorescencia utilizando mas de un
fluorocromo