2015000001088.pdf

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
NUEVAS ESTRATEGIAS ANALÍTICAS PARA EL CONTROL DE
ALDEHÍDOS AROMÁTICOS COMO SUBPRODUCTOS DE
DESINFECCIÓN DE AGUAS POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS Y ELECTROFORESIS CAPILAR
Tesis Doctoral
José María Fernández Molina
Córdoba, 25 de noviembre de 2014
TITULO: NUEVAS ESTRATEGIAS ANALÍTICAS PARA EL CONTROL DE
ALDEHÍDOS AROMÁTICOS COMO SUBPRODUCTOS DE
DESINFECCIÓN DE AGUAS POR CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
Y ELECTROFORESIS CAPILAR
AUTOR: José María Fernández Molina
© Edita: Servicio de Publicaciones de la Universidad de Córdoba. 2015
Campus de Rabanales
Ctra. Nacional IV, Km. 396 A
14071 Córdoba
www.uco.es/publicaciones
[email protected]
Agradezco a la Consejería de Economía, Innovación, Ciencia y Empleo de la Junta
de Andalucía la concesión de una beca pre–doctoral de Formación de Personal
Investigador adscrita al Proyecto de Excelencia PO7–FWM–0249 “Desarrollo de
metodologías cromatográficas (electroforéticas) para la determinación de compuestos
orgánicos volátiles originados en la desinfección de agua” que ha hecho posible la
dedicación a mi trabajo durante cuatro años para el desarrollo de las investigaciones
recogidas en esta Memoria.
Índice
SECCIÓN
PÁGINA
Objetivos
1
Capítulo 1
Introducción
7
1. Definición y propiedades de aldehídos aromáticos
9
2. Comportamiento y acción toxicológica de aldehídos aromáticos
2.1. Biotransformación de aldehídos
3. Caracterización de aldehídos aromáticos como subproductos de
desinfección de aguas
3.1. El proceso de ozonización
4. Metodologías analíticas para la determinación de aldehídos en aguas
15
17
19
22
4.1. Métodos oficiales para la determinación de aldehídos
24
4.2. Derivatización de compuestos carbonílicos
26
4.3. Preparación de las muestras para su análisis
35
4.3.1. Extracción en fase líquida
37
4.3.2. Extracción en fase sólida
42
4.4. Separación y determinación de aldehídos
Capítulo 2
12
50
4.4.1. Cromatografía de líquidos
51
4.4.2. Cromatografía de gases
55
4.4.3. Electroforesis capilar
58
5. Conclusiones
63
6. Bibliografía
68
Herramientas analíticas
83
PARTE EXPERIMENTAL
Capítulo 3
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
97
Improved solid-phase extraction/micellar procedure for the
derivatization/preconcentration of benzaldehyde and methyl derivatives
from water samples
103
Simple and sensitive determination of low-molecular-mass aromatic
aldehydes in swimming pool water by LC-diode array detector
125
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos en
agua y matrices biológicas mediante LC–MS
145
Trace determination of low–molecular–mass substituted benzaldehydes in
treated water using micro solid-phase extraction followed by liquid
chromatography–mass spectrometric detection
149
LC–MS analytical method for biomonitoring of aliphatic and aromatic
low–molecular–mass aldehydes in human urine
177
Determinación de aldehídos aromáticos en muestras de agua
tratada mediante MEKC–DAD
197
Micro solid-phase derivatization analysis of low-molecular mass aldehydes
in treated water by micellar electrokinetic chromatography
201
Resultados y discusión
227
1. Analitos objeto de estudio
230
2. Derivatización/preconcentración de aldehídos mediante µ–SPE
232
3. Análisis cromatográfico de los DNPH–derivados
246
4. Análisis electroforéticos de los DNPH–derivados
251
5. Innovaciones aportadas por los métodos LC y MEKC
255
6. Análisis de muestras de agua
258
7. Determinación de aldehídos en muestras de orina de investigadores
expuestos
264
8. Estimación del grado de consecución de los objetivos planteados
268
9. Bibliografía
270
Capítulo 7
Conclusiones
273
Anexos
Producción científica
279
Capítulo 4
Capítulo 5
Capítulo 6
Objetivos
Objetivos
La desinfección del agua para el consumo humano ha supuesto uno de los
mayores avances en relación con la salud pública, erradicando enfermedades tales
como el tifus y la disentería. A pesar de que los desinfectantes son efectivos para
eliminar los microorganismos presentes en el agua, una consecuencia de su uso es la
formación de subproductos de desinfección (disinfection by–products, DBPs) debido a
la reacción de estos desinfectantes (oxidantes fuertes) con la materia orgánica,
contaminantes antropogénicos y/o bromuro/yoduro presentes de forma natural en
la mayoría de las aguas naturales. Estudios epidemiológicos más recientes han
relacionado la aparición de cáncer de vejiga, colon y recto, así como problemas
reproductivos, con la presencia de estos compuestos en las aguas de consumo
humano, tanto por exposición oral como por inhalación y contacto dérmico (a
través de baños y duchas).
Dentro de los subproductos originados en la desinfección de aguas tras su
tratamiento con ozono, los aldehídos constituyen el grupo de mayor relevancia,
dado su carácter nocivo para la salud. Sin embargo, a medida que se ha ido
profundizando en el conocimiento y origen de estos subproductos se ha detectado
la presencia de ciertos aldehídos en muestras de aguas tratadas con otros
desinfectantes, tales como cloro, dióxido de cloro o sus mezclas.
Se ha descrito básicamente la presencia de siete aldehídos en muestras de
agua
tras
su
ozonización:
formaldehído,
acetaldehído,
propionaldehído,
butiraldehído, valeraldehído, glioxal y metilglioxal. Además, se ha descrito en
algunas publicaciones la presencia de ciertos aldehídos aromáticos asociados al
tratamiento con distintos desinfectantes, como benzaldehído y sus derivados mono
3
y dihidroxilados así como alquilderivados. La mayoría de estos subproductos se
encuentran en agua a niveles inferiores a µg L–1. La acción mutágena y carcinógena
de estos DBPs ha suscitado un interés creciente que ha llegado hasta nuestros días.
El objeto de las investigaciones recogidas en esta Memoria ha sido el
desarrollo de tecnologías rápidas, miniaturizadas y/o automáticas para la
determinación de aldehídos aromáticos emergentes no regulados y para los que no
existen metodologías para su determinación conjunta de forma sistemática en
muestras de agua. La posibilidad de realizar la derivatización de los aldehídos con
2,4-dinitrofenilhidracina mediante adsorción de este reactivo en una µ–columna de
extracción en fase sólida (µ–SPE) es un importante e interesante reto encuadrado
dentro de las actuales tendencias de automatización y miniaturización de los
métodos analíticos. Pese a que las investigaciones planteadas persiguen inicialmente
la determinación de estos aldehídos aromáticos en muestras de agua, se pretende de
manera adicional aplicar dichos métodos a muestras biológicas (orina) con el objeto
de evaluar la exposición a estos compuestos de investigadores que lo manipulan.
Para la consecución de este objetivo global se pretenden abordar las
siguientes estrategias concretas:
a) Desarrollo de sistemas automáticos miniaturizados de µ–SPE para la
derivatización y preconcentración in situ de aldehídos aromáticos con
2,4-dinitrofenilhidracina
y
posterior
determinación
de
las
correspondientes hidrazonas por cromatografía de líquidos con
detección por diodos en fila y mediante espectrometría de masas. Con
estos sistemas de µ–SPE se pueden alcanzar altos factores de
preconcentración (operan con grandes volúmenes de muestra y los
derivados se eluyen con microlitros de disolvente) originando
metodologías analíticas con una gran sensibilidad.
4
Objetivos
b) Para conseguir la máxima eficiencia posible en el proceso de
derivatización y preconcentración de los aldehídos se ensayarán diversas
alternativas: (i) adición de distintos modificadores a la muestra de agua
objeto de análisis tales como agentes micelares, ácidos biliares, éteres
corona, etc.; y (ii) evaluación de distintos sorbentes como soporte para la
adsorción del reactivo derivatizante en el sistema de µ–SPE tales como
C18, LiChrolut EN, TelosTM ENV, diferentes amberlitas, etc.
c) Empleo de dos sistemas de detección en cromatografía de líquidos,
diodos en fila (DAD) y espectrometría de masas (MS), dado que en
ciertas determinaciones la detección mediante DAD puede ser una
alternativa interesante a la MS.
d) Diseño de métodos electroforéticos con detección por diodos en fila
para la determinación de aldehídos aromáticos con el empleo del sistema
de µ–SPE ya optimizado. Se persigue de esta forma el aprovechamiento
de las ventajas inherentes que exhibe la electroforesis capilar frente a la
cromatografía de líquidos, y hacer uso de los elevados factores de
preconcentración proporcionados por la técnica de µ–SPE con objeto
de soslayar la baja sensibilidad que proporciona la electroforesis capilar
con detección por diodos en fila.
e) Determinación de aldehídos en muestras de agua tratadas en las que
pueden aparecer como DBPs. Los resultados de estos análisis son de
gran importancia para el control y evaluación de los sistemas de
tratamiento de agua potable tanto convencionales como de nueva
implantación.
Los
métodos
propuestos
tienen
como
objetivo
fundamental la determinación de estos aldehídos en muestras de piscina
5
de distinta naturaleza (interior, exterior, pública y privada) y en otras
muestras de agua de interés ambiental.
f) Aplicación de las metodologías desarrolladas a la determinación de estos
aldehídos en muestras de orina con objeto de evaluar la exposición a
estos compuestos de personas expuestas que trabajan en el laboratorio.
Asimismo, se pretende completar esta investigación con el estudio de la
cinética de excreción de los aldehídos estudiados en la orina.
g) Con el desarrollo de estas estrategias se pretende: (i) aportar nuevas
metodologías analíticas en el ámbito de la determinación de aldehídos
aromáticos en muestras de agua, debido a la práctica inexistencia de
alternativas que estudien la presencia de estos compuestos en tales
muestras de manera conjunta y no de forma residual asociada a la
presencia de aldehídos alifáticos; y (ii) desarrollar metodologías analíticas
de bajo impacto ambiental con un reducido consumo de disolvente
orgánico, enmarcándose así en el ámbito de la Química Verde.
6
Capítulo 1
Introducción
Introducción
1. Definición y propiedades de aldehídos aromáticos
Los aldehídos son compuestos orgánicos que contienen un grupo carbonilo
(C=O) en posición terminal, que está unido, al menos, a un hidrógeno. Dos
aspectos notables de este grupo son su geometría coplanar y su polaridad, ya que el
grupo carbonilo confiere carácter polar a los aldehídos, siendo los momentos
dipolares notoriamente mayores que los que exhiben los alquenos. La fórmula
general para un aldehído es RCHO, donde R es un grupo alquilo o arilo, en cuyo
caso se denominan aldehídos aromáticos.
Los aldehídos tienen puntos de ebullición más altos que los alquenos dado
que son más polares, siendo por tanto más intensas las fuerzas de atracción dipolo–
dipolo entre sus moléculas. Sin embargo, sus puntos de ebullición son menores que
los de los alcoholes porque, a diferencia de ellos, los grupos carbonilo no pueden
formar puentes de hidrógeno entre sí. El oxígeno carbonílico puede formar puentes
de hidrógeno con los protones de los grupos hidroxilos. Esto los hace más solubles
en agua que los alquenos, pero menos soluble que los alcoholes [1].
En la Tabla 1 se recogen los aldehídos aromáticos con los que se ha
trabajado en las investigaciones que se recogen en esta Memoria en el ámbito de
subproductos de desinfección (DBPs) del agua, detallando sus principales
propiedades físico–químicas. Se incluyen además aquellos aldehídos alifáticos que se
presentan con mayor frecuencia en aguas tratadas. El benzaldehído y sus derivados
hidroxilados han sido identificados como DBPs tras someter al agua a procesos de
ozonización [2,3], encontrándose también el benzaldehído en aguas tratadas con
cloro [4] y con dióxido de cloro [5], al igual que el 2-etilbenzaldehído [3]. Por otra
parte, compuestos como el 3-metilbenzaldehído y el 2,5-dimetilbenzaldehído son
incluidos como analitos objetos de estudio por la Agencia de Protección Ambiental
de Estados Unidos (EPA) [6]. Hasta la fecha estos aldehídos aromáticos han sido
9
Capítulo 1
escasamente estudiados ya que su presencia en muestras de agua no está muy
documentada.
Tabla 1
Aldehídos investigados en la presente Tesis Doctoral.
FÓRMULA
CAS
PESO
MOLECULAR
(g mol–1)
PUNTO DE
EBULLICIÓN
(ºC)
C6H5CHO
100-52-7
106.12
179
CH3C6H4CHO
620-23-5
120.15
198
2-etilbenzaldehído
C2H5C6H4CHO
22927-13-5
134.18
212
2,5-dimetilbenzaldehído
(CH3)2C6H3CHO
5779-94-2
134.18
220
HOC6H4CHO
100-83-4
122.12
191
(HO)2C6H3CHO
1194-98-5
138.12
276
Formaldehído
HCHO
50-00-0
30.03
-21
Acetaldehído
CH3CHO
75-07-0
44.1
20
NOMBRE DEL
COMPUESTO
Benzaldehído
3-metilbenzaldehído
3-hidroxibenzaldehído
2,5-dihidroxibenzaldehído
Propionaldehído
CH3CH2CHO
123-38-6
58.1
49
Butiraldehído
CH3(CH2)2CHO
123-72-8
72.11
75
Valeraldehído
CH3(CH2)3CHO
110-62-3
86.13
102
Además de su presencia como DBPs, estos aldehídos aromáticos también
pueden encontrarse en alimentos, medio ambiente, productos agrícolas y
farmacéuticos, etc. debido a diferentes fuentes. El benzaldehído está presente en la
naturaleza de manera abundante, siendo el principal constituyente de los aceites
esenciales de las semillas y los granos de almendras amargas, albaricoques,
melocotones, ciruelas y cerezas. Es una molécula muy versátil [7] y su uso está muy
extendido en la industria alimentaria, donde se utiliza en la producción de aditivos
saborizantes que confieren sabor artificial a almendra y a cereza. También se puede
originar en procesos de combustión, en motores de gasolina y diesel, incineradores
10
Introducción
y en aprovechamiento térmico o quema accidental de maderas. Además puede
formarse en la atmósfera como resultado de la oxidación fotoquímica de tolueno y
otros hidrocarburos aromáticos [8]. Se emplea como intermediario en la producción
de fármacos para la hipertensión, alcoholes aromáticos, colorantes, y de productos
químicos como ácidos benzoico y cinámico, así como precursor en la elaboración
de aditivos plásticos. Se usa también en el campo de la cosmética, donde se usa
como aditivo en la elaboración de fragancias y como disolvente de aceites y resinas.
Además se utiliza como intermediario en la elaboración de nitrato y acetato de
celulosa y de reactivos empleados en fotografía. Se ha añadido a fibras de vinilo para
favorecer su elasticidad. Su versatilidad antes mencionada alcanza el ámbito de la
agricultura, donde ha sido utilizado también durante largo tiempo como un
repelente para abejas. Actualmente su inclusión como ingrediente activo está
prohibida en cualquier pesticida registrado desde 1999 [9].
El 3-metilbenzaldehído se encuentra principalmente en la naturaleza como
producto de la emisión de gases de escape de motores de motocicletas, automóviles
y camiones. También se ha detectado en muestras de partículas de revestimiento de
frenos y de material de desgaste de neumáticos [10].
El 3-hidroxibenzaldehído se emplea como intermediario en la síntesis de
fármacos (tales como penicilina, ampicilina e itoprida) y de compuestos
agroquímicos, en perfumería y en galvanoplastia [11].
11
Capítulo 1
2. Comportamiento y acción toxicológica de aldehídos
aromáticos
Los aldehídos constituyen un grupo de compuestos orgánicos relativamente
reactivos caracterizados por la presencia de un doble enlace polarizado carbono–
oxígeno. El átomo de oxígeno es altamente electronegativo comparado con el de
carbono, por lo que los aldehídos tienen elevados momentos dipolares. La molécula
llega a ser incluso más reactiva si en los carbonos 2 y 3 aparece un doble enlace [12].
La mayoría de los productos químicos a los que se les reconoce actividad
carcinógena son igualmente capaces de provocar un cambio en el material genético
dentro de una célula (mutación) [13]. La intensidad y extensión de los daños en el
ADN se ha relacionado con la acción mutágena y constituyen el indicador más
sensible de la potencial carcinogénesis química [14]. La interacción química del
grupo C=O con las bases púricas y pirimidínicas del ADN, el ARN (adenina,
guanina, citosina, timina y uracilo) o las enzimas implicadas en la replicación del
ADN, provoca una alteración en el material genético que se replica
automáticamente, desvirtuando la composición y función de la nueva secuencia de
nucleótidos formada a partir de estos cambios.
La aplicación de algunos aldehídos como formaldehído a bajas
concentraciones (diluido en agua al 37% v/v) como desinfectante puntual, para
mantener la asepsia en ambientes [15] y en la conservación de muestras biológicas y
cadáveres (Tanatología médica y forense) ha dado lugar a que los efectos irritantes
de la mayoría de los aldehídos se conociesen desde hace mucho tiempo.
Investigaciones previas [16] ya mostraban la evidente relación entre exposición de
pequeños mamíferos a atmósferas que contenían aldehídos y daños letales en el
riñón y, sobre todo, en el tejido pulmonar a las pocas horas del inicio de la
exposición.
12
Introducción
En ensayos de laboratorio el benzaldehído ha mostrado una baja toxicidad
aguda oral y por inhalación, con valores DL50 que oscilan entre 1 y 5 g kg–1 del peso
vivo por ingestión y unos 500 mg m–3 por aire respirado [17]. Al administrar dosis
simples a roedores se apreciaron distintos efectos en el sistema nervioso. En
estudios a corto plazo mediante administración oral, el riñón, cerebro y estómago
fueron los órganos diana del daño tóxico en ratas, mientras que en las exposiciones
a largo plazo a benzaldehído se produjeron tumores benignos en el estómago del
ratón, pero no hubo evidencias de carcinogénesis en ratas [18]. El benzaldehído
causó efecto en los cromosomas en cultivos de células de mamífero, pero no dio
positivo en el test de Ames.
Kluwe y col. [18] determinaron que en términos de toxicidad aguda, la
exposición oral en intervalos de 800–1600 y 1600–3200 mg kg–1 por día de
benzaldehído causaba pérdida de peso y muerte en ratas y ratones, respectivamente.
También se detallan otros efectos derivados de la exposición, como lesiones
cerebrales degenerativas y necrosis renal a partir de 800 mg kg–1 por día en ratas.
Respecto a un ingesta por inhalación se demostró que administrado de manera
continuada en conejos provoca irritación nasal y ocular a 500 mg L–1 y causa la
muerte a partir de 750 mg L–1 [19].
La información existente sobre exposición por vía dérmica a humanos es
limitada, pero se ha determinado que la concentración máxima de benzaldehído
encontrada en cosméticos es 0.5% [19]. A estos niveles de concentración el
benzaldehído no presenta peligro para humanos en términos de reacciones
dérmicas.
El Programa Nacional de Toxicología de los Estados Unidos [17] no
encontró evidencias para considerar al benzaldehído como carcinogénico en
ratones. Varios estudios han sugerido incluso que el benzaldehído puede tener
13
Capítulo 1
propiedades antitumorales. Estas evidencias han motivado que el benzaldehído sea
clasificado como no carcinógeno en humanos.
Por otra parte, se han publicados estudios relacionados con su toxicidad
aguda directa sobre el hombre que han permitido establecer que una dosis efectiva
de hasta 200–400 mg de benzaldehído no es tóxica en humanos [17] y que a altas
concentraciones mostraba un efecto narcótico.
El Instituto Nacional para la Seguridad y Salud Ocupacional de los Estados
Unidos [20] señala que la exposición ocupacional al benzaldehído puede darse a
través de la inhalación y por absorción a través de la piel de este compuesto en
lugares de trabajo donde se produzca o se emplee benzaldehído. Estudios de datos
de seguimiento indican que la población puede estar expuesta al benzaldehído por la
inhalación de aire ambiental, la ingesta de alimentos que lo contengan de manera
natural o como aditivo alimentario y mediante el consumo de agua potable.
Pese a que no existe tanta información para los demás aldehídos aromáticos
estudiados en esta Memoria como para el benzaldehído, se pueden detallar algunas
evidencias toxicológicas. Así, por ejemplo, para el 3-metilbenzaldehído se ha
determinado que el aire inspirado y la ingestión de alimentos que lo contengan son
posibles fuentes de exposición [11,21] y que, como el benzaldehído, posee acción
irritante sobre la piel. Tanto para el 2-etilbenzaldehído como para el 2,5dimetilbenzaldehído no se dispone de estudios toxicológicos suficientes donde se
hayan reportados sus efectos.
Los aldehídos hidroxilados (3-hidroxi y 2,5-dihidroxibenzaldehído) tampoco
han sido tan investigados como el benzaldehído. Las pocas referencias de las que se
tienen constancia proceden de estudios cuantitativos de ecotoxicidad sobre dafnias
(Daphnia magna) [22], suelos [23] y presencia en humo de tabaco [24] entre otros.
En lo relativo a su adsorción al suelo, se ha comprobado que no existe un
14
Introducción
comportamiento genérico en los aldehídos aromáticos sino que depende en gran
medida de la naturaleza del grupo sustituyente.
2.1. Biotransformación de aldehídos
Dependiendo de las reacciones [12] a las que pueden verse sometidos los
aldehídos, estos pueden dividirse en tres grupos:
Aldehídos saturados o simples. Su grupo carbonilo puede ser oxidado a
ácido carboxílico. La oxidación ocurre mediante varias enzimas deshidrogenasas de
aldehídos, algunas de las cuales tienen una alta especificidad por el sustrato mientras
que otras son capaces de acomodarse a una gran variedad de los mismos. Los
productos de oxidación son los correspondientes ácidos carboxílicos y la reacción es
dependiente del NAD(P)+.
La reacción de oxidación genérica para aldehídos simples es
R-CHO + NAD+ + H2O → R-COOH + NADH + H+
Las
reacciones
de
reducción
son
menos
importantes
en
la
biotransformación de aldehídos, debido a que los valores de Km para las enzimas
aldehído reductasa y alcohol desidrogenasa que catalizan la reacción son
generalmente de 1 a 3 órdenes de magnitud mayores que para las aldehído
deshidrogrenasa. La reducción a un alcohol es fácilmente reversible, mientras que la
oxidación de los aldehídos a ácidos carboxílicos es esencialmente irreversible.
Varios autores han destacado la capacidad de los aldehídos para formar
enlaces covalentes entre ADN y proteínas. Los objetivos principales en estos casos
son grupos amino como, por ejemplo, los de guanosina.
15
Capítulo 1
Aldehídos α,β-insaturados. Generalmente son conjugados con glutatión u
otra molécula que contenga grupo tiol. El carbono β de los aldehídos insaturados es
el primer objetivo para electrófilos débiles como glutatión o cisteína. La oxidación,
cuando tiene lugar, parece que se lleva a cabo tras la conjugación. Las interacciones
con ADN han sido estudiadas, generalmente las que resultan de interacciones con
grupos amino, especialmente la guanosina.
Aldehídos halogenados o con otros sustituyentes. La forma en que estos
aldehídos son metabolizados depende del carácter de los otros grupos funcionales.
De entre estos aldehídos destaca por su estudio en esta Memoria el benzaldehído,
cuya biotransformación y metabolismo no está tan estudiado como en el caso de los
aldehídos alifáticos. No obstante se conoce [25] que una exposición vía ingesta de
una toma simple de benzaldehído en mamíferos provoca su aparición en orina,
como producto de la metabolización del ácido hipúrico fundamentalmente (66.9%
de la dosis oral recibida) y derivados del ácido benzoico (ácido bencilglucurónico,
bencilglucurónido y ácido benzoico libre).
16
Introducción
3. Caracterización de aldehídos aromáticos como
subproductos de desinfección de aguas
La desinfección del agua para el consumo humano ha supuesto uno de los
mayores avances en relación con la salud pública, disminuyendo en gran medida la
incidencia de enfermedades tales como el tifus en un 80%, el cólera en un 90% y la
disentería en un 50% [26]. Entre los desinfectantes empleados habitualmente se
incluyen cloro, ozono, cloraminas y dióxido de cloro; junto a mezclas de los mismos
[27]. También se emplean, aunque en menor medida, la filtración con membranas y
el tratamiento con luz UV [28].
El potencial oxidante de los reactivos desinfectantes no se limita a la
inactivación de los gérmenes, sino que conduce a menudo a distintas reacciones en
paralelo sobre la matriz mineral y orgánica del agua a desinfectar. Estas reacciones
conllevan un consumo adicional del reactivo desinfectante junto con la formación
de los llamados DBPs [29–31] que se originan al interaccionar los desinfectantes
(oxidantes fuertes) con la materia orgánica, los contaminantes antropogénicos y los
bromuros y yoduros, que están presentes de manera natural en la mayoría de las
aguas naturales (ríos, lagos y aguas subterráneas) [26].
El descubrimiento y estudio de los DBPs es muy reciente y comenzó en la
década de los 70. Debido a su bajo coste junto con su alto poder desinfectante, el
cloro ha sido el agente más utilizado para tratar el agua potable. En 1974 J. J. Rook
[32] detalló que durante los procesos de desinfección de agua con cloro se formaba
cloroformo y otros trihalometanos (THMs). Dos años más tarde el National Cancer
Institute de USA relacionaba la presencia de cloroformo con casos de cáncer
surgidos en animales de laboratorio [33].
En 1979 la EPA publicó una resolución que limitaba la presencia de THMs
en agua de bebida a 100 µg L–1. Fue en 1998 cuando se promulgó la Stage 1
17
Capítulo 1
Disinfectants and Disinfection By–Products Rule [34] que bajó el umbral admisible
de concentración de THMs a 80 µg L–1 y reguló el contenido de cinco ácidos
haloacéticos y la presencia de bromato y clorito en agua. La Stage 2 Rule (2006)
completó a la anterior, manteniendo los niveles máximos para ácidos haloacéticos y
THMs, en su conjunto y para cada uno de ellos particularmente [35]. En la Unión
Europea
la
concentración
de
THMs
(cloroformo,
bromodiclorometano,
clorodibromometano y bromoformo) en el agua está regulada por la Directiva
98/83/CE [36] que establece que la concentración total de THMs en el agua de
consumo (sumando los cuatro) no ha de superar los 100–150 µg L–1. De acuerdo
con esta Directiva, en España, el RD 140/2003 [37] establece un límite máximo de
THMs totales de 150 µg L–1 hasta el 2008 y 100 µg L–1 a partir del 2009.
Como consecuencia de estas estrictas regulaciones sobre la presencia de
DBPs, especialmente THMs y ácidos haloacéticos, a lo largo de los últimos años se
ha producido la progresiva sustitución del cloro como principal agente desinfectante
hacia otras alternativas con objeto de reducir la formación de estos DBPs, tales
como cloraminas, dióxido de cloro y ozono; sin embargo, estos tratamientos
conllevan la aparición de otros compuestos [4]. Hasta la fecha se ha descrito la
presencia de hasta 500 DPBs [38] en aguas de consumo humano entre los que se
incluyen haloácidos, halometanos, halofuranos, haloamidas, haloacetonitrilos,
haloacetaldehidos, halocetonas, ácidos carboxilícos, N-nitrosaminas y aldehídos
entre otros. La aparición de cáncer de vejiga, recto y colon, junto a problemas
reproductivos en la población se atribuye a través de numerosos estudios [39,40] a
la exposición a estos compuestos presentes en el agua de bebida.
La aplicación de ozono como agente desinfectante ha sido objeto de
atención durante los últimos años debido a su probada efectividad para oxidar
fármacos y disruptores endocrinos tanto en aguas de consumo como de desecho
(pluviales y fecales) [41]. Ello se debe en parte a su alto potencial redox (2.07 V)
18
Introducción
frente al del cloro (1.36 V) lo que le confiere su conocida capacidad para la
eliminación de olor, sabor y color indeseados en las aguas [42]. A pesar de que la
aplicación de ozono en los sistemas de distribución de agua evita la generación de
THMs manteniendo una eficacia considerable [43], su aplicación es problemática
debido a su inestabilidad: 20–30 minutos a 160 °C [44]. Para obviar este
inconveniente se han adoptado estrategias conjuntas de desinfección combinando
cloración y ozonización. De esta manera se ha comprobado como la aplicación de
ambos agentes reduce hasta en un 28.3% la producción de DBPs que se generaría
en procesos de cloración simple [30].
3.1. El proceso de ozonización
La mayoría de las plantas de tratamiento de aguas residuales generan ozono
mediante la aplicación de una corriente alterna de alto voltaje entre 6 y 20 kV a
través de una brecha entre placas dieléctricas de descarga (efecto corona). En este
dispositivo se encuentra un gas de alimentación, generalmente aire filtrado seco u
oxígeno puro. El ozono formado es inestable y se descompone en oxígeno
diatómico en un período corto de tiempo tras su generación.
Al entrar en contacto con los contaminantes orgánicos presentes en el agua
el ozono actúa a través de la reacción directa de la materia orgánica con el ozono
molecular o mediante la formación de radicales libres, especialmente •OH. La
presencia de estos radicales libres durante los procesos de desinfección de aguas
residuales suele ser baja (10–12 M). El ozono molecular presenta un comportamiento
muy electrófilo, mientras que los radicales •OH actúan de manera menos selectiva
pero con mayor velocidad de reacción. Los hidrocarburos insaturados y aromáticos
unidos a algún grupo nucleófilo (–OH, –NH2) son los principales sustratos que
reaccionan con el ozono mediante la vía directa, mientras que la reacción con los
19
Capítulo 1
radicales •OH tiene como sustratos los hidrocarburos saturados y derivados
halogenados, alcoholes, cetonas y ácidos alifáticos [45]. La acción oxidante del
ozono se puede incrementar con la adición de peróxido de hidrógeno,
produciéndose un aumento de la concentración de radicales •OH [46]. Estos
procesos avanzados de oxidación emplean concentraciones de ozono y de peróxido
de hidrógeno de 5 mg L–1 y 1.8 mg L–1 respectivamente [47], y se han aplicado de
manera eficaz para la eliminación de fármacos [48]. A modo de conclusión se puede
establecer que en el tratamiento de aguas naturales la acción de los radicales juega
un papel dominante en las reacciones de ozonización [49].
El ozono actúa biológicamente provocando la ruptura de las uniones de
carbono–nitrógeno, causando la despolimerización y oxidación protoplasmática,
dando como resultado la desintegración de la pared de la célula (lisis de la célula)
con la salida de componentes esenciales fuera de la misma. Asimismo, se dañan las
enzimas intracelulares junto con las purinas y pirimidinas, componentes de los
ácidos nucleicos.
La materia orgánica natural (NOM) presente en el agua está formada por
ácidos carboxílicos, carbohidratos, aminoácidos y, en mayor medida, por ácidos
húmicos y fúlvicos (30–50% del contenido orgánico total del agua). En su reacción
con el ozono se origina una disminución en las fracciones de mayor peso molecular
y reduce ligeramente en los niveles de carbono orgánico total [49]. Del mismo
modo se reduce la aromaticidad, el color del agua y el valor de absorbancia en la
zona ultravioleta. En presencia de NOM el ozono origina DBPs no–halogenados
tales como aldehídos, cetoácidos y ácidos carboxílicos, siendo los aldehídos los
compuestos en mayor presencia. Sin embargo, se ha documentado la contribución
de procesos de desinfección que emplean otros agentes desinfectantes como
dióxido de cloro a la formación de aldehídos como DBPs, aunque en menor medida
[50]. De manera adicional el ozono puede reaccionar de manera directa o indirecta
20
Introducción
con el bromuro formando DBPs bromados, incluyendo el ión bromato. Si en el
agua contiene materia orgánica y bromo se generan compuestos organobromados.
Las mayores concentraciones de aldehídos se han encontrado en muestras
de agua sometidas a un proceso de ozonización en un medio ligeramente ácido (pH
5.5) [51]. En condiciones alcalinas se produce una disminución en la concentración
de aldehídos, que se puede atribuir a su destrucción mediante reacción con radicales
hidroxilo. Por otra parte, la formación de aldehídos está relacionada de manera
directa con la cantidad de ozono aplicada [50], corroborando varios estudios
experimentales una relación directa entre la concentración de aldehídos y la dosis de
ozono. No obstante, una alta concentración de ozono propicia la destrucción de los
aldehídos, debido a posibles reacciones colaterales competitivas o a su oxidación a
ácidos carboxílicos.
De todos los posibles aldehídos presentes en el agua como DBPs, los
aldehídos alifáticos de bajo peso molecular son los más abundantes y dentro de
éstos el formaldehído, acetaldehído, glioxal y metilglioxal. La presencia de aldehídos
aromáticos es, sin embargo, mucho menor si bien se conocen rutas que establecen
la formación de benzaldehído a partir de la ozonización de moléculas de ácido
fúlvico y estireno [52,53].
21
Capítulo 1
4. Metodologías analíticas para la determinación de
aldehídos en aguas
En esta sección se describe de forma sistemática las metodologías
propuestas hasta la fecha para la determinación de aldehídos aromáticos y alifáticos
de bajo peso molecular en muestras de agua. Para su descripción, el estudio se ha
estructurado siguiendo el esquema general del proceso analítico, por lo que se han
dispuesto los distintos epígrafes según las sucesivas etapas seguidas para extraer la
información analítica requerida de la muestra de interés.
A la hora de abordar la descripción de las diferentes metodologías para la
determinación de aldehídos en muestras de agua, resulta necesario señalar que la
mayoría de las publicaciones se refieren a la determinación de estos compuestos
carbonílicos en muestras de aire [29,54–58]; existen muy pocas investigaciones
referidas a su determinación en muestras de agua [59–64] a pesar que en los últimos
años se ha incrementado significativamente el interés por su estudio en este tipo de
muestras. En la mayoría de las investigaciones que incluyen aldehídos aromáticos de
bajo peso molecular (generalmente sólo benzaldehído), éstos aparecen como un
hallazgo adicional a los aldehídos alifáticos, cuya determinación constituye el
verdadero motivo de la investigación. Tal y como se ha indicado anteriormente, los
aldehídos alifáticos de bajo peso molecular formaldehído, acetaldehído,
propionaldehído, butiraldehído, valeraldehído, glioxal y metilglioxal se encuentran
de manera mayoritaria en agua [65] en concentraciones de 5 a 20 µg L–1 [66].
Los aldehídos aromáticos de bajo peso molecular, por su naturaleza polar y
ausencia de grupos cromóforos (el carácter cromóforo del grupo benceno es
insuficiente para proporcionar un nivel de sensibilidad que permita su
determinación a bajos niveles de concentración) o fluoróforos en su estructura,
presentan las mismas dificultades en su determinación directa que los aldehídos
22
Introducción
alifáticos. Además, en los aldehídos aromáticos la presencia del anillo aromático
actuando como agente desactivante hace que la reactividad del grupo carbonilo sea
menor de cara a la reacción con el reactivo derivatizante. Por esta razón la
determinación de aldehídos aromáticos de manera directa es muy complicada y por
lo tanto no existen referencias de investigaciones que hayan abordado su
determinación sin llevar a cabo las etapas previas de derivatización y/o pre–
concentración necesarias.
La mayor parte de las investigaciones desarrolladas para la determinación de
estos compuestos carbonílicos aplican en última instancia la metodología propuesta
a su determinación en muestras reales con el objeto de evaluar la utilidad del
procedimiento analítico propuesto. En concreto, los aldehídos alifáticos y
aromáticos de bajo peso molecular se han determinado en muestras de agua con
distintos orígenes: pluvial [67,68], cauces naturales [69–71], potable [60,72–74], de
piscina [62,64,75–77], ozonizada [61,72], mineral embotellada [71,78–80] o residual
[70].
En la Figura 1 se detalla la distribución de los diferentes tipos de agua
analizadas en las investigaciones aplicadas a muestras reales; más de la mitad de las
muestras en las que se han detectado la presencia de estos analitos se refieren a agua
potable (19%), agua mineral envasada (17%) o bien procedente de cauces naturales
(18%). No obstante muchas de las publicaciones referenciadas en esta Memoria
abordan el estudio de muestras de agua de distintos orígenes [81–85], justificando la
presencia cualitativa y cuantitativa de los diferentes analitos según la tipología de las
mismas.
23
Capítulo 1
Residual
3%
Otros
8%
Lluvia
10%
Ozonizada
14%
Piscina
8%
Cauces
naturales
18%
Potable
20%
Mineral
17%
Figura 1 Distribución de la procedencia de las muestras de agua en las que se ha
confirmado la presencia de aldehídos según las publicaciones consultadas.
4.1. Métodos oficiales para la determinación de aldehídos
Existen dos métodos oficiales publicados por la EPA para la determinación
de compuestos carbonílicos. El Método EPA 8315A [6], publicado en 1996,
contiene las directrices para determinación de estos compuestos en diferentes
matrices mediante cromatografía de líquidos con detección UV/Vis. El método se
compone de dos procedimientos, incluyendo todos los aspectos prácticos del
análisis desde la extracción de los compuestos carbonílicos hasta su cuantificación.
El Procedimiento 1 es apropiado para el análisis de muestras de agua, incluidas las
residuales, de suelo y de gases de distintas atmósferas según el denominado Método
24
Introducción
0011, mientras que el Procedimiento 2 está indicado para el análisis de muestras de
aire recogidas en entornos cerrados tal como se detalla en el Método 0100. La
relación de analitos a determinar difiere según el procedimiento empleado. Por su
parte, el Método EPA 556.1 [86], publicado en 1999, está enfocado a la
determinación de estos compuestos carbonílicos en agua de bebida mediante
cromatografía de gases con detección mediante captura de electrones (GC–ECD).
En el caso de muestras de agua, el Método EPA 8315A [6] requiere una
etapa de derivatización en batch con 2,4-dinitrofenilhidracina (DNPH) durante 1 h a
40 ºC acidificando 100 mL de muestra a pH 4 para favorecer la reacción. A
continuación se pasa la muestra por un cartucho de C18 en el cual se retienen las
hidrazonas formadas. La elución de los derivados retenidos en el cartucho se realiza
con 10 mL de acetonitrilo y posteriormente se procede al análisis cromatográfico. Si
es necesario elevar el factor de preconcentración, el extracto orgánico se puede
llevar a sequedad y reconstituir posteriormente en una mezcla agua:acetonitrilo.
Algunos de los inconvenientes que presenta este método son las interferencias que
pueden provocar el exceso de DNPH, la escasa selectividad del C 18, ya que puede
retener otros compuestos hidrofóbicos presentes en el agua, y el elevado consumo
de disolvente orgánico.
El Método EPA 556.1 [86] se basa en un procedimiento similar utilizando
como
agente
derivatizante
la
o-(2,3,4,5,6-pentafluorobencil)-hidroxilamina
(PFBHA). La reacción de derivatización se lleva a cabo también en la modalidad
batch durante 2 horas a 35 ºC tras ajustar 10 mL de muestra a pH 4. Una vez
enfriada la mezcla a temperatura ambiente se añaden unas gotas de ácido sulfúrico
concentrado para prevenir la extracción del exceso del reactivo derivatizante en la
etapa posterior de extracción de los derivados con 4 mL de hexano. Tras el proceso
de extracción líquido–líquido (liquid–liquid extraction, LLE), se transfiere la capa de
hexano a un vial que contiene 3 mL de ácido sulfúrico 0.4 mol L–1 y se lleva a cabo
25
Capítulo 1
de nuevo el proceso de extracción con objeto de reducir el posible exceso de
reactivo derivatizante y otras interferencias. La fase de hexano resultante se seca en
un vial con unos 10 mg de sulfato de sodio y una alícuota se inyecta en el
cromatógrafo de gases. Al igual que en el método anterior, existen también algunas
dificultades en esta determinación siendo la más resaltable la formación de dos
isómeros –Z y E– de las oximas correspondientes a los compuestos carbonílicos y
de cuatro isómeros en el caso de los dicarbonílicos, tales como glioxal y metilglioxal.
La formación de estos isómeros impide en algunos casos su completa resolución
por GC [87], al igual que cuando se utiliza este técnica cromatográfica para la
separación de derivados formados con el DNPH [88]. Además, y como en el
Método EPA 8315A [6], es necesario un elevado tiempo de reacción, el proceso de
extracción de las oximas es tedioso requiriendo un importante consumo de
disolventes.
Por todo ello, las alternativas recogidas en la bibliografía pretenden obviar
estos inconvenientes con el diseño de métodos más selectivos, precisos, de bajo
coste, rápidos y simples.
4.2. Derivatización de compuestos carbonílicos
El proceso de derivatización consiste en la transformación de un compuesto
químico en otro similar (“derivado”) con nuevas propiedades. Normalmente la
derivatización se realiza con el objetivo de facilitar o permitir la determinación de un
analito modificando sus características espectroscópicas, o bien para alterar sus
propiedades físicas como volatilidad o estabilidad térmica.
26
Introducción
Como ya se ha indicado, la determinación directa de aldehídos de bajo peso
molecular es complicada a causa de su alta polaridad, inestabilidad química, elevada
volatilidad y ausencia de un grupo cromóforo o fluoróforo en su estructura química.
Por tanto es necesaria una reacción de derivatización previa a su separación y
determinación por técnicas cromatográficas y electroforéticas en muestras de agua.
En cromatografía de líquidos (LC) y electroforesis capilar (CE), la derivatización
permite mejorar la determinación de los analitos mediante la formación de
derivados con grupos cromóforos y fluoróforos. Junto a esto, también permite
incrementar la selectividad en el proceso de extracción de los analitos, como
derivados, en la muestra a analizar, lo que contribuye a la eliminación de posibles
interferentes, siendo este aspecto especialmente útil en el análisis de las muestras
más complejas. Por otro lado los compuestos polares son difíciles de separar por
GC debido a la baja volatilidad que le confieren los grupos funcionales con alta
tendencia a formar puentes de hidrógeno (carboxilo, hidroxilo, tiol y amino), por lo
que la derivatización puede facilitar el proceso de separación cromatográfica.
En la Figura 2 se muestra la distribución relativa de los distintos reactivos
empleados en la bibliografía para derivatizar aldehídos de bajo peso molecular.
Como se observa, los reactivos derivatizantes más empleados (63% de las citas) son
la PFBHA y la DNPH, indicados para la separación de los derivados formados
–oximas e hidrazonas– por GC y LC, respectivamente. También se ha utilizado el
reactivo 5-dimetilaminonaftaleno-1-sulfohidracina (dansilhidracina, DNSH) en LC
aunque en menor medida. Otros compuestos no comerciales como el 5-cloro2,2,3,3,4,4,5,5-octafluor-1-pentil cloroformiato [72] y la 4-N´N´-dimetilamino-6-(4´metoxi-1´-naftil)-1,3,5-triazina-2-hidracina [59] han sido utilizados aunque muy
escasamente.
27
Capítulo 1
Otros
26%
DNPH
29%
DNSH
11%
PFBHA
34%
Figura 2 Distribución de los agentes derivatizantes empleados en la determinación de
aldehídos en muestras de agua.
La alta reactividad y selectividad del 2,4-dinitrofenilhidracina (DNPH) le
confiere un gran potencial como reactivo derivatizante de compuestos carbonílicos
(aldehídos y cetonas) así como para su determinación en matrices acuosas y otras
más complejas de distinta naturaleza [89–92]. Sintetizado a partir de la reacción de
sulfato de hidracina y 2,4-dinitroclorobenceno por Purgotti en 1894 [93], este
reactivo recibe el nombre de reactivo de Brady [94] cuando se utiliza disuelto en una
mezcla de metanol y ácido sulfúrico. La formación de un precipitado rojo o
amarillo–rojizo en presencia de compuestos carbonílicos indica la existencia de
estos analitos en la matriz acuosa estudiada. La selectividad que presenta la DNPH
se sustenta en que no reacciona con otros compuestos que contienen grupos
carbonílicos, como amidas, ácidos carboxílicos y ésteres, debido a que estos
compuestos presentan una mayor estabilidad frente a la reacción de adición
nucleófilica (ver mecanismo de reacción) implicada en la formación de los
correspondientes derivados.
28
Introducción
La o-2,3,4,5,6-pentafluorobencilhidroxilamina (PFBHA) es unos de los
reactivos más efectivos para la derivatización de aldehídos cuando la determinación
se lleva a cabo mediante GC con diferentes sistemas de detección, aunque también
se ha utilizado esporádicamente la LC para la separación de los derivados [60]. Las
respectivas oximas poseen carácter apolar y se pueden extraer con disolventes
orgánicos, mostrando una alta sensibilidad cuando la determinación se realiza
mediante GC–ECD [95–97] debido a la afinidad de este detector por los
compuestos halogenados como son los PFBHA–derivados. En cambio, la
sensibilidad obtenida al emplear GC con espectrometría de masas (GC–MS) es
ligeramente inferior [95,98,99].
La 1,5-dansilhidracina (DNSH) forma derivados luminiscentes que
permiten la determinación de aldehídos presentes en muestras de agua aunque en
menor extensión que haciendo uso de la DNPH o PFBHA. De los trabajos
consultados sólo dos de ellos [67,100] incluyen la determinación de aldehídos
aromáticos,
en
concreto
benzaldehído,
en
muestras
de
agua
ya
que
fundamentalmente se refieren a aldehídos alifáticos [75] y mezclas de aldehídos
alifáticos y aromáticos en otras matrices [101,102]. Las hidrazonas se separan
generalmente por LC y se pueden determinar haciendo uso de diferentes sistemas
de detección, como por ejemplo UV/Vis [103], fluorescencia molecular [58] o
quimioluminiscencia [75]. Esta última alternativa muestra excelentes resultados en
términos de sensibilidad.
Dado que los tres reactivos más utilizados para la derivatización de
aldehídos (DNPH, PFBHA y DNSH) presentan un grupo amino o hidroxil–amino
terminal, se puede establecer un mecanismo general de derivatización de estos
compuestos carbonílicos para la formación de las correspondientes hidrazonas u
oximas, tal como se muestra en la Figura 3.
29
Capítulo 1
1. Protonación del grupo carbonilo
H
H
O
+
C
R1
H
O
R2
H
+
O
+
+
C
- H2O
H
O
R1
C
R2
R1
R2
compuesto
carbonílico
2. Adición nucleofílica
H
H
H
O
H
+
C
R1
H
O
R1 C
N
H
R2
+
H
lenta
X
R2
O
N
H
+
O
H
H
H
R1 C
R2
+
N
X
carbocatión
carbinolamina
H
+
H
N
reactivo derivatizante
X
H
3. Eliminación de agua y formación del derivado
H
H
O
- H2O
rápida
+
H
X
H
R1 C
N
R2
+
- H2O
N
rápida
C
R1
X
H
X
O
H
H
R2
R2
N
C
+
H
O
NH2
H3C
N
CH3
F
CH2
F
X=
X=
O
NH2
NO 2
F
O 2N
O
S
O
F
F
NH
H2N
Figura 3
30
+
H
R1
derivado
HN
O
+
H
H
X
+
H
Esquema general del mecanismo de reacción de derivatización de aldehídos.
Introducción
Recientemente se ha investigado el mecanismo de reacción en medio básico,
y en concreto para el DNPH [104]. En este caso no tiene lugar la protonación del
grupo carbonilo y el ataque nucleofílico al carbono del grupo carbonílico se produce
como consecuencia de su carga parcial positiva, causada por la mayor
electronegatividad del átomo de oxígeno de este grupo. Esto origina que el
intermedio formado (carbinolamina) esté en equilibrio con su forma zwitterionica. A
partir de este punto se produce la reacción entre el ión hidroxilo y el átomo de
nitrógeno terminal de la carbinolamina dando lugar al anión carbinolhidracilo tras
su desprotonación, el cual tras la pérdida de un ión hidroxilo origina el
correspondiente derivado.
CH3
H3C
N
H3C
CH3
N
R1
+ O
C
R2
O
S
O
- H2 O
O
S
O
C
HN
1,5-dansilhidracina
1,5-dansilhidrazona
+ H2 O
+ H2 O
H
H
N
H
R1
R2
NH2
-
NH
N
N
N
- H2N
H
H3C
N
CH3
O
S
C
R1
R2
O
OH
ácido 1,5-dansilsulfónico
Figura 4 Esquema de las reacciones de derivatización y degradación producidas en la
formación de DNSH–hidrazonas.
31
Capítulo 1
Finalmente se ha de comentar la gran importancia que presenta el ajuste de
las condiciones experimentales en el caso de la formación de los derivados con la
DNSH. Además de tener que desarrollar la reacción en medio ácido es necesario
controlar el contenido de agua en el medio de reacción ya que ésta puede contribuir
a la degradación del propio reactivo y de sus derivados formándose en ambos casos
ácido dansilsulfónico [100] (ver Figura 4), por lo que disminuye de forma
significativa el rendimiento de la reacción de derivatización.
Conforme al mecanismo de reacción indicado, la formación de hidrazonas
con la DNPH se produce en medio ácido ya que en estas condiciones la
protonación del grupo carbonílico está favorecida. Así, el Método EPA 8315A [6]
establece que el pH de la muestra se ha de ajustar a pH 3 mediante la adición de un
buffer de citrato de sodio. Este ajuste de pH se hace a valores aún más bajos (pH =
2.0) en otras investigaciones [2]. En otros casos no es necesario ajustar el pH para el
desarrollo de la reacción de derivatización ya que éste viene dado por la propia
disolución del reactivo derivatizante preparada en medio ácido. Así, en 1990 Kieber
y Mopper [105] proponen la preparación de la disolución de DNPH en una mezcla
de ácido clorhídrico (~12 M), agua y acetonitrilo en proporción 2:5:1 (v/v/v),
procedimiento generalmente aceptado y adoptado por distintos autores
[64,76,81,84,90,106]. En otros casos, para preparar la disolución de reactivo
derivatizante la DNPH se disuelve inicialmente en ácido sulfúrico concentrado para
posteriormente añadir agua y etanol, resultado una proporción final en la mezcla de
2:3:10 (v/v/v). Este procedimiento propuesto por Grosjean y col. [107] ha sido
utilizado por Richardson y col. en diversas investigaciones sobre esta temática [2,3].
El tiempo de derivatización es un parámetro de gran interés analítico con
objeto de lograr una mayor eficiencia en el proceso. Generalmente la derivatización
requiere una hora [2,6,64], aunque existen referencias sobre tiempos de reacción
inferiores que proporcionan niveles aceptables de sensibilidad para aldehídos
32
Introducción
alifáticos [84,108]. Sin embargo, varios autores coinciden en que es necesario más
tiempo (hasta 24 horas) para conseguir la derivatización de algunos aldehídos, tal
como muestran Zwiener y col. [64] en un interesante estudio. Los resultados
concluyen que 1 h de reacción es suficiente para aldehídos alifáticos mientras que
los aldehídos hidroxilados y dicarbonílicos requieren más de 12 h. Por ello, se
propone un tiempo de reacción de 24 h con objeto de asegurar la completa
derivatización de todos los posibles compuestos carbonílicos presentes en la
muestra a analizar. Generalmente la reacción de derivatización se lleva a cabo a
temperatura ambiente manteniendo una agitación constante para favorecer la
formación de las hidrazonas [109], aunque también se ha propuesto en algunos
casos calentar a 40–60 ºC [6,108].
Al igual que con la DNPH, la derivatización de aldehídos con PFBHA se
desarrolla a pH ácido, en concreto y según se indica en el Método EPA 556.1 [86],
la muestra se ajusta a pH ~ 4 con hidrogenoftalato de potasio, ácido clorhídrico o
sulfúrico; aunque también se puede trabajar a valores superiores de acidez (pH =
1.1) [62]. Sin embargo, existe un consenso en la bibliografía sobre la preparación de
las disoluciones de trabajo de la PFBHA: se preparan diariamente [77,86] en agua
ultrapura a concentraciones cercanas a 15 mg mL–1, tal y como propone el Método
EPA 556.1 [86]. La reacción se produce en la oscuridad con tiempos de reacción
que oscilan entre 1 [83] y 12 h [77] y a una temperatura del orden de 35 C. Se ha de
indicar que tras el proceso de derivatización es recomendable añadir unas gotas de
ácido sulfúrico concentrado a la mezcla para evitar posibles interferencias en la
posterior separación cromatográfica debidas al exceso de reactivo derivatizante
[63,77].
La derivatización de aldehídos con DNSH se favorece, como en los casos
anteriores, mediante catálisis ácida ajustando el pH a valores comprendidos entre
3.0 y 4.5 [75,110], aunque existe la posibilidad de que este pH ácido venga
33
Capítulo 1
proporcionado por la propia disolución de trabajo de DNSH (pH = 3.0 [103]). Los
tiempos de reacción están comprendidos entre 25 min [103] hasta 24 h [100] y la
reacción de derivatización se desarrolla a temperatura ambiente [75,110] o bien
calentando la muestra en un baño de agua a 50 °C [67]. La señal analítica de los
DNSH–derivados puede disminuir ligeramente si se excede el tiempo óptimo de
derivatización. La presencia de agua juega un papel importante en la reacción de
derivatización, debido a que puede contribuir a la degradación tanto del reactivo
como de los derivados. Se puede establecer por tanto que la reacción de la
formación de los DNSH–derivados está determinada por un balance entre las
reacciones de derivatización y de degradación [100]. Por ello es necesario un control
estricto de la presencia de agua y de la concentración de ácido para obtener
resultados reproducibles. Las disoluciones de trabajo de DNSH se preparan en
acetonitrilo [75,100,110], en una mezcla metanol:agua (80:20) [103] o en
isopropanol [67]. La elección del disolvente se realiza según los requerimientos
analíticos [67], esto es, con objeto de conseguir la máxima relación señal/ruido:
mínima señal del blanco (debida al exceso de DNSH) y máxima sensibilidad para los
analitos.
Finalmente, se han de reseñar otros aspectos prácticos relacionados con la
posible contaminación de las disoluciones de trabajo por aldehídos presentes en la
atmósfera del laboratorio así como las derivadas de la pureza de disolventes y
reactivos analíticos utilizados. Se exponen a continuación estas posibles fuentes de
contaminación:
– La presencia de formaldehído en la atmósfera del laboratorio puede
provocar su reacción con los reactivos derivatizantes originando errores por
exceso en el análisis de las muestras. Para evitar este problema se
recomienda minimizar el contacto de las disoluciones de estos reactivos con
aire del laboratorio.
34
Introducción
– Se debe evitar la posible presencia de etanol en las muestras ya que éste
dificulta la determinación de acetaldehído a concentraciones inferiores a 500
µg L–1. Por otra parte, el lavado de material de vidrio con acetona puede
originar interferencias con la DNPH, por lo que conviene evitar su uso.
– Se ha de utilizar agua purificada libre de compuestos carbonílicos, y en
especial de formaldehído y acetaldehído, dado que puede ser relevante su
presencia en el agua empleada en el laboratorio. Se propone la destilación
del agua con permanganato potásico y la exposición a la luz UV como la
manera más eficaz para obtener agua purificada libre de aldehídos.
– Por otro lado, aunque no es común, la DNPH se puede someter a un
proceso de recristalización en acetonitrilo [6,105] o en una mezcla
acetonitrilo/agua [109] si se sospecha la presencia de impurezas.
4.3. Preparación de las muestras para su análisis
Tal y como se ha comentado en anteriores apartados, la determinación
directa de aldehídos es complicada por técnicas cromatográficas y electroforéticas
debido fundamentalmente a la elevada reactividad, volatilidad y ausencia de grupos
cromóforos y fluoróforos en la molécula de estos compuestos. Dadas estas
características, las metodologías propuestas para la determinación de aldehídos
contemplan, en la gran mayoría de los casos, una etapa que implica una técnica de
separación (técnica de extracción) con objeto de conseguir uno o varios de los
siguientes fines: (i) eliminar las interferencias debidas a la matriz de la muestra (clean
up); (ii) preconcentrar los analitos (su concentración es generalmente baja) para
posibilitar su determinación con el sistema de detección cromatográfico; y (iii)
compatibilizar el análisis de las muestras con el sistema de separación/detección
mediante el cambio del medio en el que se encuentran los analitos de interés.
35
Capítulo 1
La etapa de extracción implica la transferencia de uno o más analitos desde
la matriz en la que se encuentran, la muestra, hasta otra fase adecuada para su
determinación. En general la muestra puede ser sólida, líquida o gaseosa, mientras
que el extractante es generalmente líquido ó sólido y de forma menos habitual un
gas o un fluido supercrítico [111]. Dado que en esta Memoria el problema analítico
consiste fundamentalmente en la determinación de aldehídos en muestras de agua,
las técnicas de extracción más utilizadas son la clásica LLE y la extracción en fase
sólida (solid phase extraction, SPE) como alternativa. El objetivo prioritario de las
mismas es la extracción y/o preconcentración de los derivados ya formados por los
aldehídos con los agentes derivatizantes descritos en el apartado anterior.
Recientemente se han propuesto sistemas de extracción que llevan a cabo
simultáneamente los procesos de derivatización y extracción con las inherentes
ventajas que ello reporta.
En este contexto, las técnicas de microextracción tienen cada vez más
relevancia de acuerdo con las nuevas tendencias de la Química Analítica:
automatización, miniaturización y simplificación [112]. Además, el uso de estas
técnicas de microextracción evita los conocidos inconvenientes que presentan las
técnicas de LLE y SPE con relación al tiempo requerido para su desarrollo, elevado
consumo de muestras y disolventes así como a su gran impacto ambiental y
peligrosidad para el operador dada la toxicidad de los disolventes empleados. El
desarrollo de estos “métodos limpios” se debe a una toma de conciencia
ambientalista cada vez mayor lo cual está en concordancia con los
pronunciamientos cada vez más asumidos de la denominada “Química Verde”
[113,114]. A continuación, se describe de forma detallada el uso de cada una de
estas técnicas, incluyendo tipos de extractantes orgánicos y materiales sorbentes así
como otros aspectos relacionados con el procedimiento experimental para el
desarrollo de las mismas.
36
Introducción
4.3.1. Extracción en fase líquida
La extracción líquido–líquido (LLE) es quizá la técnica más antigua
utilizada para la extracción de analitos de matrices acuosas. Se basa en la
distribución de una o más especies entre dos líquidos inmiscibles o prácticamente
inmiscibles, donde generalmente una de las fases es acuosa y la otra un disolvente
orgánico. El campo de aplicación de la LLE en la Química Analítica es muy amplio;
se emplea no sólo como técnica de separación de especies, sino también para llevar
a cabo procesos de preconcentración de las mismas, previos a su determinación,
cuando el método analítico utilizado no presenta la sensibilidad suficiente para su
cuantificación [111]. Conforme a lo indicado, como principales inconvenientes se
pueden reseñar el elevado consumo de disolventes orgánicos y el tiempo necesario
para realizar el proceso de extracción, ya que a veces son necesarias varias etapas de
extracción para conseguir rendimientos cuantitativos.
Cuando se usa PFBHA como reactivo derivatizante de los aldehídos
(determinación mediante GC) se suele emplear hexano para extraer las oximas
formadas tras la reacción de derivatización [5,43,77,83,95]. Adicionalmente se lleva a
cabo una etapa de lavado con ácido del extracto orgánico que contiene los analitos
[77,83,86] con el objeto de eliminar el exceso de reactivo derivatizante y otros
interferentes, purificando de esta manera el extracto final. En último lugar se
procede el secado de este extracto orgánico con sales anhidras [5,77,95] lo cual es
imprescindible al trabajar con GC. Las extracciones se realizan mediante agitación
manual [5,95] o automática [77] lo que conlleva que el tiempo de extracción varíe
entre 30 seg [95] y 1 h [77], según el caso.
Aunque la LLE también se emplea para la extracción de los derivados
formados con la DNPH para su posterior determinación por LC, no está tan
extendido su uso como otras técnicas de extracción y microextracción. El Método
EPA 8315A [6] en su Procedimiento 1 propone el empleo de diclorometano para
37
Capítulo 1
extraer los DNPH–derivados formados. Se realiza una extracción múltiple con
dicho disolvente, se seca el extracto de diclorometano con sulfato de sodio anhidro,
se lleva a sequedad en un rotavapor y finalmente se reconstituye en un pequeño
volumen de acetonitrilo con objeto de favorecer su compatibilidad con la fase móvil
empleada en la posterior separación cromatográfica. Esta estrategia ha sido también
adoptada por otros investigadores para la determinación de aldehídos en agua
mineral [79].
La factores de preconcentración alcanzados (relación fase acuosa/fase
orgánica) están comprendidos entre 5:1 [86,95] y 20:1 [83] para determinaciones
mediante GC. Las diversas extracciones que se realizan cuando se emplea DNPH–
LC (generalmente 2–3 etapas de extracción con 25–20 mL, respectivamente)
disminuyen este factor a valores del orden de 2:1 [6,79], aunque finalmente se
obtienen valores similares (20:1, [6]) o incluso superiores (50:1, [79]) a los ya
indicados para la determinación de aldehídos mediante PFBHA–GC cuando el
extracto se lleva a sequedad y se reconstituye en acetonitrilo. Una vez obtenidos los
extractos, éstos se pueden almacenar antes de su análisis a 4 °C hasta 14 días [5].
La MICROEXTRACCIÓN EN FASE LÍQUIDA (liquid phase microextraction,
LPME) se desarrolló con la finalidad de evitar o reducir lo más posible los
problemas ya comentados que presenta la LLE convencional. La LPME es una
técnica de pretratamiento de muestra en la que sólo se requieren unos pocos
microlitros de extractante para separar a los analitos de la muestra. Se introdujo a
mediados de los años 90 por Dasgupta [115] y, desde sus orígenes, su evolución ha
continuado originando una gran variedad de alternativas que se han popularizado
muy rápidamente debido a su bajo coste, facilidad de uso y empleo de volúmenes
muy reducidos de disolvente orgánico [116–118].
De las diferentes alternativas de la técnica LPME que se han propuesto
hasta la fecha es la microextracción en una gota (single drop microextraction, SDME)
38
Introducción
la que más se ha utilizado para el pretratamiento de las muestras de agua previo a la
determinación de aldehídos. En su propuesta inicial por Jeannot y Cantwell [119] en
1996 se emplea una microgota (8 µL de n-octanol) suspendida en el extremo de un
tubo de teflón, el cual se introduce en la muestra de agua agitada magnéticamente.
Su uso más generalizado responde a la modificación propuesta casi de forma
simultánea por Jeannot y Cantwell [120] y He y Lee [121] en la que se emplea una
microjeringa convencional como sistema de extracción. De las diferentes
modalidades existentes, es la de espacio de cabeza (HS–SDME) la que se ha
empleado en la determinación de aldehídos en muestras de agua produciéndose la
derivatización de los mismos in situ en la propia gota.
La introducción de esta técnica en el campo de la determinación de
aldehídos se debe a Deng y col. [122]. En este trabajo la derivatización se realiza in
situ en una microgota de 1.0 µL de decano que contiene el reactivo PFBHA y que
permanece suspendida de la punta de una microjeringa en el espacio de cabeza del
vial. La elección del extractante es un aspecto fundamental en esta técnica. Este
disolvente debe tener baja volatilidad y alta presión de vapor y eficiencia en la
extracción de los analitos [122]. Fiamegos y Stalikas [123] han desarrollado un
estudio relativo a la influencia de parámetros cinéticos y de difusión sobre el
mecanismo del proceso de extracción de diferentes aldehídos con 2,4,6triclorofenilhidracina (TCPH) en HS–SDME. Experimentalmente, la extracción de
los aldehídos presentes en 2 mL de muestra de agua se lleva a cabo con una gota de
2 µL de pentadecano que contiene el reactivo derivatizante. Los tiempos de
extracción son en ambos trabajos inferiores a 4 min, durante los cuales la muestra se
agita mecánicamente (550 rpm [123] y 700 rpm [122]).
En las investigaciones reseñadas, la HS–SDME se emplea como etapa
previa a la determinación de los derivados de aldehídos por GC, ya que los
disolventes empleados para la extracción son incompatibles con las fases móviles
39
Capítulo 1
típicamente empleadas en LC. Pillai y col. [69] han desarrollado un método HS–
SDME/LC en el que la derivatización se produce in situ en una microgota de 1butanol que contiene el reactivo derivatizante DNPH. En este caso los autores
proponen una interesante novedad consistente en la colocación de un pequeño tubo
de PFTE biselado en la punta de la aguja, lo que conlleva importantes ventajas: (i)
aumentar el volumen de la microgota hasta los 7 µL; (ii) incrementar el tiempo de
exposición hasta los 15 min; y (iii) facilitar la retracción de la gota en la aguja. En
resumen se puede indicar que la HS–SDME es una técnica versátil, sin problemas
de carry over y capaz de proporcionar bajos límites de detección.
La técnica de microextracción líquido–líquido dispersiva (dispersive
liquid–liquid microextraction, DLLME) fue desarrollada por Assadi y col. [124] como
una nueva modalidad de la LPME. En ella, la extracción se asiste químicamente
utilizando un disolvente externo que induce la dispersión del extractante en forma
de gotas minúsculas en el seno de la muestra. Tras un proceso de centrifugación se
consigue romper la dispersión separándose el extractante que contiene los analitos.
Sólo se ha encontrado un precedente del uso de esta técnica para la determinación
de aldehídos en muestras de agua [70]. En el procedimiento recomendado, se
adicionan en un vial de 10 mL el reactivo derivatizante PFBHA, agente dispersante
(1 mL de etanol), extractante (20 µL de clorobenceno) y 5 mL de la muestra acuosa.
El empleo de ultrasonidos durante 2 min favorece el desarrollo simultáneo de las
etapas de derivatización, extracción y preconcentración de los derivados en la
dispersión, los cuales se separan en la fase orgánica inmiscible tras un proceso de
centrifugación. Posteriormente se introduce 1 µL de esta fase en el inyector del
GC–MS para su análisis
El efecto salting out o efecto salino es de gran importancia en los procesos de
LLE dado que, como es conocido, la presencia de electrolitos disminuye la
“actividad del agua” y por tanto se favorece el proceso de separación de fases así
40
Introducción
como la extracción de los analitos a la fase orgánica inmiscible. El empleo de este
efecto salino constituye el fundamento de la técnica de microextracción líquido–
líquido asistida por sales (salt–assisted liquid–liquid microextraction, SALLME)
utilizada para la determinación de compuestos carbonílicos, entre ellos aldehídos, en
aguas por LC previa derivatización con DNPH [108]. El proceso de extracción se
lleva a cabo tras la derivatización de los aldehídos en medio ácido ( 3.5 mL de
muestra) a 60 C durante 5 min mediante la adición de 500 µL de acetonitrilo. Dado
que este disolvente es miscible con el agua, la separación de fases se consigue
saturando la disolución con sulfato de amonio lo que origina una fase orgánica con
un volumen aproximado de 150 µL. Posteriormente 10 µL de este extracto se
inyecta en el LC con detección por diodos en fila (LC–DAD) para su análisis. En
comparación con otras alternativas, esta metodología es más adecuada para la
determinación de aldehídos por LC dada la compatibilidad del disolvente orgánico
utilizado en el proceso de extracción con este sistema cromatográfico.
Recientemente, se ha propuesto por nuestro Grupo de Investigación una
técnica de microextracción líquido–líquido (micro liquid–liquid extraction, MLLE)
acoplada a un sistema GC–MS que permite el empleo de elevados volúmenes de
inyección en conjunción con un inyector de temperatura programable (LVI–PTV).
Esta metodología se ha utilizado como alternativa al método EPA 556.1 [86]
(emplea LLE para la determinación de aldehídos aromáticos y alifáticos en muestras
de agua) introduciendo varias innovaciones en el ámbito de la miniaturización y de
la eliminación de residuos orgánicos, sin menoscabo de pérdida de sensibilidad y
robustez [62]. El método MLLE propuesto se basa en tomar 9 mL de agua en viales
de 10 mL, añadir el estándar interno, reactivo derivatizante PFBHA y 0.2 mL de nhexano como extractante. En el método estándar de la EPA el proceso de
derivatización se realiza calentando el vial a 35 ºC durante 2 horas ajustando la
muestra a pH 4 y además se requieren etapas de limpieza del extracto orgánico (4
41
Capítulo 1
mL de n-hexano) para eliminar el exceso de reactivo derivatizador. En el método
MLLE la muestra acuosa se ajusta a pH 1.1 lo que favorece la cinética de la reacción
de derivatización de los aldehídos y evita las etapas de limpieza asociadas a la
eliminación del exceso de PFBHA; se añaden 4 g de sulfato de magnesio como
agente salting–out que origina además el calentamiento del vial de forma espontánea
a 60 ºC debido al proceso de disolución exotérmica de la sal. En estas condiciones
los procesos de derivatización y extracción de las correspondientes oximas se
realizan de forma simultánea en tan sólo 1 min. Otra ventaja que aporta el método
propuesto es que el extracto resultante (50 µL) se inyecta directamente en el
inyector LVI–PTV, por lo tanto prácticamente no se originan residuos y realmente
se puede incluir la metodología propuesta dentro de las técnicas que no consumen
disolvente.
4.3.2. Extracción en fase sólida
El empleo de la extracción en fase sólida (solid phase extraction, SPE) en el
laboratorio analítico se ha incrementado considerablemente en los últimos años
constituyendo una importante alternativa a la LLE. Durante el proceso de SPE la
muestra se pasa a través de una fase sólida que retiene los analitos de interés (se
separan de la matriz de la muestra incrementándose la selectividad), siendo eluídos
posteriormente con un pequeño volumen de disolvente orgánico (se mejora la
sensibilidad en su determinación). De este modo se obtienen extractos limpios de
manera muy eficiente, simple y rápida [111]. El auge de la SPE ha contribuido
notablemente al desarrollo de materiales sorbentes con capacidad de retención
reversible de los compuestos, lo que ha permitido la extracción de una gran
variedad de especies presentes en una matriz orgánica o acuosa. Además, la técnica
de SPE se puede desarrollar en diferentes soportes tal como cartuchos y discos así
como incorporada a dispositivos de flujo automatizados, a veces conectados on line
42
Introducción
con el propio sistema cromatográfico, lo que le confiere una gran versatilidad y
capacidad de adaptación al problema analítico planteado.
En el contexto de la determinación de aldehídos en muestras de agua, la
técnica de SPE ha permitido conocer la presencia de algunos de ellos en estas
matrices debido a los elevados factores de preconcentración que se alcanzan. Si bien
hay que indicar que el proceso de SPE se debe realizar tras la etapa de derivatización
de estos compuestos carbonílicos ya que su elevada polaridad impide conseguir
resultados cuantitativos en el proceso de extracción. En todos los trabajos que
hacen uso de la técnica de SPE para la determinación de aldehídos en agua se ha
empleado DNPH como reactivo derivatizante ya que presenta mejores prestaciones
que el PFBHA para compuestos con un mayor grado de polaridad, como por
ejemplo aldehídos hidroxilados [2]. Además las hidrazonas retenidas en el sistema
de SPE se eluyen fácilmente con acetonitrilo, lo que facilita su posterior
determinación por LC dada su compatibilidad con la composición de la fase móvil
requerida para su separación. Sin embargo, la derivatización de dialdehídos, tal
como glioxal y metilglioxal, con DNPH no proporciona resultados cuantitativos [2],
lo cual es un importante inconveniente dada la presencia de estos aldehídos en
muestras de agua.
La importancia de la elección de sorbentes y soportes para realizar la SPE se
ve reflejada en los trabajos de los diversos autores consultados. En lo referente a los
sorbentes destaca la sílice enlazada con grupos octadecilo (C18), sorbente clásico de
carácter poco polar utilizado en un gran número de aplicaciones [2,64,105,125]. Está
constituido por un sustrato de partículas irregulares de sílice que mantienen
adheridas cadenas de hidrocarburos de 18 átomos de carbono para la retención de
los analitos de interés mediante una serie de interacciones combinadas, como
fuerzas de Van der Waals o enlaces de hidrógeno de los grupos silanoles. Los
soportes utilizados son muy variados e incluyen diferentes tipos de cartuchos
43
Capítulo 1
[6,64,105,125] y discos [2]. Para eluir los DNPH–derivados de los aldehídos
retenidos en soportes de C18 (generalmente de 200 mg) el acetonitrilo es el
disolvente generalmente empleado (de 1 a 20 mL) para volúmenes muy variables de
muestra que oscilan entre 25 mL y 1 L. Una vez finalizada la etapa de SPE, el eluido
se puede evaporar y reconstituir en un volumen menor (750 µL [2] o 1 mL [64]) de
acetonitrilo/agua (1:1) con objeto de incrementar el factor de preconcentración.
La tendencia a la miniaturización ha conducido al desarrollo de mini–
soportes para sorbentes en detrimento de los cartuchos convencionales. De este
modo se reduce de manera drástica la cantidad de disolvente orgánico utilizado, con
lo que se evitan posibles errores asociados a los procesos de concentración y
reconstitución de los analitos eluidos y se reduce apreciablemente el tiempo de
análisis [76,81,84,126]. Para aprovechar las inherentes ventajas de este formato
miniaturizado de SPE, Baños y Silva han desarrollado un sistema de flujo
automático de SPE para la derivatización–preconcentración in situ de aldehídos con
DNPH empleando una minicolumna de SPE (µ–SPE) fabricada en el laboratorio
[76,81]. Con el objetivo de mejorar las características analíticas de la metodología
propuesta, estos autores [76] han realizado un importante estudio sobre el
comportamiento de diversos sorbentes (minicolumnas SPE, 50 mg, ~ 1.2 cm de
longitud) en el proceso de derivatización–preconcentración in situ de aldehídos
haciendo uso del sistema continuo de µ–SPE con la finalidad de mejorar la
sensibilidad y/o selectividad en la determinación de estos compuestos. Tras evaluar
el comportamiento de sorbentes tanto convencionales como no convencionales
(C18, LiChrolut EN, Amberlita XAD–2, fullereno C60, nanotubos de carbono
multicapas y carbón grafitizado) se pueden establecer las siguientes conclusiones: (i)
el sorbente polimérico LiChrolut EN permite trabajar a valores de pH más ácidos
(pH  1.5) que con el C18 (pH  3.0) lo que mejora el rendimiento de la reacción de
derivatización dado que ésta se encuentra catalizada en medio ácido; (ii) debido al
44
Introducción
mayor grado de adsorción del DNPH en el LiChrolut EN, es necesaria una menor
cantidad de sorbente (50 mg frente a los 100 mg de C18) y menor cantidad de
reactivo derivatizante; (iii) el sorbente LiChrolut EN permite volúmenes de ruptura
de muestra de hasta 20 mL frente a los 10 mL con los que se trabaja en C 18. Este
parámetro, relacionado con el factor de preconcentración, permite incrementar la
sensibilidad del método cuando se utiliza LiChrolut EN como sorbente en el
sistema continuo de µ–SPE; y (iv) la vida media de reutilización de la minicolumna
de LiChrolut EN es de unos 500 análisis.
En este contexto, es interesante destacar la propuesta de Takeda y col. [84],
referente al empleo de una minicolumna de C18 (4.6 mm i. d. × 5 mm de longitud)
situada en lugar del bucle de la válvula de inyección de un LC. La derivatización de
los aldehídos con DNPH se lleva a cabo en la modalidad batch durante 1 h a
temperatura ambiente. Posteriormente se inyectan 2.5 mL de muestra que contiene
los DNPH–derivados y se preconcentran en la minicolumna de C18 insertada en la
válvula de inyección. Con objeto de evitar el exceso de DNPH (interfiere
seriamente en la determinación del formaldehído) que se origina en el proceso de
elución con la fase móvil, éste se elimina parcialmente mediante la inyección previa
de 2.5 mL de una disolución acuosa de acetonitrilo (15%).
Investigaciones con sorbentes de polaridad moderada como el C2 [126] han
dado buenos resultados en la retención de los aldehídos con un menor número de
átomos de carbono, como consecuencia de las mayores interacciones que se
producen entre ambas partes debido a las cadenas cortas presentes en el sorbente.
En esta ocasión el sorbente ( 20 mg) se empaqueta en una membrana de
polipropileno que posteriormente se impregna con una disolución de DNPH
durante 20 min. Con objeto de favorecer el proceso de derivatización/
preconcentración in situ se hace uso de dos unidades de µ–SPE, llevándose a cabo el
proceso de microextracción en unos 20 min. Transcurrido este tiempo cada
45
Capítulo 1
membrana se lleva a un tubo de microcentrífuga que contiene 100 µL de
acetonitrilo, donde se procede a la desorción de las hidrazonas con la ayuda de
ultrasonidos durante 5 min. Los autores han establecido que las membranas de C 2
sólo se pueden reutilizar hasta 15 veces, lo que supone poco margen de uso si se
compara con alternativas que también utilizan sorbentes en soportes elaborados en
el propio laboratorio de vida útil más prolongada [76,81].
La MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (solid phase microextraction,
SPME) fue introducida a principios de los noventa por Pawliszyn y Arthur [127]
como una técnica simple, eficiente y con bajo consumo de disolvente orgánico que
permite el muestreo, aislamiento y enriquecimiento en un único paso. Se basa en la
distribución de los analitos/derivados de interés entre la matriz de la muestra y una
pequeña cantidad de sorbente dispersado o inmovilizado en un soporte sólido. Una
vez extraídos, la desorción final de los analitos/derivados tiene lugar asistida por un
aumento de temperatura (desorción térmica) o bien mediante el uso de un
disolvente adecuado (elución química) [128,129].
Tras la propuesta inicial de la técnica de SPME por Pawliszyn y Arthur,
estos mismos autores introdujeron la modalidad más utilizada de la misma en la que
el sólido sorbente se soporta en una fibra de sílice: microextracción en fase sólida
sobre fibra [127], conocida hoy por hoy como SPME. La SPME está considerada
como una técnica de rutina para la extracción de compuestos volátiles o
semivolátiles en diferentes tipos de muestras para su posterior determinación por
GC. Se ha acoplado con buenos resultados a LC y CE en especial para analitos
termolábiles [130]. Se pueden diferenciar dos modalidades de SPME: de inmersión
total (L–SPME) y de espacio de cabeza (HS–SPME), en función de que la fibra esté
en contacto directo con la muestra o con el espacio de cabeza de la misma. Después
de la extracción, la fibra se introduce en el inyector del cromatógrafo para proceder
a la determinación de los analitos extraídos. En GC tiene lugar la desorción térmica
46
Introducción
de los analitos, mientras que en LC se eluyen con un medio adecuado. La SPME en
fibra se utiliza para la extracción de compuestos no polares, o aquellos polares que
mediante una reacción de derivatización se transforman en derivados con una
polaridad inferior. La derivatización se puede llevar a cabo antes, durante o después
de la etapa de SPME.
En el campo de la determinación de aldehídos en muestras de agua que
implica una etapa previa de SPME, se suele utilizar como agente derivatizante la
PFBHA y se aprovecha generalmente la volatilidad de las oximas formadas en la
fase acuosa para realizar el proceso de microextracción en la modalidad de HS–
SPME. La elución de los derivados se produce por desorción térmica previa
determinación por GC. Pese a las ventajas de esta técnica también presenta ciertas
debilidades, como fragilidad de la fibra, limitado tiempo de uso y problemas de
contaminación relacionados con fenómenos de carry over.
En este ámbito se han empleado fibras de sílice (100–200 µm de diámetro)
recubiertas con polidimetilsiloxano–divinilbenceno (PDMS–DVB) como sorbente
(10–100 µm de espesor) al ser consideradas las más adecuadas por su gran
versatilidad, alta eficiencia de extracción y buena respuesta, y por adsorber la
PFBHA de manera reproducible [63,74,131–133]. En la mayoría de los trabajos
publicados se emplea la modalidad HS–SPME tras derivatizar con PFHBA los
aldehídos empleando volúmenes de muestras comprendidos entre 4–30 mL
[97,131] y de espacio de cabeza similares (4.5 mL) [97] o inferiores (10 mL) [131] al
de la muestra, siempre con el objetivo de minimizar el mismo para conseguir
incrementar la sensibilidad. Los derivados de los aldehídos alifáticos de cadena corta
son los primeros que alcanzan el equilibrio (especialmente el formaldehído) siendo
los alifáticos de cadena larga, los aromáticos y los insaturados los de cinética más
lenta. Por todo ello se ha de adoptar una solución de compromiso según los analitos
presentes en la muestra, si bien se puede recomendar llevar a cabo el proceso de
47
Capítulo 1
microextracción por agitación mecánica (1100 rpm) o por ultrasonidos durante 30–
40 min. Un aspecto adicional a considerar en el proceso de SPME es la posible
adición de sales a la muestra, lo que favorece la difusión de los analitos/derivados
hacia el espacio de cabeza y disminuye el tiempo de microextracción. Se recomienda
la adición de cloruro de sodio ( 0.2 g mL–1) lo que mejora la extracción de los
PFBHA–derivados de aldehídos de cadena más corta [131] y de benzaldehído [97].
Sin embargo, cuando se realiza la derivatización in situ en la propia fibra el efecto
salino no es significativo y sólo se favorece el proceso de SPME en el caso del
formaldehído [74]. El proceso final de desorción térmica de los PFBHA–derivados
se realiza a 250 °C [63,74,97,131] durante un período de tiempo comprendido entre
1 [131] y 5 min [97].
Sólo se ha encontrado una contribución en la que se realizan de forma
simultánea los procesos de derivatización y microextracción utilizando PFBHA
como reactivo derivatizante haciendo uso de una fibra impregnada del mismo [74].
La PFBHA se carga en la fibra agitando una disolución del mismo a 1100 rpm
durante 2 min. A continuación la fibra se expone a 2 mL de muestra durante tan
sólo 10 min. Tiempos superiores de exposición originan errores por defecto debido
a la posible evaporación de los aldehídos. El bajo volumen de muestra necesario,
junto a la rapidez del proceso son las principales ventajas de este método,
recomendado por sus autores para el análisis de rutina de muestras en las que se
disponga de poco volumen.
Finalmente, reseñar el interesante estudio comparativo sobre las distintas
modalidades de SPME realizado por Beránek y Kubátová [63] en la determinación
de aldehídos alifáticos y aromáticos: HS–SPME, L–SPME y derivatización in situ en
la propia fibra sumergida en la muestra. Este último procedimiento proporciona
bajos valores de sensibilidad debido probablemente al paso de la PFBHA a la matriz
acuosa. El método L–SPME, donde se introduce la fibra en la muestra (1.2 mL) que
48
Introducción
contiene los analitos previamente derivatizados con PFBHA, proporciona los
mejores límites de detección para la mayoría de aldehídos incluyendo dialdehídos y
aldehídos hidroxilados y por ello es el propuesto por los autores.
Pese a ser la PFBHA el reactivo derivatizante mayoritariamente empleado
en este contexto, Kim y Shin [133] han desarrollado un método HS–SPME–GC
utilizando como reactivo derivatizante la 2,2,2-trifluoroetilhidracina (TFEH). Se
trata de una hidracina muy volátil que presenta ciertas ventajas frente al reactivo
clásico PFBHA: (i) condiciones más favorables para efectuar la reacción de
derivatización (30 min, 40 ºC); y (ii) mayor estabilidad de la disolución de trabajo del
agente derivatizante [134]. El proceso de microextracción se realiza en medio ácido
(acidificando la muestra de 4 mL a pH 4.0 por adición de ácido clorhídrico 0.1 mol
L–1), ajustando la fuerza iónica con cloruro de sodio (0.4 g mL–1) y con un tiempo de
derivatización/extracción de 30 min. Posteriormente, los TFEH–derivados se
desorben a 240 ºC en tan sólo 1 min.
La extracción en barrita sorbente magnéticamente agitada (stir bar
sorptive extraction, SBSE) es una modalidad de SPME desarrollada por el grupo del
Profesor Sandra [135] como una alternativa a la técnica convencional con la que
comparte los mismos principios básicos. Las diferencias más sustanciales entre
ambas son el diseño del sistema de extracción y la cantidad de material extractante
utilizado. En SBSE la fase extractiva recubre una barrita de agitación magnética,
siendo la cantidad de esta fase considerablemente mayor que en el caso de la SPME
(del orden de 50 a 250 veces) lo que implica una mejora de la sensibilidad [136,137].
La extracción se produce por agitación de la muestra líquida con la barrita
recubierta. Se pueden obtener niveles de sensibilidad hasta 500 veces superiores a la
técnica de SPME convencional con tiempos de agitación comprendidos entre 30 y
60 min [135]. Una vez finalizada, la barrita se recupera para proceder a la desorción
térmica (para GC) o a la elución con un disolvente (para LC) de los analitos.
49
Capítulo 1
Sólo se ha encontrado una contribución sobre el empleo de la SBSE en la
determinación de aldehídos en muestras de agua [73]. En ella, una pequeña barra
magnética se recubre con  5 mg de poliestireno divinilbenceno y se realiza una
derivatización empleando como reactivo pentaflurofenilhidracina (PFFH) que posee
una gran especificidad por compuestos carbonílicos de cadena corta. El pH de la
muestra (30 mL) es ligeramente ácido (pH = 5.5) y en este caso la reacción de
derivatización se lleva a cabo a temperatura ambiente durante 6 h, a pesar de que los
autores citan que la formación del derivado PFFH–formaldehído requiere hasta 24
h para asegurar la reacción completa. Finalmente, la desorción de los derivados se
realiza sumergiendo la barrita en metanol asistiendo el proceso con ultrasonidos.
Una corriente de nitrógeno evapora el extracto hasta 200 µL, con lo que se obtiene
un factor de preconcentración de 150.
4.4. Separación y determinación de aldehídos
En este último apartado se aborda el estudio de las propuestas descritas en
la bibliografía para la separación y determinación de aldehídos en muestras de agua
mediante técnicas cromatográficas y electroforéticas, esto es, para el desarrollo de la
etapa final del proceso analítico una vez que los analitos de interés han sido aislados
con éxito de la matriz de la muestra. Las tres técnicas que más se utilizan con este
objetivo son: cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y electroforesis
capilar. A continuación se discutirán los aspectos más relevantes de las
metodologías desarrolladas cuya distribución conforme a su empleo en la
determinación de aldehídos en muestras de agua se observa en la Figura 5.
A tenor de la búsqueda bibliográfica realizada se puede afirmar sin lugar a
dudas que la cromatografía de líquidos es la técnica más utilizada para la separación
de aldehídos en muestras de agua y su posterior cuantificación mediante diferentes
50
Introducción
sistemas de detección. Sólo el 13% de los artículos consultados se refieren al empleo
de la electroforesis capilar, aunque hay que indicar que su uso está más extendido en
la determinación de estos compuestos en otros tipos de matrices, como por ejemplo
en muestras de aire. Una situación similar se presenta para la cromatografía de
gases, en especial para muestras de aire, aunque su incidencia en la determinación de
aldehídos en muestras de agua es más significativa, en torno al 36% de las
contribuciones consultadas.
Electroforesis
capilar
13%
Cromatografía
de líquidos
51%
36%
Cromatografía
de gases
Figura 5 Distribución de las metodologías descritas para la determinación de aldehídos
alifáticos y aromáticos en muestras de agua.
4.4.1. Cromatografía de líquidos (LC)
Como es conocido, en LC la etapa de separación está controlada por las
interacciones químicas entre analito, fase móvil y fase estacionaria (columna
51
Capítulo 1
cromatográfica). Existen diferentes modalidades de LC en función de estas
interacciones [111], siendo la cromatografía de fase reversa la que se emplea para la
separación de los derivados formados por los aldehídos en muestras de agua. La
DNPH es el reactivo derivatizante más utilizado con este propósito así como la
técnica de DAD para la cuantificación de las hidrazonas formadas con los
aldehídos. En los últimos años el empleo de la espectrometría de masas como
sistema de detección está adquiriendo relevancia en este contexto, aunque son
escasas las contribuciones realizadas. Se han propuesto otros reactivos
derivatizantes con el objetivo fundamental de incrementar la sensibilidad de estas
determinaciones ya que permiten la formación de derivados de los aldehídos con
propiedades luminiscentes. Con el ánimo de simplificar el procedimiento analítico,
se ha descrito una metodología que permite la determinación directa de los
aldehídos (sin derivatización previa) en este caso con detección electroquímica.
Como se ha indicado, la DNPH es el agente derivatizante mayoritariamente
empleado para la determinación de aldehídos alifáticos y aromáticos mediante LC.
La fase móvil es un factor crítico y siempre tiene carácter polar frente a la fase
estacionaria de carácter apolar. En la mayor parte de los métodos publicados con
detección UV, la fase móvil está formada generalmente por mezcla de agua y un
disolvente orgánico, como acetonitrilo [79,81], aunque también se emplea metanol
[69,91] o incluso combinaciones de ambos [84]. De manera adicional y antes de su
uso, todos los componentes de la fase móvil han de ser desgasificados para evitar la
presencia de burbujas de aire que podrían causar problemas en el proceso de
separación.
Es común el uso de aditivos en la fase móvil al trabajar en LC–MS [2,64]. Su
función es favorecer el proceso de ionización y, en definitiva, mejorar la
identificación/cuantificación de los analitos. Las metodologías propuestas para la
determinación de aldehídos por LC–MS mediante sus correspondientes DNPH–
52
Introducción
derivados proponen el empleo de ácido fórmico [76] o acetato de amonio [64]
como aditivos, aunque también se puede realizar la separación sin la adición de
ningún aditivo en la fase móvil [2]. En el método propuesto por Baños y Silva [76]
la fase móvil que contiene acetonitrilo y metanol se modifica con ácido fórmico al
0.1% lo que origina mejores resultados en términos de sensibilidad y
reproducibilidad. Sin embargo, concentraciones más altas provocan una pérdida de
sensibilidad y en la precisión, debido probablemente a la formación de aductos en el
proceso de ionización de los derivados. Pese a que no está muy extendido el empleo
de aditivos en métodos DNPH/LC–UV, en una contribución se recomienda un
contenido de ácido acético al 0.5% en la fase móvil [108] para conseguir una
adecuada separación de los picos.
Como es bien conocido, la separación cromatográfica por LC se puede
llevar a cabo en dos modalidades en función de la composición de la fase móvil a lo
largo de la misma: isocrática y gradiente. De ambas alternativas, la modalidad en
gradiente es la más utilizada para conseguir la separación de mezclas de aldehídos
más o menos complejas mediante LC–UV [125,126] ó LC–MS [64,76]. En este
caso, algunos autores recomiendan que la composición de la fase móvil al comienzo
del gradiente se asemeje lo más posible a la de la matriz del extracto inyectado [2].
La modalidad isocrática se ha propuesto para la separación de mezclas que
contienen tan sólo formaldehído y acetaldehído [71,79].
En la mayoría de las metodologías que hacen uso de la detección UV se
emplea un columna cromatográfica de C18 de dimensiones convencionales (150–
250 mm de longitud, 4.0–4.6 mm de diámetro interno y 5 µm de tamaño de
partícula) para la separación de los DNPH–derivados. En el caso de las
determinaciones mediante LC–MS se emplean columnas con un diámetro interno y
tamaño de partícula inferior, del orden de 2 mm y 3 µm, respectivamente [2,64,76].
Pese a que la temperatura no es una variable clave en LC, a diferencia de la GC, las
53
Capítulo 1
columnas a veces se suelen termostatar a temperaturas comprendidas entre 35 C y
40 °C [71,76] con la finalidad de mejorar la solubilidad y la difusión de los DNPH–
derivados en la fase móvil y por ende su separación. Una vez en el sistema
cromatográfico, los DNPH–derivados se retienen en la columna debido a los
grupos C18 enlazados a la superficie de la sílice para proveerla de interacciones no
polares. Así, los compuestos más polares con los grupos alquilo más cortos se
eluyen en primer lugar, y la secuencia de tiempos de retención es paralela a la
hidrofobicidad de los grupos alquilo de los DNPH–derivados. Bajo estas
condiciones los derivados se separan en un tiempo que oscila entre 10 min [76] y 60
min [2], tiempo que se prolonga en separaciones de mezclas complejas con un
número de analitos mayor.
El sistema de detección más empleado cuantificar los DNPH–derivados,
generalmente mediante su correspondiente área de pico, es el UV–Vis convencional
[6,84,91,125] o DAD [69,81]; y en menor medida MS [2,64,76], el cual
adicionalmente proporciona información estructural de los analitos. En este
contexto es interesante comentar los problemas de reproducibilidad que se originan
en la cuantificación del DNPH–derivado del formaldehído, en general con valores
de RSD del orden del 35% [64,76]. Este comportamiento se puede atribuir a una
irreproducibilidad en el proceso de fragmentación así como a posibles pérdidas
relacionadas con el incremento de temperatura que se ha de aplicar al gas de secado
para eliminar los iones del frente de disolvente, en especial el exceso de DNPH.
Tal y como se ha comentado al inicio de esta sección, la mayoría de las
metodologías desarrolladas para la determinación de aldehídos de bajo peso
molecular en muestras de agua emplean como agente derivatizante DNPH. Sin
embargo existen otros métodos publicados que llevan a cabo este proceso con otros
reactivos. Así, la DNSH se emplea para formar derivados luminiscentes con los
aldehídos que se cuantifican mediante detección quimiluminiscente (chemiluminiscence,
54
Introducción
CL) [75] y fluorescente (F) [100]. En ambos métodos los derivados se separan en
una columna convencional de C18 (250 × 4.6 mm, 5 µm). En el método
DNSH/LC–CL [75] las DNSH–hidrazonas se separan mediante un gradiente de
acetonitrilo agua (0.5 mL min–1) a diferencia del método DNSH/LC–F [100], donde
la separación se realiza en modo isocrático (acetonitrilo:agua, 50:50 v/v) con un
caudal de 1.5 mL min–1. Con el empleo de otros reactivos que originan también
hidrazonas [59,73] se emplean columnas convencionales de C 18 y la composición de
la fase móvil depende de la estructura química de los derivados implicados en el
proceso de separación. Por último, es interesante comentar una metodología
propuesta para la determinación directa de aldehídos (sin derivatizar) con detección
amperométrica en muestras de agua mineral [78]. Se emplea la modalidad de
cromatografía de intercambio catiónico utilizando una columna de 300 mm × 7.8
mm con un tamaño de partícula de 9 µm. Las muestras se diluyen y se inyectan
directamente en la columna. Los autores estudian la influencia del ácido perclórico
presente en la fase móvil a distintas concentraciones para mejorar la sensibilidad del
método. El posible potencial analítico de esta metodología radica en la omisión de
las etapas de preparación y derivatización de la muestra, con el consiguiente ahorro
de tiempo, proporcionando además límites de detección al nivel de µg L–1.
4.4.2. Cromatografía de gases (GC)
Se puede indicar que la GC es la técnica analítica de separación que ha
experimentado un mayor desarrollo desde sus inicios en la década de los 50 del
pasado siglo, constituyendo en la actualidad una herramienta analítica con gran
poder de resolución para la separación de compuestos orgánicos volátiles [111]. La
incidencia de esta técnica en el contexto de la determinación de aldehídos en
muestras de agua se circunscribe, casi en su totalidad, a la formación de oximas
55
Capítulo 1
halogenadas volátiles con la PFBHA y su posterior separación y determinación con
dos sistemas de detección: ECD ó MS. En este contexto, juegan un papel muy
importante las técnicas de microextracción que se utilizan en la etapa previa a la
separación cromatográfica ya que no sólo permiten incrementar la sensibilidad de
las determinaciones (especialmente con detección MS ya que presenta menor
sensibilidad que la ECD) sino conseguir extractos orgánicos anhidros en disolventes
compatibles con el sistema cromatográfico. Es por ello que el empleo de la
modalidad de espacio de cabeza es una importante alternativa.
Para comentar las aportaciones en este campo, se ha tomado como hilo
conductor el desarrollo del proceso cromatográfico. Así, una vez obtenidos los
extractos que contienen los PFBHA–derivados, la inyección se lleva a cabo en casi
todos los casos en modo splitless (sin división de flujo) [77,97,122], el cual es
especialmente indicado para el análisis de trazas puesto que se inyecta la totalidad de
la muestra. Sólo se ha encontrado una referencia [74] en la que se trabaja en modo
split (con división de flujo) con una relación de 1:20. En este contexto es interesante
comentar un estudio reciente en el que se hace uso de un inyector de temperatura
programable que permite la inyección de grandes volúmenes de muestra (LVI–
PTV) [62]. Se trata de una herramienta útil que mejora los límites de detección en
GC en uno o dos órdenes de magnitud respecto a un inyector splitless convencional,
lo que permite el análisis de compuestos a niveles de traza siempre que éstos tengan
puntos de ebullición de aproximadamente 100 ºC superior al disolvente. El
principio operacional del inyector LVI–PTV es simple. La muestra (50 µL) se
introduce en el inlet a baja temperatura, seguido de un incremento rápido de la
misma para evaporar el disolvente, lo que permite minimizar la descomposición de
aquellos analitos termolábiles. Además, el modo de venteo del disolvente permite
preconcentrar los analitos que quedan retenidos en el liner mientras que el disolvente
es eliminado por la válvula de venteo.
56
Introducción
El gas portador empleado en todos los casos es helio [61,70,83,95] con un
flujo que oscila de 1 [74,122] a 3 mL min–1 [95]. Las columnas capilares tienen por
lo general una longitud de 30 m, 0.25 mm de diámetro interno y 25 µm de espesor
de fase estacionaria, salvo excepciones como la utilizada por el Método EPA 556.1
[86] con una longitud de 10 m, diámetro interno de 0.10 mm y 10 µm de espesor de
fase estacionaria. Generalmente estas columnas de poca longitud se emplean en el
análisis de mezclas con una composición simple, y por el contrario las columnas de
mayor longitud, de más de 30 m, se usan para matrices más complejas.
Todas las investigaciones consultadas emplean columnas capilares de sílice
fundida con un recubrimiento de poliamida, con una fase estacionaria de 5%-(fenil)95%-polidimetilsiloxano para la determinación de aldehídos [70,72,123]. El carácter
apolar de esta fase, su naturaleza inerte y su inalterabilidad son ideales para su uso
en GC. El espesor de la fase estacionaria oscila entre 0.25 µm, para la práctica
totalidad de las publicaciones estudiadas. El rango de temperatura en el que se ha
trabajado está comprendido entre 50 C y 320 °C, utilizando rampas de temperatura
de hasta 35 °C min–1. El tiempo de separación está comprendido entre 6 y 50 min y
depende claramente de la complejidad de la muestra.
El detector más utilizado es MS [61–63,74,77,82,95,122] dada su capacidad
de identificación y cuantificación, mientras que el ECD [83,86,95,97,131] se ha
utilizado en menor extensión a pesar de proporcionar una sensibilidad mayor
aunque sólo permite trabajar en un intervalo lineal muy limitado. Este
comportamiento queda patente en una contribución en la que se comparan ambos
sistemas de detección [95].
Pese a que la PFBHA es el reactivo empleado de manera mayoritaria en las
investigaciones que emplean GC para determinar aldehídos en muestras de agua, es
interesante señalar dos alternativas que emplean diferentes agentes derivatizantes
[72,123]. Las aportaciones de estas propuestas se centran en la etapa de
57
Capítulo 1
derivatización, ya que una vez obtenidos los derivados, éstos se separan y
determinan en sistemas cromatográficos similares a los ya descritos cuando se utiliza
PFBHA como agente derivatizante.
4.4.3. Electroforesis capilar (CE)
La CE es una técnica de separación relativamente reciente que ha
experimentado un significativo avance durante las últimas dos décadas, siendo muy
útil para realizar separaciones de alta eficiencia de especies en capilares de sílice que
contienen una disolución electrolítica (buffer de desarrollo) [111]. En los últimos
años la CE se ha convertido en una interesante alternativa a la LC debido a su
rapidez de análisis, bajo volumen requerido de muestra (de 1 a 50 nL según las
dimensiones del capilar), alta eficiencia en las separaciones y reducido coste
operacional [138]. No obstante, hasta la fecha su uso en el laboratorio analítico no
ha superado al de otras técnicas de separación más tradicionales como la LC o la
GC.
En su modalidad más común, electroforesis capilar en zona (capillary zone
electrophoresis, CZE), la separación de las sustancias se basa en su diferente movilidad,
sentido y velocidad, y se rige por dos fenómenos fundamentalmente:
electromigración y electroósmosis. La relación carga/tamaño de ión determina la
movilidad electroforética (nula en el caso de las moléculas neutras) y por
consiguiente su separación. La separación de especies sin cargas mediante CE se
soporta en la denominada cromatografía electrocinética micelar (micellar electrokinetic
capillary chromatography, MEKC) introducida por Terabe y col. [139]. En esta
modalidad de CE, se adiciona un medio micelar al buffer de desarrollo, a modo de
fase pseudoestacionaria, cuyo movimiento en el sistema electroforético se realiza
por electromigración en el caso de micelas cargadas o por electroósmosis si éstas no
58
Introducción
poseen carga. El proceso de separación se basa fundamentalmente en la distribución
de los analitos en esta fase pseudoestacionaria a medida que se desplaza en el
sistema electroforético. Desde su implantación ha experimentado un extraordinario
desarrollo debido a su gran versatilidad, rapidez y eficacia separativa [140].
En el ámbito concreto de la determinación de aldehídos en muestras de agua
se han utilizado diferentes reactivos que originan derivados cargados de los
aldehídos cuya separación se lleva a cabo mediante CZE con detección mediante
espectroscopía. La sensibilidad de estas determinaciones es baja, de forma que se ha
recurrido al uso de técnicas de preconcentración on line, tal como la técnica de
stacking, o bien al empleo de reactivos derivatizantes con características
luminiscentes y detección mediante fluorescencia inducida por láser (laser induced
fluorescence, LIF). No se han encontrado referencias sobre el empleo de técnicas de
microextracción acopladas a CE con objeto de incrementar la sensibilidad en el
ámbito de la determinación de aldehídos en muestras de agua. Esto puede estar
relacionado con los problemas de conductividad que se originan en el sistema
electroforético cuando se inyecta el extracto orgánico obtenido tras el proceso de
microextracción. Con relación a la MEKC, pese a su innegable interés ha tenido
hasta la fecha una escasa repercusión en el contexto de la determinación de
aldehídos en muestras de agua.
En los métodos propuestos para la determinación de aldehídos de bajo peso
molecular en muestras de agua, la muestra que contiene a los aldehídos ya
derivatizados se inyecta generalmente en la región anódica del capilar mediante
presión (inyección hidrodinámica) [68,80]. En todos los casos la longitud media de
los capilares empleados es de 75 cm, con un diámetro interno de 50 µm [80] o 75
µm [68]. Trabajar con un capilar de menor grosor se traduce en una mayor
disipación de calor, un incremento en la eficiencia en la separación y tiempos de
análisis más cortos, pero por otro lado aumenta el riesgo de obstrucción del mismo.
59
Capítulo 1
Como se ha indicado, la mayoría de las metodologías desarrolladas hacen
uso de la modalidad de CZE con detección UV/Vis para la determinación de
aldehídos alifáticos, tras la formación de derivados con el ácido 4-hidracinobenceno
sulfónico (HBSA) [68] o DNSH [67,103], en agua de lluvia [67,68] y en muestras de
agua fortificadas [103]. Por otro lado, se ha propuesto recientemente una
metodología para la determinación de aldehídos mediante CZE en muestras de agua
basada en el potencial de la detección mediante LIF [80].
El HBSA [68] presenta dos ventajas importantes sobre otros reactivos
derivatizantes que han sido empleados en la determinación de aldehídos en
muestras de agua: su estabilidad en disolución acuosa y la presencia del grupo
sulfónico terminal, que mejora el proceso de separación mediante CZE. Se utiliza
un buffer borato (ácido bórico 56 mmol L–1 e hidróxido de sodio 20 mmol L–1)
cuyo pH en el intervalo 5.0–9.5 afecta sólo a la movilidad del exceso del reactivo
derivatizante. Este efecto se puede adscribir a la protonación del grupo hidracina a
valores bajos de pH.
La metodología de CZE basada en el empleo de la DNSH como agente
derivatizante hace uso de una técnica de preconcentración on line (técnica de
stacking) para incrementar la sensibilidad además del empleo de una celda de flujo
con forma de Z que proporciona un incremento del camino óptico en el proceso de
detección UV [67]. Tras el proceso de stacking, la separación electroforética se realiza
en un buffer compuesto por fosfato de sodio 5 mmol L–1, borato de sodio 10 mmol
L–1 a pH 8 y en presencia de un 20% de acetonitrilo, modificador orgánico que
origina una disminución de la velocidad del flujo electroosmótico y favorece la
solubilidad de las hidrazonas. En otra metodología basada en el empleo de la
DNSH, Feige y col. [103] determinan únicamente formaldehído en una matriz
acuosa que contiene dihidroxiacetona. En este caso, la separación electroforética del
derivado del formaldehído se realiza en un buffer constituido por borato de sodio
60
Introducción
20 mmol L–1 y fosfato de sodio 10 mmol L–1 ajustado a pH 7, en presencia de un
20% de metanol como modificador orgánico. Con ello se consigue una separación
adecuada de los picos correspondientes a DNSH–formaldehído y al exceso de
DNSH–dihidroxiacetona.
El método propuesto por Baños y Silva [80] utiliza un derivado de la
fluoresceína que incorpora un grupo tiosemicarbacida para interaccionar con el
grupo carbonilo presente en los aldehídos. Esta publicación ha sido pionera en
utilizar tal marcador fluorescente para aldehídos alifáticos. Las condiciones
específicas para la derivatización (3 h, 60 °C) impiden el empleo de técnicas de
preconcentración para incrementar la sensibilidad; sin embargo, las características
luminiscentes de los derivados y el empleo de LIF como sistema de detección
permiten alcanzar límites de detección al nivel de ng L–1. El buffer de separación
contiene borato de sodio 60 mmol L–1 a pH 10 en presencia del surfactante no
iónico Triton X–100 a concentraciones inferiores a su concentración micelar crítica.
(CMC). Al no existir micelas en el buffer de desarrollo, la separación se realiza bajo
la modalidad de CZE.
Pese a su innegable interés por su creciente número de aplicaciones [140],
como se ha indicado anteriormente la MEKC ha tenido hasta la fecha una escasa
repercusión en la determinación de aldehídos en muestras de agua. Sólo se ha
publicado una metodología en la cual se utiliza DNPH como reactivo derivatizante
[85]. En este caso, el buffer de separación está formado por tetraborato de sodio 20
mmol L–1 a pH 9.0 en presencia de micelas de surfactante aniónico SDS (dodecil
sulfato de sodio) a una concentración de 50 mmol L–1. De nuevo el empleo de un
modificador orgánico, en este caso acetonitrilo, es primordial para mejorar la
resolución de los picos de los derivados. Se recomienda un contenido del 10% en
acetonitrilo, ya que valores superiores permiten observar pequeños picos
61
Capítulo 1
correspondientes a isómeros de derivados de propionaldehído y acetaldehído con
dificultan el tratamiento cuali– y cuantitativo del electroferograma.
62
Introducción
5. Conclusiones
En apartados anteriores de esta Introducción se han comentado diferentes
aspectos relacionados con la naturaleza de los aldehídos, en especial aquellos
relacionados con su presencia en muestras de agua como DBPs. Además, se ha
realizado una descripción crítica de cada una de las etapas del proceso analítico
implicado en las metodologías que se han desarrollado hasta la fecha, y su
repercusión en la determinación de aldehídos alifáticos y aromáticos de bajo peso
molecular en muestras de agua.
En la Figura 6 se muestra la incidencia relativa del tipo de aldehído
(alifático y/o aromático) objeto de estudio en las diferentes metodologías
propuestas en la bibliografía.
6%
20%
74%
Sólo aldehídos alifáticos
Aldehídos alifáticos y benzaldehído
Aldehídos alifáticos y aromáticos
Sólo aldehídos alifáticos
Figura 6
Tipos de aldehídos determinados en muestras de agua.
Aldehídos alifáticos y benzaldehído
Aldehídos alifáticos y aromáticos
Como se observa en la Figura 6, la gran mayoría de los métodos
desarrollados para la determinación de aldehídos de bajo peso molecular en
muestras de agua (74%) se refieren exclusivamente a aldehídos alifáticos. Sólo el
20% de las publicaciones incluyen el benzaldehído como único aldehído aromático
63
Capítulo 1
en la determinación de mezclas que contienen fundamentalmente aldehídos
alifáticos, desde formaldehído hasta decanal y los dialdehídos glioxal y metilglioxal
[69,77,86,95,97,108]. Sólo dos contribuciones realizadas por nuestro Grupo de
Investigación, que constituyen el 6% de las publicaciones realizadas en este campo,
han estudiado de forma sistemática la determinación de mezclas de aldehídos
alifáticos (incluyendo dialdehídos) y aromáticos en muestras de agua como DBPs
[61,62]. Mediante GC–MS y haciendo uso de diferentes técnicas de microextracción
en el tratamiento de la muestra se consigue el análisis de mezclas de aldehídos
alifáticos (de formaldehído a valeraldehído) y aromáticos (benzaldehído, 3-metil-, 2etil-, 2,5-dimetil-, 3-hidroxi- y 2,5-dihidroxibenzaldehído) con una mayor presencia
en muestras de agua como DBPs.
En la Tabla 2 se recogen las principales características analíticas de las
metodologías desarrolladas para la determinación de benzaldehído o mezclas de
aldehídos aromáticos y alifáticos en muestras de agua con indicación de los
reactivos derivatizantes utilizados, fundamentalmente DNPH y PFBHA. Se pueden
extraer las siguientes conclusiones generales si se excluyen las dos recientes
aportaciones realizadas por nuestro Grupo de Investigación: (i) la GC–ECD es la
técnica más utilizada en este contexto; (ii) son muy escasas las determinaciones
basadas en el empleo de la LC: sólo dos referencias con detección UV; y (iii) en
general la sensibilidad de las metodologías permiten alcanzar límites de detección al
nivel de µg L–1 o incluso inferiores conforme a la técnica de pre–tratamiento de
muestra utilizada, siendo éstos inferiores cuando se emplean técnicas de
microextracción
64
Tabla 2
Características analíticas de las metodologías desarrolladas para la determinación de aldehídos aromáticos en
muestras de agua
Aldehídos
Reactivos
Técnica de
preconcentración
Técnica
cromatográfica
Límites de
detección
Ref.
Benzaldehído en presencia de
otros aldehídos alifáticos
DNPH
HS–SDME
LC–UV
3.5 µg L–1
[69]
SALLME
LC–UV
0.58 µg L–1
[108]
LLE (n–hexano)
GC–ECD
3.2 µg L–1
[95]
LLE (n–hexano)
GC–ECD
6.7 µg L–1
[95]
LLE (n–hexano)
GC–ECD
33 ng L–1
[77]
HS–SPME
GC–ECD
20 ng L–1
[97]
LLE (n–hexano)
GC–ECD
0.19 µg L–1
[86]
HS
GC–MS
30–80 ng L–1
[61]
MLLE (n-hexano)
GC–MS
10–80 ng L–1
[62]
PFBHA
Mezcla de aldehídos aromáticos
y alifáticosa, b)
PFBHA
Composición de las mezclas: formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, butiraldehído, valeraldehído, glioxal, metilglioxal,
benzaldehído, 3-metilbenzaldehído, 2-etilbenzaldehído y 2,5-dimetilbenzaldehído [61]. En la referencia [62] se incluyen además 3hidroxibenzaldehído y 2,5-dihidroxibenzaldehído.
b) Se emplea un sistema de inyección de elevados volúmenes de muestra en conjunción con un inyector de temperatura programable.
a)
Capítulo 1
Dado que la presencia de aldehídos como DBPs en muestras de agua se
debe fundamentalmente a su formación tras un tratamiento con ozono, este tipo de
aguas ha sido el objeto del análisis más común en los métodos publicados [61,95,97]
seguido del agua de piscina [62,77].
En definitiva, como conclusión más relevante se puede indicar que son
escasas las investigaciones que se refieren a la determinación de aldehídos
aromáticos en este tipo de muestras, y las existentes se centran básicamente en la
determinación de aldehídos alifáticos incluyendo en el estudio al benzaldehído. No
existen en la bibliografía, estudios sistemáticos sobre la determinación de aldehídos
aromáticos como DBPs en muestras de agua por LC; sólo se puede reseñar dos
contribuciones recientes de nuestro Grupo de Investigación mediante GC–MS
[61,62]. Tampoco se han encontrado referencias sobre este tipo de estudios
mediante CE, si bien se ha de reseñar una contribución en la que se aborda la
determinación de varios aldehídos aromáticos (benzaldehído y su metil- y 2,5dimetil- derivado) en mezcla con otros 13 compuestos carbonílicos mediante
MEKC, aunque se aplica al análisis de muestras de aire [58]. Estos resultados ponen
claramente de manifiesto la necesidad del desarrollo de metodologías analíticas, en
especial mediante el uso de la LC y CE, enfocadas a la determinación de aldehídos
aromáticos en muestras de agua.
Ante esta situación, las investigaciones que se recogen en la presente Tesis
Doctoral se han centrado en la propuesta de metodologías analíticas para la
determinación de aldehídos aromáticos como DBPs en muestras de agua mediante
LC y CE con diferentes sistemas de detección. Dado que la presencia de aldehídos
alifáticos es más común en este tipo de muestras, las metodologías propuestas
abordan en definitiva el estudio y determinación de mezclas complejas de ambos
tipos de compuestos carbonílicos en muestras de agua. Se han seleccionado como
analitos aquellos aldehídos aromáticos que pueden estar presentes en muestras de
66
Introducción
agua como DBPs conforme a los datos presentes en la bibliografía: el Método EPA
8315A [6] incluye por su interés ambiental benzaldehído, 3-metil- y 2,5dimetilbenzaldehído y en otras publicaciones se indica la posible presencia de 2-etil3-hidroxi- y 2,5-dihidroxibenzalehído [2,64] como DBPs en muestras de agua.
67
Capítulo 1
6. Bibliografía
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129. L. Pan, J. Pawliszyn. Derivatization/solid–phase microextraction: New approach
to polar analytes. Analytical Chemistry 69 (1997) 196–205.
130. J. S. Aulakh, A. K. Malik, V. Kaur, P. Schmitt–Kopplin. A review on solid phase
micro extraction—high performance liquid chromatography (SPME–HPLC)
analysis of pesticides. Critical Reviews in Analytical Chemistry 35 (2005) 71–85.
131. B. Cancho, F. Ventura, M. T. Galceran. Determination of aldehydes in drinking
water using pentafluorobenzylhydroxylamine derivatization and solid–phase
microextraction. Journal of Chromatography A 943 (2001) 1–13.
132. P. A. Martos, J. Pawliszyn. Sampling and Determination of formaldehyde using
solid–phase microextraction with on–fiber derivatization. Analytical Chemistry 70
(1998) 2311–2320.
133. H. Kim, H. Shin. Simple and automatic determination of aldehydes and acetone
in water by headspace solid–phase microextraction and gas chromatography–
mass spectrometry. Journal of Separation Science 34 (2011) 693–699.
134. A. M. Casas Ferreira, M. E. Fernández Laespada, J. L. Pérez Pavón, B. Moreno
Cordero. In situ aqueous derivatization as sample preparation technique for gas
chromatographic determinations. Journal of Chromatography A 1296 (2013) 70–
83.
135. E. Baltussen, P. Sandra, F. David, C. Cramers. Stir bar sorptive extraction
(SBSE), a novel extraction technique for aqueous samples: Theory and principles.
Journal of Microcolumn Separations 11 (1999) 737–747.
81
Capítulo 1
136. J. B. Quintana, I. Rodríguez. Strategies for the microextraction of polar organic
contaminants in water samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry 384 (2006)
1447–1461.
137. C. Dietz, J. Sanz, C. Cámara. Recent developments in solid–phase
microextraction coatings and related techniques. Journal of Chromatography A
1103 (2006) 183–192.
138. M. L. Marina, Á. Ríos, M. Valcárcel, Analysis and Detection by Capillary Electrophoresis
(2005) Elsevier.
139. S. Terabe, K. Otsuka, K. Ichikawa, A. Tsuchiya, T. Ando. Electrokinetic
separations with micellar solutions and open–tubular capillaries. Analytical
Chemistry 56 (1984) 113–116.
140. M. Silva. Micellar electrokinetic chromatography: A review of methodological and
instrumental innovations focusing on practical aspects. Electrophoresis 34 (2013)
141–158.
82
Capítulo 2
Herramientas
analíticas
Herramientas analíticas
Se comentan en esta sección las diferentes herramientas analíticas utilizadas
en el desarrollo de la parte experimental de la presente Tesis Doctoral, tales como
estándares analíticos, reactivos, disolventes, instrumentos y aparatos, junto con sus
características más destacadas.
1. Estándares, reactivos y disolventes
Todos
los
estándares,
reactivos
y
disolventes
utilizados
en
las
investigaciones recogidas en la Tesis Doctoral son de pureza analítica.
1.1. Aldehídos
Los estándares de los aldehídos aromáticos y alifáticos que aparecen
reseñados en la Tabla 1 fueron suministrados por la firma Sigma–Aldrich Química
(Madrid, España).
Como estándar interno para la determinación de aldehídos mediante
cromatografía de líquidos con detección UV–Vis se ha empleado el 2-metil-1nitronaftaleno (≥99.0%), suministrado por Aldrich. Este compuesto fue
seleccionado por su similitud estructural con las especies implicadas en el proceso
de separación cromatográfica (DNPH–aldehídos aromáticos) y su ausencia natural
en la matriz de la muestra.
85
Capítulo 2
Todos los estándares fueron preparados en metanol a una concentración de
4.0 mg mL–1. Estas disoluciones se mantuvieron refrigeradas a 4 °C para su correcta
conservación. Las distintas disoluciones de trabajo fueron preparadas diariamente
en agua ultrapura en viales de vidrio.
Tabla 1 Aldehídos de bajo peso molecular objeto de estudio en esta Tesis Doctoral
con indicación de la pureza del estándar adquirido.
Aldehídos aromáticos
Aldehídos alifáticos
Benzaldehído (≥99.0%)
Formaldehído (37% p/v en agua)
3-metilbenzaldehído (≥97.0%)
Acetaldehído (≥99.5%)
2-etilbenzaldehído (≥88.0%)
Propionaldehído (≥96%)
2,5-dimetilbenzaldehído (≥99.0%)
Butiraldehído (≥99%)
3-hidroxibenzaldehído (≥97.0%)
Valeraldehído (≥97%)
2,5-dihidroxibenzaldehído (98.0%)
1.2. Reactivos
Como agente derivatizante de los aldehídos se utilizó en todas las
experiencias la 2,4-dinitrofenilhidracina (DNPH, ≥99%, Sigma–Aldrich). Su
disolución estándar, de concentración 60 mmol L–1, se preparó disolviendo 594.4
mg en 50 mL de una mezcla compuesta por ácido clorhídrico 12 mol L–1, agua
ultrapura y acetonitrilo en la proporción 2:5:1 (v/v/v). Esta disolución se conservó
86
Herramientas analíticas
en frigorífico y a partir de la misma se prepararon disoluciones diluidas en agua
ultrapura.
A lo largo de las investigaciones se hizo uso de distintos tipos de
surfactantes con diferentes finalidades:
1) Los surfactantes no–iónicos Triton X–100 (polioxietilen octil fenil éter),
Tween 20 (monolaurato de polioxietilen sorbitan) y Brij–35 (polioxietileno23-lauril éter), así como los iónicos SDS (dodecil sulfato sódico) y CTAB
(bromuro de hexadeciltrimetilamonio) fueron suministrados por Fluka
(Sigma–Aldrich Química. Madrid, España). Se emplearon como fase
pseudo–estacionaria en las investigaciones desarrolladas por cromatografía
electrocinética micelar (MEKC) recogidas en el Capítulo 5.
2) Los citados surfactantes y otros “agentes micelares” como β-ciclodextrina y
ácido cólico y derivados (todos ellos suministrados por Sigma–Aldrich) se
emplearon como agentes modificadores en el proceso de derivatización in
situ de los aldehídos con DNPH (Capítulo 3) haciendo uso del micro
sistema de extracción en fase sólida que se comentará posteriormente.
3) Se utilizó acido fórmico (0.1% en agua) como aditivo de la fase móvil del
sistema cromatográfico utilizado en los métodos LC–MS recogidos en el
Capítulo 4.
4) Disoluciones de diferentes concentraciones de ácido clorhídrico e hidróxido
de sodio se emplearon para el ajuste del pH de muestras, diferentes
disoluciones reguladoras y buffers de separación utilizados en electroforesis
capilar.
87
Capítulo 2
1.3. Disolventes
Durante el desarrollo de las investigaciones se emplearon básicamente como
disolventes acetonitrilo,
– para acondicionar las micro columnas de extracción en fase sólida y elución
de los analitos adsorbidos en ellas,
– como modificador orgánico en los buffers de separación utilizados en
electroforesis capilar,
– como componente de la fase móvil en los métodos de cromatografía de
líquidos con detección UV–Vis,
y metanol para la preparación de las disoluciones estándar de los aldehídos y como
uno de los componentes de la fase móvil en los métodos de LC–MS.
1.4. Orina sintética
Se ha empleado la orina sintética Surine™ Control Negativo adquirida a
Dyna–Tek Inc. (Lenexa, KS) como blanco en el proceso de optimización de la
metodología desarrollada en el Capítulo 5 para la determinación de aldehídos en
muestras de orina. Su composición mimetiza la orina humana sin los inconvenientes
de olor, formación de espuma y de riesgo biológico. Certificado de análisis: pH, 7.0;
gravedad específica (densidad), 1.008; apariencia, consistente.
88
Herramientas analíticas
2. Sistema continuo de extracción en fase sólida
Se han diseñado y montado en el propio laboratorio sistemas continuos de
µ–SPE que permiten automatizar y miniaturizar el proceso de derivatización y
preconcentración simultánea de los aldehídos aromáticos y alifáticos con DNPH.
Estos sistemas sustituyen a los tediosos procedimientos manuales (batch) que
comportan una mayor intervención por parte del operador, con la consecuente
introducción de errores; reducen el tiempo necesario para llevar a cabo el proceso
de derivatización; proporcionan elevados valores de factores de preconcentración; y
minimizan el contacto de la muestra con el exterior lo que evita la pérdida de los
analitos presentes en ella por volatilización. En la Figura 1 se muestra un diagrama
esquemático del sistema de µ–SPE de flujo continuo empleado en las
investigaciones recogidas en la presente Memoria.
Acetonitrilo
Bomba peristáltica
Aire
0.5 mL min–1
IV2
DNPH
1.0 mg. 1 mL min–1
Desecho
Bucle
Desecho
(100 µL )
SV
IV1
Muestra de agua
1) 50 mL (1.25 mol L–1 HCl, 2 mmol L–1 β-CD). 1 mL min–1
2) 100 mL (2 mol L–1 HCl). 2.5 mL min–1
1) LiChrolut EN, 25 mg
2) Telos TM ENV, 25 mg
Figura 1 Diagrama del sistema continuo de µ–SPE empleado en los procesos de
derivatización/preconcentración in situ de aldehídos en aguas.
89
Capítulo 2
Los componentes del sistema continuo de µ–SPE son:
– Micro–columnas de SPE fabricadas en el laboratorio. Se introduce
cuidadosamente cantidades reducidas de material sorbente del orden de mg,
en capilares PTFE de 3 mm de diámetro interno. A continuación se sellan
sus extremos con pequeñas porciones de fibra de vidrio. Los materiales
sorbentes que se han empleado son:
1) LiChrolut EN (sorbente polimérico de base poliestireno–
divinilbenceno). Tamaño de partícula, 40–120 µm. Área
superficial 1200 m2 g–1. Suministrado por Merck (Darmstadt,
Alemania).
2) Telos ENV (copolímero de poliestireno divinilbenceno
adecuado para la extracción de analitos polares en muestras
acuosas). Tamaño medio de partícula, 80 µm. Área superficial ~
900 m2 g–1. Cedido amablemente por Kinesis Inc. (Vidrafoc S.A.
Madrid, España).
3) RP–C18 (sílice enlazada a grupos octadecilo). Tamaño de
partícula, 50 µm. Área superficial, 600 m2 g–1. Adquirido en
Sigma.
4) Dowex 50WX8. Resina polimérica de intercambio catiónico
fuerte. Tamaño de partícula, 20–50 mesh. Capacidad 1.1 meq
mL–1. Suministrada por Fluka.
– Bomba peristáltica (Gilson Miniplus–3, Middleton, WI, USA). Impulsan las
disoluciones de reactivos y muestras a través del sistema continuo de µ–
SPE.
– Válvulas de inyección (IV) Rheodyne 5041 de seis vías (Cotati, CA, USA).
En el bucle de una de ellas se instaló la micro–columna de SPE en la que se
90
Herramientas analíticas
lleva a cabo la preconcentración y derivatización in situ de los aldehídos
presentes en la muestra. El bucle de la otra válvula de inyección permite fijar
el volumen de disolvente utilizado para la elución de las hidrazonas
formadas previamente en la micro–columna.
– Válvulas de selección (SV). Permiten introducir de forma secuencial las
disoluciones de reactivo derivatizante y de muestra de agua en el sistema de
flujo continuo.
– Tubos de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0.5 mm de diámetro interno para
conducción de las disoluciones y bucles (loop) de elución.
– Conectores de PTFE (Omnifit) para unir los tubos de conducción de los
diferentes componentes del sistema de flujo.
3. Instrumentación
En el desarrollo experimental de la Tesis Doctoral se ha utilizado la
siguiente instrumentación:
3.1. Cromatógrafo de líquidos
Se han empleado dos equipos de la firma Varian (Palo Alto, California,
USA) en el desarrollo de la parte experimental de los Capítulos 3 y 4 de esta Tesis
Doctoral.
El sistema LC–DAD (Capítulo 3) está compuesto por una bomba de
gradiente Varian 230 acoplada a un inyector Rheodyne 7215 (volumen del bucle de
91
Capítulo 2
inyección 20 µL) y a un detector PDA Varian 335 para las medidas de absorbancia a
380 nm. La separaciones de los DNPH derivados de los 11 aldehídos mostrados en
la Tabla 1 se llevaron a cabo en una columna Microsorb–MV RP–C18 (250 mm ×
4.6 mm, 5 µm) suministrada por Análisis Vínicos (Ciudad Real, España). Se empleó
un gradiente lineal de 60–80 acetonitrilo:agua a una velocidad de 1.2 mL min–1 como
fase móvil consiguiéndose la separación en ~ 18 min. Los datos obtenidos (tiempos
de retención y áreas de pico) se procesaron con el software 6.41 Varian Star
Chromatography Workstation.
El instrumento LC–MS utilizado en las investigaciones recogidas en el
Capítulo 4 está equipado con dos bombas isocráticas de alta presión (Varian
ProStar 210), un automuestreador que permite la inyección de 8 µL de muestra, un
compartimento para termostatizar la columna (Varian ProStar 410) y un
espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (Varian MS 1200L) con una fuente de
ionización por electrospray. En este caso los DNPH–derivados fueron separados en
~ 13 min empleando una columna Ascentis® Express C18 (150 mm × 2.1 mm, 2.7
µm), adquirida en Sigma, a 40 °C y con un gradiente de fase móvil entre ácido
fórmico al 0.1% y acetonitrilo:metanol a una velocidad de flujo de 0.2 mL min–1. La
detección mediante MS (ionización negativa) se realizó en modo SIM. Todo el
proceso fue controlado con el software Varian MS Workstation Version 6.3.
3.2. Electroforesis capilar
Los análisis por MEKC de los DNPH–derivados de los aldehídos que se
describen en el Capítulo 5 se llevaron a cabo con un equipo de electroforesis capilar
P/ACE MDQ Beckman (Fullerton, California, USA) equipado con un detector
UV–Vis de diodos en fila (DAD). Se emplearon capilares de sílice fundida de 50 µm
de diámetro interno con una longitud efectiva entre la muestra y el detector de 50
92
Herramientas analíticas
cm (longitud total del capilar de 57 cm). Tras la inyección hidrodinámica de la
muestra (0.5 psi durante 5 s) la separación mediante MEKC de los DNPH
derivados se llevó a cabo en la modalidad de polaridad inversa a 25.0 ± 0.1 ºC bajo
la aplicación de un voltaje de 25 kV en ~ 14 min, registrándose los
electroferogramas a 360 nm. El buffer de desarrollo está constituido por disodio
monohidrógeno fosfato 75 mmol L–1 a pH 7.2 y CTAB 50 mmol L–1 en presencia
de un 30% de acetonitrilo. Tanto la adquisición y el procesamiento de datos, como
el control del instrumento se realizan con un ordenador PS/2 (IBM, Greenwock,
Reino Unido) ejecutando el software 32 KaratTM (versión 8.0).
3.3. Otros instrumentos
– Balanza analítica de precisión (Oahus, modelo Explorer).
– pH–metro (Crison, modelo MicropH 2000).
4. Aparatos
– Baño termostático (Exacal, modelo EX–110).
– Agitador magnético (Ovan, modelo Minimix MN02 E).
– Equipo de agua Milli–Q (Millipore, Bedford, MA, EEUU).
93
PARTE EXPERIMENTAL
Capítulo 3
Mejoras en la eficiencia de la
derivatización de aldehídos aromáticos.
Determinación mediante LC–DAD
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
Los aldehídos aromáticos de bajo peso molecular se encuentran en la
atmósfera como consecuencia principalmente de procesos industriales, así como
resultado de emisiones de vehículos o bien como productos de la fotoxidación de
hidrocarburos. Además, estos compuestos aparecen en aguas naturales debido a la
degradación fotoquímica de la materia orgánica disuelta y recientemente se han
detectado como subproductos de desinfección en aguas de consumo generados en
reacciones de la materia orgánica tras su tratamiento con ozono principalmente. A
pesar de esto, los estudios sobre la presencia y determinación de aldehídos
aromáticos en muestras de aguas son escasos, aún teniendo en cuenta el interés
creciente suscitado por estos contaminantes entre la población, cada vez más
expuesta a aguas contaminadas.
Los aldehídos aromáticos presentan las mismas dificultades que los alifáticos
para su determinación. La volatilidad de estos compuestos, su inestabilidad química
y la ausencia de grupos cromóforos o fluoróforos en su molécula impiden su
determinación directa, por lo que la derivatización es imprescindible para llevar a
cabo su determinación mediante el empleo de técnicas cromatográficas. El método
recomendado por la EPA para la determinación de estos compuestos mediante
cromatografía de líquidos implica una etapa de derivatización en batch con 2,4dinitrofenilhidracina (DNPH), posterior extracción en fase sólida con C18 de las
hidrazonas formadas y elución de las mismas con un disolvente orgánico
(generalmente acetonitrilo). Este extracto orgánico se suele llevar a sequedad y
posteriormente se reconstituye en un pequeño volumen de disolvente orgánico para
así aumentar el factor de preconcentración y con ello la sensibilidad del método. Sin
99
Capítulo 3
embargo, el alto consumo del disolvente orgánico, el elevado tiempo de reacción
requerido y la baja selectividad del sorbente C18 han originado el desarrollo de
nuevas metodologías que emplean formatos miniaturizados para llevar a cabo la
etapa de extracción en fase sólida (SPE). Aunque estos métodos destacan por su
rapidez, bajo volumen de disolvente orgánico empleado y eliminación del paso extra
de sequedad/reconstitución del extracto en un pequeño volumen de disolvente
orgánico, presentan inconvenientes ya que sólo permiten manipular pequeños
volúmenes de muestra (del orden de 1 mL) y el sorbente empleado en el sistema de
SPE no es comercial y por tanto se ha de sintetizar en el propio laboratorio.
En el presente capítulo se recogen dos publicaciones en las que se han
desarrollado y evaluado distintas estrategias analíticas para mejorar la eficiencia de
diferentes etapas del proceso de tratamiento de muestra: (i) reacción de
derivatización de los analitos con DNPH; (ii) preconcentración; y (iii) elución de los
derivados. Estas investigaciones pretenden cubrir la ausencia de metodologías en la
bibliografía sobre la determinación sistemática de aldehídos aromáticos en muestras
de agua. Los aspectos más relevantes de estas investigaciones son:
– La selección de los analitos se ha realizado de acuerdo con los recogidos en
el Método EPA 8315A y con aquellos cuya presencia se ha descrito en la
bibliografía referente al análisis de muestras de agua sometidas a procesos de
desinfección. En consecuencia, se incluyen en este estudio benzaldehído,
derivados hidroxilados y alquil–derivados.
– Desarrollar un sistema miniaturizado de extracción en fase sólida (µ–
SPE/LiChrolut EN), empleando DNPH como reactivo derivatizante, como
alternativa a la técnica de batch generalmente utilizada en la bibliografía.
– Estudiar el efecto de la adición de diferentes modificadores a la muestra de
agua tales como agentes micelares, ácidos biliares, éteres corona, etc. con
100
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
vistas a conseguir la máxima eficiencia en el proceso de derivatización y
preconcentración de los aldehídos.
– Aplicar la metodología desarrollada a muestras de agua de distinta
procedencia (cauces naturales, piscinas exteriores e interiores y agua de
bebida). En este contexto, y dada la presencia documentada de aldehídos
alifáticos en el tipo de muestras de agua a analizar, éstos se deben incluir en
el proceso de optimización de la separación mediante LC–DAD, por lo que
en definitiva se aborda la determinación de aldehídos alifáticos y aromáticos
en muestras de agua tratadas.
101
Talanta
journal homepage: www.elsevier.com/locate/talanta
Talanta 85 (2011) 449–454
Improved solid–phase extraction/micellar procedure
for the derivatization/preconcentration of benzaldehyde
and methyl derivatives from water samples
José María Fernández–Molina and Manuel Silva
Department of Analytical Chemistry, Rabanales Campus, University of Cordoba
Received 18 November 2010; received in revised form 28 March 2011; accepted 3 April 2011
Abstract
A simple, rapid and sensitive method has been developed for the
determination of aromatic low–molecular mass aldehydes (LMMAs) such as
benzaldehyde (BA) and methyl derivatives in water samples through the use of
liquid chromatography–diode array detection (LC–DAD). The method is based on
the
continuous
in
situ
derivatization
of
the
aldehydes
with
2,4-
dinitrophenylhydrazine (DNPH) on a LiChrolut EN solid–phase extraction (SPE)
column in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS) micelles. After elution,
hydrazones were successfully separated on a RP–C18 column using a linear gradient
mobile phase of acetonitrile (ACN)–water at 75–95% ACN for 10 min. Linearity was
established over the concentration range 0.4–200 µg L–1 and limits of detection
(LODs) from 120 to 200 ng L–1 ; the inter–day precision expressed as the relative
standard deviation (RSD) of the aldehydes ranged from 3.0% to 3.5%. The method
was successfully applied to the analysis of aromatic and aliphatic LMMAs in water
samples with average recoveries ranging between 93.6% and 99.5%. The proposed
method surpasses other chromatographic alternatives in terms of LODs, sample
requirements for analysis and cost.
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
1. Introduction
Aldehydes are one of the most important classes of organic compounds that
are known for toxicity and carcinogenic properties, hence the increased interest in
their analysis in recent years. These carbonyl compounds are present in the
atmosphere as a primary source of pollutants derived from industrial processes and
vehicular exhaust, and are produced furthermore as secondary pollutants of the
photooxidation of atmospheric hydrocarbons [1–4]. Because aldehydes are water
soluble, they are deposited on the ground and the sea surface as rain, which
constitutes an important removal mechanism for these compounds that can
influence ecosystem health [5–7]. The presence of these compounds has been
reported in natural waters due to the photochemical degradation of dissolved
oxygen matter [8,9] and more recently in drinking waters as disinfection by–
products produced primarily from organic matter present in water after treatment
with ozone [5,10–12]. In addition, various aldehydes are also recognized as potential
indicators of lipid oxidation in food [13,14] and as diagnostic markers of cancer
status [15–17]. In view of the widespread presence of these compounds, accurate
aldehyde measurements are important both on order to study the formation
mechanism of aldehydes and to evaluate their implications for human health.
The direct determination of LMMAs is complicated due to their high
polarity, chemical instability, volatility and the absence of a chromophore or
fluorophore group in their chemical structure. In view of all these worrying
peculiarities, derivatization reactions are required prior to their detection by
chromatographic techniques. Although a variety of derivatizing reagents have been
reported
for
this
purpose,
2,3,4,5,6-(pentafluorobenzyl)
hydroxylamine
hydrochloride (PFBHA) [18–25] and DNPH [26–39] are the most widespread
choices for gas chromatography (GC) and LC analysis, respectively. Both
derivatizing reagents are included in the U.S. Environmental Protection Agency
105
Capítulo 3
(EPA) Methods 556.1 and 8315A for the determination of free carbonyl
compounds in various matrices [40,41]. Over recent years, LC–DNPH methods are
increasingly being viewed as a useful alternative to GC–PFBHA ones for the
determination of these aldehydes in liquid samples, particularly in waters [34–39].
Aromatic LMMAs have scarcely been determined in water samples even though
interest in the analysis of aldehydes has increased significantly in recent years
because human are becoming more and more exposed to contaminated waters. To
our knowledge, no reference has been reported for the determination of aromatic
aldehydes in water samples by LC using DNPH. Recently, the analysis of BA in
spiked water samples has been the subject of two sporadic studies [34,37].
In the present work, a rapid and sensitive method for the determination of
aromatic LMMAs by LC–DAD is developed based on the combination of an
efficient SPE system with a SDS micellar medium for the in situ derivatization of
aldehydes with DNPH. In previous works [35,36], we have determined aliphatic
LMMAs
at
microgram–per–litre
levels
in
waters
after
their
in
situ
derivatization/preconcentration with DNPH using a continuous–flow SPE
approach by LC with UV [35] and mass spectrometric (MS) [36] detection. In this
work, a micellar medium for improving the efficiency of the DNPH derivatization
process is presented and the SPE approach is extended to the analysis of aromatic
LMMAs in water samples. To our knowledge, this study constitutes the first report
on the enhancing effect of micelles on the DNPH derivatization of aldehydes. BA,
3-methylbenzaldehyde (3-MBA) and 2,5-dimethylbenzaldehyde (2,5-DMBA) have
been selected in this study because they are included as target analytes in the list
provided by EPA Methods 556.1 and 8315A [40,41] for the determination of
carbonyl compounds in air and water samples.
106
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
2. Materials and methods
2.1. Standards and solutions
All solvents and reagents were of analytical grade and used without further
purification. Water was purified using an Elix–3 electrodeionization station coupled
with a Milli–Q Simplicity water purification system (Millipore Ibérica S.A., Madrid,
Spain). BA (≥99.0% purity), 3-MBA (≥97% purity), 2,5-DMBA (≥99% purity) and
2-methyl-1-nitronaphthalene (≥99% purity), as an internal standard (IS), were
supplied by Aldrich (Sigma–Aldrich Química, Madrid, Spain). Formaldehyde (C1,
37% w/v solution in water) and acetaldehyde (C2, ≥99.5% purity) were supplied by
Sigma (Sigma–Aldrich Química), whereas propionaldehyde (C3, ≥96% purity),
butyraldehyde (C4, ≥99% purity) and valeraldehyde (C5, ≥97% purity) were
acquired from Fluka (Sigma–Aldrich Química). Standard stock solutions of each
carbonyl compound and the IS with a concentration of 4000 µg mL–1 were prepared
by dissolving an appropriate amount in chromatographic grade methanol (Romil
Chemicals, Cambridge, UK); standard mixtures of the analytes were prepared daily
by dilution of the corresponding stock solutions with purified water as required.
Stock DNPH (≥99% purity, Fluka, Sigma–Aldrich Química, Madrid, Spain)
solution, 60 mmol L–1, was made by dissolving 594.4 mg of the derivatizing reagent
in 50 mL of concentrated hydrochloric acid:water:ACN solution (2:5:1). A solution
containing 0.25 mg mL–1 (1.25 mmol L–1) DNPH was prepared by appropriate
dilution of the stock solution with purified water. All standard, DNPH and IS
solutions were stored at 4 °C. LiChrolut EN (particle size 40–120 µm, surface area
~ 1200 m2 g–1) was provided by Merck (Darmstadt, Germany). SDS, polyethylene
glycol tert–octylphenyl ether (Triton X–100), and polyoxyethylene (23) lauryl ether
(Brij–35) were purchased from Fluka whereas cetyl trimethy-lammonium bromide
(CTAB) was supplied by Sigma. Other solvents and chemicals were purchased from
Romil Chemicals and Merck.
107
Capítulo 3
2.2. Derivatization/preconcentration of aldehydes
A schematic diagram of the setup of the continuous–flow SPE system used
in this study for the in situ DNPH derivatization/preconcentration of aldehydes is
given in Figure 1.
Eluent
mL min-1
Air
0.5
IV2
W
100 L
DNPH
IV1
W
1.0
Sample
SV
Figure 1
LC–DAD
LiChrolut EN
column
Continuous–flow SPE system developed for the determination of aromatic
LMMAs in water samples. IV, injection valve; SV, selection valve; W, waste.
Initially, the laboratory–made sorption column (PTFE, 3 mm id, 1.0 cm
long) packed with 25 mg of LiChrolut EN sorbent material and located in the loop
of the injection valve IV1 (Rheodyne, Cotati, CA, USA) was conditioned with 1.0
mL of ACN and then 1.0 mL of purified water both delivered at a flow rate of 0.5
mL min–1 using a Minipuls–3 peristaltic pump (Gilson, Middleton, WI, USA) fitted
with poly(vinylchloride) tubes. After conditioning, the SPE column was
impregnated with 2.0 mL of 0.25 mg mL–1 DNPH solution at 1.0 mL min–1. Then, a
volume of 25 mL of standard solution or water sample with a concentration
between 0.5 and 250 µg L–1 of aldehydes and 400 µg L–1 of IS in a 50 mmol L–1 SDS
and 1.0 mol L–1 hydrochloric acid medium was continuously loaded into the system
at 1.0 mL min–1 using the selecting valve (Rheodyne). The aldehydes were
108
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
derivatized in situ with DNPH on the LiChrolut EN column and the sample matrix
was sent to waste. Simultaneously, the loop of injection valve IV 2 (Rheodyne) was
filled with the eluent by using a syringe. Prior to elution, by switching IV1, residual
aqueous solution inside the column and the connectors were flushed by passing an
air stream through the carrier line of IV2 at 0.5 mL min–1 for 2 min. In the elution
step, IV2 was switched and 100 µL of ACN carried by an air stream at 0.5 mL min–1,
were passed through the column (upstream through the sample) to elute derivatives.
The extract was collected in an Eppendorf vial and 20 µL aliquot was injected into
the LC. LiChrolut EN columns prepared sequentially provided analytical signals
with similar DNPH derivative peak areas, which confirmed their high
reproducibility. Under these experimental conditions, the SPE column was
serviceable for about 6 months.
2.3. LC analysis
The LC system (Varian, Palo Alto, CA, USA) included a Varian 230
multisolvent pump and a Varian 335 DAD. A Rheodyne Model 7215 manual
injection valve with a 20 µL sample loop was used for sample injection. Separations
were performed on the Microsorb–MV 100–5 analytical column, 250 mm × 4.6
mm id, stainless steel tube packed with octadecylsilane and 5 µm particle sizes. The
DAD was operated at 380 nm. DNPH–aldehydes were chromatographically
separated with this LC system by using a linear ACN–water gradient 75–95% ACN
in ca. 10 min circulated at 1.0 mL min–1. Under these conditions, all derivatives were
eluted within about 9 min. Chromatographic data (retention times and peak areas)
were processed with a 6.41 Varian Star Chromatography Workstation interfaced to
a PC compatible computer.
109
Capítulo 3
3. Results and discussion
3.1. Optimization of the in situ derivatization/preconcentration of aldehydes
The optimization of the continuous–flow SPE system used in this work for
the cleanup, derivatization and preconcentration of aromatic LMMAs is based on
one reported elsewhere by us for aliphatic LMMAs [35]. However, and because
aromatic LMMAs have a smaller polarity and volatility than aliphatic ones, some
variables have been re–optimized. So, the acidity of the aqueous sample, adjusted
with hydrochloric acid, was studied in the 0.5–3.0 mol L–1 range. All aromatic
LMMAs behaved similarly: the analytical signal showed a peak at about 1.0 mol L –1
hydrochloric acid over the range studied (see Figure 2A), and therefore this
concentration was selected as optimal. By comparing to aliphatic LMMAs, they
require less acidity for DNPH derivatization (pH 1.5) [35]. This behaviour can be
ascribed to the different charge distribution in the carbonyl group when comparing
both types of LMMAs [42]. In fact, the C=O bond in aromatic LMMAs has a
higher dipole moment and as a result, higher acidity is required for the protonation
of carbonyl oxygen prior to the nucleophilic attack of the amine group of DNPH to
form the corresponding hydrazone. The amount of DNPH was studied in the range
of 0.1–1.0 mg by passing 2.0 mL of derivatizing reagent solution through the SPE
system at a rate of 1.0 mL min–1. Maximum analytical signals were obtained for
DNPH amounts of ca. 0.5 mg for all aldehydes and afterwards they remained
practically constant. This amount of DNPH provided a DNPH to aldehydes molar
ratio higher 30000 for the lower concentrations in the linear ranges shown in Table
1. Other SPE variables studied were the organic solvent used as eluent and its
volume, the flow–rate of the air stream used as carrier for the eluent and the
amount of LiChrolut EN sorbent for which the following conditions were selected:
eluent, 100 µL of ACN flowing at 0.5 mL min–1 by using an air stream; and sorbent
material, 25 mg.
110
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
Figure 2
Effect of (A) acidity of the sample solution and (B) SDS concentration on the
derivatization of aromatic LMMAs. BA (○), 3-MBA (Δ) and 2,5-DMBA (●) at
50 µg L–1. Sample volume, 10 mL. Other conditions as described in Section 2.
Each data point represents an average of three individual runs and error bars
indicate SD.
111
Capítulo 3
At this point and with the aim of increasing the sensitivity of the proposed
method further experiments were carried out, such as the evaluation of the possible
influence of surfactants on the derivatization of aromatic LMMAs and the
determination of the breakthrough volume, which is simply a measure of the sample
that may be passed through the sorbent before the aldehyde is no longer derivatized
with DNPH. In the first instance, anionic (SDS), cationic (CTAB) and non–ionic
(Triton X–100 and Brij–35) surfactants at concentrations below and above their
respective critical micelle concentration (CMC) were added to the sample solution.
From the results found, it can be concluded that nonionic micelles practically did
not affect the peak area corresponding to each aldehyde derivative, whereas cationic
micelles strongly interfered with the determination of aromatic LMMAs due to the
presence of interfering peaks that co–eluted with those of BA and 3-MBA
derivatives. Only SDS at concentrations higher than its CMC proved to be suitable
to increase the sensitivity for the determination of aromatic LMMAs: the peak areas
increased about 30–40% in the presence of this micellar medium at SDS
concentrations over 50 mmol L–1 (see Figure 2B), and therefore this concentration
was chosen as the optimum. This influence can be ascribed to interactions between
the benzene ring of the aromatic LMMAs and the micellar core, which could favour
the protonation of carbonyl oxygen (rate–determining step for the formation of the
hydrazones [42]) with the subsequent increase in the derivatization efficiency.
Finally, the breakthrough volume was evaluated in order to attain the greatest
enrichment factor. This study was carried out by adding 250 ng of each aldehyde in
variable volumes of purified water, from 5 to 50 mL, in a 50 mmol L –1 SDS and 1.0
mol L–1 hydrochloric acid. Sample volumes up to 25 mL can be used with negligible
changes in chromatographic signals, although only a decrease of ca. 15% was
observed for the corresponding peak areas at higher sample volumes (up to 50 mL).
In any case, a sample volume of 25 mL flowing at 1.0 mL min–1 was selected for
further experiments, which provided a preconcentration factor of 250 for aromatic
112
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
LMMAs, allowing their detection in water samples at ng L–1 levels.
3.2. Chromatographic optimization
The composition of the mobile phase and its flow rate were optimized in
order to provide the most suitable conditions for LC determination of aromatic
LMMA–DNPH derivatives. Because DNPH derivatives of aliphatic LMMAs were
efficiently separated in a C18 column using gradient elution with ACN in water [36,
38,41], this mobile phase composition was also assayed in this study. Thus and
based on experimental results, an isocratic mobile phase of ACN–water (95:5 v/v)
circulating at 1.0 mL min–1 was used to separate DNPH–aldehydes in ca. 5 min
using a 5–µm analytical reversed–phase C18 column (25 cm × 4.6 mm). As can be
seen in Figure 3A, the elution order for DNPH derivatives of the aromatic
LMMAs was consistent with the polar character of these compounds. With a view
to applying the proposed method to the determination of these aromatic LMMAs in
water samples, and bearing in mind the possible presence in these samples of
aliphatic ones, some experiments were carried out to evaluate the possible effect of
these aliphatic aldehydes on the chromatographic separation. Thus, mixtures of the
most common aliphatic LMMAs found in waters (C1–C5 aldehydes) and the
aromatic LMMAs were analyzed under optimum conditions and some of the peaks
observed in the chromatogram co–eluted with those of aromatic aldehydes (see
Figure 3A). However, by using a linear gradient elution of ACN in water (75–95%
in ACN for 10 min), all peaks were practically separated to the baseline (see Figure
3B) with the exception of C1, which co–eluted with the excess of DNPH.
113
Capítulo 3
3.3. Analytical performance characteristics
The performance and reliability of the proposed method were assessed by
determining the regression equation, linear range, LOD and precision expressed as
RSD for the aromatic LMMAs studied. For this purpose, 50–200 µL of working
standard solutions containing analytes at variable concentrations were spiked to 25
mL of uncontaminated water in the 0.4–200 µg L–1 interval plus the IS (400 µg L–1)
and treated as described in Section 2. Calibration curves were obtained by plotting
the analyte to the IS peak area against the analyte concentration. Table 1 gives the
linear ranges and the least–squares parameters of the working curves. Calibration
curves showed a wider linear range (from 0.4 to 200 µg L–1) with adequate linearity
(correlation coefficients greater than 0.9991). LOD, defined as the lowest
concentration of the analyte in a sample that provides a chromatographic signal
three times higher than background noise [43], ranged from 0.12 to 0.20 µg L–1. The
precision of the method expressed as the RSD was obtained by analyzing 6 samples
per run of 25 mL of uncontaminated water samples spiked with 20 µg L–1 of each
aldehyde on three different days (inter–day precision). The average RSD found was
ca. 3.3%, which demonstrates the excellent reproducibility of the method proposed.
Finally, the RSDs of the retention times were within 1.5%, which indicates the good
robustness of the method proposed.
At this point, it may be interesting to compare the analytical features of the
proposed method for the in situ DNPH derivatization/preconcentration of aromatic
LMMAs with reported chromatographic alternatives for the determination of these
carbonyl compounds in water samples. As stated above and to our knowledge, no
reference exists on LC determination of aromatic LMMAs in water samples using
DNPH as derivatizing agent; however, the analysis of BA in spiked water samples
has been the subject of two recent sporadic works focused on the evaluation of
114
Figure 3 Chromatograms for aromatic and aliphatic LMMAs using (A) an isocratic mobile phase of ACN–water (95:5 v/v), and
(B) a linear gradient elution of ACN in water from 75 to 95% in ACN. Aldehyde concentration, 50 µg L –1. Sample
volume, 25 mL. Other conditions as described in Section 2.
Capítulo 3
salt–assisted
liquid–liquid
microextraction
[34]
and
headspace
in–drop
derivatization [37] techniques for the determination of carbonyl compounds. In
these studies, the lowest limit for the quantitative determination of BA was ca. 10
µg L–1. In addition and by using other derivatizing reagents, a solid–phase
microextraction method for trace analysis of aromatic aldehydes in aqueous solution
has recently been reported by GC–MS [22]. In this method aldehydes were
derivatized with PFBHA at 80 °C for 30 min and the LODs achieved ranged from
0.2 to 0.5 µg L–1. Triazine–based hydrazine reagents have also been used for this
purpose using LC–DAD, although with lower sensitivity: LODs ranged from 10 to
100 µg L–1 [44]. These results lead to the conclusion that the proposed method is a
useful choice for the determination of these aldehydes in water samples as it
provides higher sensitivity than existing LC [34,37,44] and GC [22] alternatives,
even when using more expensive instrumentation such as GC–MS, and in all cases
with simpler sample handling.
Table 1 Characteristic parameters of the calibration equations and analytical figures of merit
for the determination of aromatic and aliphatic LMMAs.
Linear rangeb
LOD
RSD
Aldehyde
Calibration equationa
r2
BA
S = (0.181 ± 0.003) C + (0.8 ± 0.3)
0.9993
0.4 – 200
0.12
3.3
3-MBA
S = (0.153 ± 0.001) C – (0.1 ± 0.1)
0.9994
0.5 – 200
0.15
3.0
2,5-DMBA
S = (0.108 ± 0.001) C + (0.4 ± 0.2)
0.9991
0.7 – 200
0.20
3.5
C2
S = (0.225 ± 0.003) C + (0.3 ± 0.2)
0.9990
0.3 – 200
0.10
9.1
C3
S = (0.194 ± 0.004) C  (0.3 ± 0.2)
0.9987
0.4 – 200
0.12
9.0
C4
S = (0.124 ± 0.004) C + (1.4 ± 0.2)
0.9982
0.6 – 200
0.18
8.6
C5
S = (0.122 ± 0.004) C + (2.1 ± 0.2)
0.9979
0.6 – 200
0.18
8.3
a
b
S, analyte to the IS peak area; C, analyte concentration (µg L–1).
Sample volume, 25 mL.
116
(µg
L–1)
(µg
L–1)
(%)
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
3.4. Determination of aromatic LMMAs in water samples
The performance of the proposed method in the analysis of aromatic
LMMAs in waters was evaluated by analyzing different types of samples such as tap,
stream and mineral waters as well as water samples from indoor and outdoor
swimming pools. The detection and/or quantification of the C2 to C5 aliphatic
LMMAs have also been carried out, for which the corresponding calibration plots
were constructed under the experimental conditions described in Section 2 (see
Table 1). C1 was not included in this study because of its DNPH–derivative co–
eluted with the excess of the derivatizing reagent (see Section 3.2). Thus, volumes of
25 mL of water were analyzed, and the aldehydes found are listed in Table 2. The
following conclusions can be drawn: (i) drinking and tap waters did not contain
aromatic aldehydes (or they were below the LODs) and no aldehyde was detected in
drinking water; (ii) C2 and BA were the most common aldehydes quantified in the
analyzed water samples; (iii) as expected, a higher number of aldehydes were found
in swimming pool waters taking into account the treatment of this class of water,
and (iv) aldehyde concentrations were lower in outdoor swimming pool water
samples owed probably to the volatility of these compounds. On the other hand,
and in order to assess possible matrix effects, concentrations of aldehydes between
5 and 50 µg L–1 were spiked to the samples and the corresponding percentages of
recovery determined. No matrix effect was observed in the determination of these
aldehydes in this kind of water samples: the percentages of recovery ranged from
93.6% to 99.5%. Last, by way of example, Figure 4 shows the chromatogram
obtained in the analysis of indoor swimming pool water, where four aldehydes were
quantified.
117
Capítulo 3
Table 2 Results for the determination of aldehydes in water samples.
Water sample
Aldehyde
Contenta (µg L–1)
Added (µg L–1)
Average
recovery (%)
Tap
C2
1.2  0.1
N. D.
N. D.
N. D.
N. D.
N. D.
N. D.
5, 10
94.9
10, 25, 50
10, 25, 50
10, 25, 50
10, 25, 50
10, 25, 50
10, 25, 50
99.5
95.7
98.8
97.6
99.2
98.8
4.2  0.3
N. D.
N. D.
N. D.
5, 10
95.9
10, 25, 50
10, 25, 50
10, 25, 50
5, 10
10, 25, 50
10, 25, 50
99.4
95.2
98.5
96.3
99.3
98.7
10, 25
94.9
10, 25, 50
10, 25
10, 25, 50
10, 25
10, 25, 50
5, 10
99.5
94.0
98.2
97.6
98.9
97.9
5, 10
93.6
3.2  0.2
10, 25, 50
10, 25, 50
10, 25, 50
5, 10
99.4
94.8
98.3
97.4
3-MBA
N. D.
10, 25, 50
98.8
2,5-DMBA
N. D.
10, 25, 50
98.4
C3
C4
C5
BA
3-MBA
2,5-DMBA
Stream
C2
C3
C4
C5
BA
3-MBA
2,5-DMBA
Indoor swimming pool
C2
C3
C4
C5
BA
3-MBA
2,5-DMBA
Outdoor swimming pool
C2
C3
C4
C5
BA
N. D., No detection
a ± SD (n = 3)
118
3.2  0.1
N. D.
N. D.
24  2
N. D.
17  1
N. D.
11  1
N. D.
0.9  0.1
9.8  0.7
N. D.
N. D.
N. D.
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
4. Concluding remarks
In this work, continuous–flow SPE combined with SDS micelles was found
to be an effective tool for the in situ DNPH derivatization of aromatic LMMAs,
which provided a rapid, simple and cost–effective way of measuring these aldehydes
in water samples by LC–DAD with LODs at ng L–1 levels and good reproducibility.
The obtained results warrant the following comments: (i) to our knowledge,
this work constitutes the first report on the enhancing effect of micelles on DNPH
derivatization of aldehydes; (ii) the method introduces LC with DNPH as a
derivatizing reagent in the determination of aromatic aldehydes in water samples
and, in general, also extends the scope of the determination of these aldehydes in
this type of samples since very few papers have been published on this topic; and
(iii) the proposed method has some advantages over EPA Method 8315A based on
DNPH derivatization and LC–DAD, such as easier sample preparation, lower
consumption of solvents and reagents, shorter analysis time, lower LODs
(preconcentration factors up to 250 can be achieved) and better reproducibility.
Figure 4
Chromatogram of indoor swimming pool water
sample (see Table 2). Peak identification as
stated in Figure 3. For experimental conditions
see Section 2.
119
Capítulo 3
Acknowledgments
The authors gratefully acknowledge the financial support provided by the
Spanish Inter–Ministerial Commission of Science and Technology of the Ministry
of Education and Science under the CTQ2010–17008 and by the Junta de
Andalucía under PO7–FWM–02493. FEDER also provided additional funding.
J.M. Fernández–Molina would also like to acknowledge the Junta de Andalucía for
awarding him a predoctoral Grant.
120
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
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Simple and sensitive determination of low–molecular–mass
aromatic aldehydes in swimming pool water by LC–diode array
detector
José María Fernández–Molina and Manuel Silva
Department of Analytical Chemistry, Rabanales Campus, University of Cordoba
Received 7 April 2011; received in revised form 5 July 2011; accepted 5 July 2011
Abstract
This work reports the development of a simple method for the quantitative
determination of aromatic and aliphatic low–molecular–mass aldehydes (LMMAs)
as disinfection by–products (DBPs) in indoor swimming pool waters after
chlorination with a simplified SPE sample treatment. The method is based on the
continuous in situ derivatization/preconcentration of the aldehydes with 2,4dinitrophenylhydrazine (DNPH) on a LiChrolut EN column in the presence of βCD. After elution, the 2,4-dinitrophenylhydrazine derivatives were separated on an
RP–C18 analytical column using gradient of ACN–water at 60–80%. The optimized
sample treatment described here allowed the direct analysis of large volumes of
water in order to improve the sensitivity of the method; LODs in the 60–120 ng L–1
range were achieved for aromatic LMMAs by using a volume of 50 mL of water,
precision being 7.5% or better at a concentration level of 5 µg L–1. These results
indicate that the ensuing method is a useful choice for the determination of
LMMAs in water samples that provides better results than reported LC alternatives
in terms of the LOD (except for MS/MS detection), sample requirements for
analysis and cost.
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
1. Introduction
The introduction of water disinfection has caused a marked reduction in the
incidences of lethal waterborne microbial diseases and therefore has been one of
the most significant advances in public health in the last century [1,2]. Nevertheless,
disinfection by–products (DBPs) are formed when disinfectants react with naturally
occurring organic matters, anthropogenic contaminants, bromide and iodide during
the production of drinking water [3]. Owing to its low cost and high disinfection
capacity, chlorine is the most frequently used disinfection agent in the world for the
treatment of the drinking water [4,5]. However, there is a correlation between the
consumption of chlorinated drinking water and an increased risk for cancer as has
been shown in epidemiological studies [6–9]. To reduce the level and potential
health impact of DBPs, alternative disinfectants have been researched, the most
popular alternatives being ozone, chlorine dioxide and chloramines as well as their
combinations [10–14]. However, compared with chlorine, little is known about any
DBPs that these alternative disinfectants might produce. Ozone is perhaps the most
popular drinking water disinfectant used as an alternative to chlorine, partly due to
its effectiveness in killing microorganisms and also to the lack of production of
appreciable levels of chlorine–containing by–products. The most common
ozonation DBPs contain oxygen in their structure and are aldehydes and short–
chained carboxylic acids [10–12]. Among these, low–molecular–mass aldehydes
(LMMAs) constitute the most relevant group due to their adverse health effects [2,
9,11], which has led to the current interest in the analysis of these aldehydes as
pollutants in water samples [4,5,15–22]. On the other hand, the presence of
aromatic LMMAs (benzaldehyde and derivatives) as DBPs in water samples has
until now little repercussion, which is why they are being studied in this type of
samples. Thus, benzaldehyde (BA) [12,23,24] and 2,5-dihydroxybenzaldehyde (2,5DHBA) [4] have been identified as by–products from ozonation of drinking waters,
127
Capítulo 3
and the former was also found to be present in chlorine [5] and chlorine dioxide
[25] treated water samples. The use of these chlorinated disinfectants also originates
other BA derivatives such as 3-hydroxybenzaldehyde (3-HBA) [19] and 2ethylbenzaldehyde (2-EBA) [12]; in addition, the EPA Method 8315A includes 3methylbenzaldehyde (3-MBA) and 2,5-dimethylbenzaldehyde (2,5-DMBA) among
other target LMMAs to be determined in water samples [26].
The direct determination of aldehydes as DBPs in treated waters is
troublesome due to their high polarity, reactivity and volatility. In consequence, they
cannot be extracted easily from water and, as a result, methods for measuring these
carbonyl compounds require a previous derivatization step coupled with either GC
or
LC.
One
typical
derivatization
step
involves
the
use
of
pentafluorobenzylhydroxylamine (PFBHA) that reacts with aldehydes to form
nonpolar oximes that can be extracted into an organic solvent and analyzed by GC
[16–18]. The other procedure is based on the use of 2,4-dinitrophenylhydrazine
(DNPH) as the derivatizing agent followed by LC analysis of the hydrazones
formed [19–22]. Unlike pentafluorobenzylhydroxylamine, DNPH permits the
analysis of highly polar compounds with multiple polar substituents.
In this work, the high potential of DNPH for derivatization of aldehydes led
us to propose a simple method for a highly sensitive determination of the six
reported aromatic LMMA by–products (BA, 3-MBA, 2,5-DMBA, 2-EBA, 3-HBA
and 2,5-DHBA) in disinfected waters. To our knowledge, no systematic study has
been made to date for the analysis of these aromatic aldehydes as DBPs in treated
waters. In previous works, we determined aliphatic LMMAs at µg L–1 or ng L–1
levels in waters by LC–diode array detector (DAD) [21] or LC–MS/MS [22],
respectively, after their in situ derivatization and preconcentration with DNPH by
using a continuous–flow SPE unit. Although this SPE protocol is used, the present
work discusses the reaction conditions for derivatization and preconcentration of
128
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
aromatic LMMAs owing to the different polarities and reactivities of these
aldehydes with respect to aliphatic ones. The ensuing method provides LODs in the
nanogram–per–liter region by LC–DAD, which are a result of the higher
enrichment factors achieved and the use of a micellar medium to improve the
efficiency of DNPH derivatization. Analyses of water samples from indoor
swimming pools after chlorination illustrate the applicability of the method.
2. Materials and methods
2.1. Standards and reagents
All the solvents were of LC grade, and ultra–pure water was prepared by
using an Elix–3 electrodeionization station coupled with a Milli–Q Simplicity water
purification system (Millipore Ibérica S.A., Madrid, Spain). BA (≥99.0% purity), 2,5DHBA (98.0% purity), 3-HBA (≥97% purity), 3-MBA (≥97% purity), 2,5-DMBA
(≥99% purity), 2-EBA (≥88% purity) and 2-methyl-1-nitronaphthalene (≥99%
purity), as an internal standard (IS), were supplied by Aldrich (Sigma–Aldrich
Química, Madrid, Spain). Formaldehyde (C1, 37% w/v solution in water) and
acetaldehyde (C2, ≥99.5% purity) were supplied by Sigma (Sigma–Aldrich
Química), whereas propionaldehyde (C3, ≥96% purity), butyraldehyde (C4, ≥99%
purity) and valeraldehyde (C5, ≥97% purity) were acquired from Fluka (Sigma–
Aldrich Química). Each aldehyde stock solution (4.0 mg mL–1) was prepared in
methanol (Romil Chemicals, Cambridge, UK) and stored at 4 °C. Working and
standard solutions for calibration curves were prepared by diluting stock solutions
with water. DNPH was of analytical reagent grade (≥99% purity) and purchased
from Fluka. A 60–mmol L–1 stock solution of the derivatizing reagent was prepared
129
Capítulo 3
by dissolving 594.4 mg of DNPH in 50 mL of a solution containing concentrated
hydrochloric acid, water and ACN (2:5:1), and then storing it in a freezer for up to
30 days. Diluted solutions (2.5 mmol L–1 or 0.5 mg mL–1) were prepared in water.
SDS and β-CD were purchased from Fluka. LiChrolut EN (particle size 40–120 µm,
surface area ~ 1200 m2 g–1) was provided by Merck (Darmstadt, Germany).
2.2. Instruments and apparatus
Aldehyde determinations were carried out by using a Varian LC instrument
controlled by 6.41 Varian Star Chromatography Workstation interfaced to a PC–
compatible computer. The LC instrument was equipped with a Microsorb–MV 1005 C18 250 × 4.6 mm (5 µm) column (Varian, Palo Alto, CA, USA), a Varian 230
multisolvent pump, a Rheodyne Model 7215 injector (Cotati, CA, USA) fitted with
a 20–µL injection loop and a Varian 335 PDA detector. DNPH–aldehydes were
chromatographically separated by using a linear gradient mobile phase of 60–80%
ACN–water circulated at 1.2 mL min–1 for 0–25 min. Under these conditions, all
derivatives were eluted within about 19 min. The continuous–flow configuration
was assembled from a Gilson Minipuls–3 peristaltic pump (Middleton, WI, USA)
fitted with poly(vinylchloride) pumping tubes, two Rheodyne 5041 injection valves
(Cotati) and PTFE (3 mm id) laboratory–made column packed with 25 mg of
LiChrolut EN (1.0 cm long). The SPE column was conditioned with 0.5 mL of
ACN and then 1 mL of water. The columns prepared sequentially exhibited
analytical signals with similar analyte–to–IS area ratios that confirm their high
reproducibility.
130
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
2.3. Continuous–flow solid–phase extraction (SPE) method
A block diagram of the SPE system employed for the continuous
derivatization and preconcentration of aldehydes in water is depicted in Figure 1.
Initially, the SPE sorbent column (LiChrolut EN, 25 mg and 1.0 cm long) was
impregnated with 2.0 mL of a 2.5 mmol L–1 DNPH solution (1.0 mg of DNPH) at
1.0 mL min–1. Then, sample volumes up to 50 mL or standard solutions in a 2.0
mmol L–1 β-CD and 1.25 mol L–1 hydrochloric acid medium containing between 10
and 1500 ng of aldehydes and 7.5 µg of the IS were aspirated at 1.0 mL min –1
through the sorbent column. All aldehydes were derivatized and the sample matrix
was sent to waste. Simultaneously, the loop of the second valve (IV 2) was filled with
the eluent (ACN) by means of a syringe. Next, IV2 was switched to pass the loop
content (100 µL) through the column, carried by an air stream at 0.25 mL min –1 and
in the opposite direction of the sample, in order to elute DNPH derivatives. The
organic extract was collected in an Eppendorf vial and aliquots of 20 mL were
injected into the LC for analysis. Under these conditions, the sorbent column was
serviceable for about 6 months.
Eluent
Air
IV2
Peristaltic
pump
DNPH
Sample
IV1
LC-DAD
SPE column
Figure 1 Schematic diagram of the continuous–flow SPE system for the determination of
aliphatic and aromatic LMMAs in water samples. IV, injection valve.
131
Capítulo 3
2.4. Sampling procedure
Water samples were collected from various swimming pools in 1–L opaque
PTFE bottles. Ascorbic acid (20 mg) was added as a preservative, and then samples
were stored at 4 °C until analysis (within 2 weeks of collection). Before the analysis,
50 mL of water samples (if required) were filtered through a 0.45–mm membrane
filter (mixed cellulose esters, Millipore) and mixed with 6.0 mL of concentrated
hydrochloric acid for adjusting acidity.
3. Results and discussion
3.1. Method development
The first question addressed was whether the derivatization reagent should
be loaded to the continuous–flow SPE system before or after aldehyde
preconcentration. In fact, aromatic LMMAs have less polarity and volatility than
aliphatic ones due to the presence of the aromatic benzene ring in their chemical
structure, and therefore they could first be retained on the SPE LiChrolut EN
column (preconcentration step) and then derivatized by passing the DNPH
solution. This strategy is not feasible for aliphatic LMMAs because it provides lower
and irreproducible retention factors for aldehydes. In consequence, two
methodologies have been assayed for the derivatization and preconcentration of the
aromatic LMMAs: (i) the approach already reported for aliphatic LMMAs (Method
A) in which the SPE column is first impregnated with DNPH [22] and (ii) the
alternative configuration (Method B) that involves initial aldehyde preconcentration
on the SPE column.
132
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
The acidity of the aqueous sample, the amount of DNPH and the flow rates
of the sample and DNPH solutions were studied using both methods to compare
their performance. From the results obtained, the following conclusions can be
drawn: (i) all aromatic LMMAs behaved similarly in Method A: the analytical signal
showed a maximum response at about 1.25 mol L–1 hydrochloric acid over the
range studied (Figure 2A shows the dependencies found for three representative
aldehydes: BA, 2,5-DHBA and 2-EBA), whereas the analytical signal was practically
independent of the sample solution acidity in Method B. This difference can be
ascribed to the fact that in Method A, the optimum acidity for the derivatization of
aldehydes is closely related to that of the sample solution because DNPH was
previously loaded on the SPE column. In Method B, however, it directly depends
on that of the DNPH solution (which was prepared in a hydrochloric acid medium)
because the previous sorption of aromatic LMMAs on the SPE column is similar
for all of them since no change in their acid–base properties occurred in the acidity
range assayed. Using Method A and in comparison to aliphatic LMMAs, they
require less acidity for DNPH derivatization (pH = 1.5) [22], which can be ascribed
to different charge distributions in the carbonyl group [27]. In fact, the C=O bond
in aromatic LMMAs has a higher dipole moment and, as a result, higher acidity is
required for the protonation of carbonyl oxygen prior to the nucleophilic attack of
the amine group of DNPH to form the corresponding hydrazone. (ii) The optimum
amount of DNPH was similar in the two methods and ensured a great excess of
DNPH; the selected value provides very high DNPH–to–aldehydes molar ratios,
concretely about 15000 for the lower concentrations of aromatic LMMAs in the
linear ranges shown in Table 1. (iii) As expected and for kinetic reasons, the
optimum flow rate for the DNPH solution in Method B was lower than in Method
A, and (iv) Method A provided better analytical sensitivity than Method B; a 30–
35% increase was observed in the analytical signal. This behavior could be explained
by the previous retention of aromatic LMMAs on the SPE column in Method B
133
Capítulo 3
that could hinder the efficiency of the derivatization process. According to these
results, it can be concluded that Method A is the best choice for in situ
derivatization and the preconcentration of aromatic LMMAs, and for this reason it
was selected for further experiments. As a result and using Method A, other SPE
variables studied were the organic solvent used as eluent, and its volume, the flow
rate of the air stream used as carrier for the eluent, and the amount of LiChrolut
EN sorbent for which the following conditions were selected: eluent, 100 µL of
ACN flowing at 0.5 mL min–1 by using an air stream; and sorbent material, 25 mg.
Previously, we reported for the first time the enhanced effect of SDS
micelles on the derivatization efficiency of aromatic LMMAs (BA, 3-MBA and 2,5DMBA) [28]. Obviously, similar results were found in this work for alkyl derivatives
of BA in the presence of this micellar medium; however, derivatization efficiency
for hydroxyl derivatives decreases, about 65%, in the presence of these micelles (see
Figure 2B). This behavior can be ascribed to the possible strong interactions
between the protonated hydroxyl groups of 2,5-DHBA and 3-HBA (the sample was
prepared in 1.25 mol L–1 hydrochloric acid) and the negative charge of the SDS
micelles, which hindered the derivatization reaction. As an alternative to SDS, bile
salts, CDs and mixed micelles were assayed, although the higher acidity of the water
sample resulted in precipitation of many of these micellar mediums even at
concentrations below their CMC. From this study, only the addition of β-CD as
additive to the water sample at low concentration (2.0 mmol L–1) was favorable
because it gives better results for BA and its alkyl derivatives than those provided by
SDS and, at the same time, the derivatization efficiency for hydroxyl derivatives also
increased, about 10% (see Figure 2B). In view of these results, a β-CD
concentration of 2.0 mmol L–1 was selected for further experiments.
The breakthrough volume of the sample was the last variable evaluated in
the optimized system. This parameter is crucial in SPE methods because it is
134
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
directly related to the enrichment factor, and therefore to the sensitivity of the
method. This study was carried out by adding 150 ng of each aldehyde to different
volumes of purified water (from 10 to 75 mL) in 1.25 mol L–1 hydrochloric acid.
Negligible changes in chromatographic signals were obtained with aqueous volumes
of up to 50 mL. This value provides preconcentration factors for aldehydes as high
as 500, allowing their detection in water samples at ng L–1 levels with simple and
inexpensive equipment.
Chromatographic conditions were optimized taking into account the
possible coexistence of some aliphatic LMMAs in the swimming pool water
samples analyzed that may interfere with the separation of aromatic ones. Based on
the experimental results, a 5–µm analytical reversed–phase C18 column (250 × 4.6
mm) with a linear gradient mobile phase from 60 to 80% in ACN at a flow rate of
1.2 mL min–1 was used to separate the DNPH derivatives of the aromatic LMMAs
studied in this work in the presence of the most common already detected aliphatic
ones (C1 to C5) in this type of water samples. As can be seen in Figure 3A, the
subsequent elution order for DNPH derivatives was consistent with the polar
character of the corresponding aldehyde. Finally, the same IS (2-methyl-1nitronaphthalene) used in a previous work [28] was selected because, as stated in
Figure 3, its chromatographic peak did not overlap any of the analytes in optimized
chromatographic conditions.
135
Capítulo 3
Figure 2
136
Effect of (A) acidity of the water sample and (B) type of surfactant on the
derivatization and preconcentration of aromatic LMMAs. Aldehyde
concentration, 20 µg L–1. Sample volume, 25 mL. Other conditions are the
same as described in Section 2.
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
3.2. Analytical performance characteristics
Analytical performance parameters such as linear range, LOD and precision
were evaluated after the optimum conditions were established. The linearity of the
method was obtained by plotting the calibration graphs of the corresponding peak
areas (normalized by that of the IS) versus the concentration of each aldehyde by
using 50 mL of water sample. Table 1 gives the calibration curve parameters
obtained and other analytical figures of merit. The results indicate that a high degree
of linearity between the two variables was attainable over the concentration range
studied. The LODs were calculated as the concentration of the analyte at which the
signal–to–noise ratio was equal to 3, and the precision expressed as RSD was
obtained by analyzing six samples per run of 50 mL of uncontaminated drinking
water spiked with each aldehyde at concentrations between 5.0 and 15 µg L–1
according to their respective sensitivity, on three consecutive days (inter–day
precision, n = 18). As can be seen, the method allows the determination of these
carbonyl compounds at very low levels in water samples (LODs ranged from 60 to
150 ng L–1), all with good precision, viz. RSDs within 1.5% for migration time and
those for peak area from 3.6 to 7.6% for aromatic LMMAs. Finally, it is noteworthy
to state that the proposed method is a useful choice to determine LMMAs in water
samples using simple and inexpensive instrumentation, with lower LODs than the
existing LC alternatives. To our knowledge, only the determination of aliphatic
LMMAs in water samples with LODs at ng L–1 levels has been reported although
using MS/MS as the detection system [19, 22]; no data have been found on the
analysis of aromatic LMMAs in this type of samples.
137
Capítulo 3
Figure 3 Representative chromatograms for (A) DNPH derivatives in optimized conditions (aldehydes at a concentration of 20 µg
L–1) and (B) aldehydes found in swimming pool water sample 3 (see Table 2). Peak assignment: 1, 2,5-DHBA; 2, C1; 3, 3HBA; 4, C2; 5, C3; 6, C4; 7, BA; 8, C5; 9, 3-MBA; 10, 2-EBA; and 11, 2,5-DMBA. For experimental conditions, see
Section 2.
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
Table 1 Performance characteristics of the method developed for the determination of aliphatic
and aromatic LMMAs in water samples.
Aldehyde
Calibration equationa
Regression
coefficient
Linear rangeb
(µg L–1)
LOD
RSD
–1
(ng L ) (%)
BA
S = (0.283 ± 0.005) C + (0.3 ± 0.1)
0.9995
0.2 – 100
60
3.6
2,5-DHBA
S = (0.256 ± 0.007) C + (0.5 ± 0.2)
0.9989
0.2 – 100
60
5.7
3-HBA
S = (0.197 ± 0.005) C + (0.8 ± 0.3)
0.9998
0.4 – 150
120
5.0
3-MBA
S = (0.268 ± 0.008) C – (0.7 ± 0.3)
0.9991
0.2 – 100
60
7.2
2,5-DMBA
S = (0.226 ± 0.005) C + (0.6 ± 0.2)
0.9998
0.3 – 150
100
7.5
2-EBA
S = (0.158 ± 0.004) C + (1.2 ± 0.5)
0.9996
0.4 – 150
120
7.6
C1
S = (0.196 ± 0.018) C + (3.3 ± 2.6)
0.9895
0.3 – 150
100
13.6
C2
S = (0.309 ± 0.008) C + (0.3 ± 0.1)
0.9998
0.2 – 100
60
10.4
C3
S = (0.238 ± 0.006) C  (0.3 ± 0.1)
0.9998
0.3 – 150
100
11.2
C4
S = (0.139 ± 0.008) C + (1.4 ± 0.8)
0.9984
0.5 – 150
150
11.6
C5
S = (0.131 ± 0.009) C + (2.1 ± 1.3)
0.9920
0.5 – 150
150
11.8
a
S, analyte to the IS peak area; C, analyte concentration (µg L–1).
volume, 50 mL.
b Sample
3.3. Analysis of swimming pool water samples
The proposed method has been applied to the analysis of 11 aldehydes in
chlorinated indoor swimming pool water samples. Volumes of 50 mL of water were
analyzed under conditions described in Section 2. The results are given in Table 2,
and Figure 3B shows the chromatogram obtained in the analysis of one of the
samples. As shown in this table, apart from the aliphatic LMMAs most frequently
found in this type of water, such as C1, C2 and C4 [19, 22], the presence of two
aromatic ones has also been observed: 2,5-DMBA, which was detected in only one
swimming pool water and at a very low level–below µg L–1; and BA detected in all
analyzed samples but at concentrations lower than those found for aliphatic
139
Capítulo 3
LMMAs. To assess possible matrix effects, a recovery study of the method was
carried out. Each water sample was fortified with two different concentrations,
according to the sensitivity (between 15 and 50 µg L–1) of each aldehyde, and
recoveries were calculated by comparing the peak area increments observed
between the analysis of a spiked water sample and a non–spiked one. From the
results shown in Table 2, it can be concluded that no matrix effect was observed in
the determination of these aldehydes in the swimming pool water samples analyzed;
the percentages of recovery ranged between 94.7 and 102.3%.
Table 2 Content and recoveries of aldehydes in indoor swimming–pool water samples as
determined by the proposed DNPH/LC–DAD method (n = 3).
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Aldehyde
Content ±
SD (µg L–1)
Recovery
(%)
Content ± Recovery
SD (µg L–1) (%)
Content ±
SD (µg L–1)
Recovery
(%)
BA
2.1 ± 0.1
98.8
15.3 ± 0.7
99.6
6.1 ± 0.3
100.1
2,5-DHBA
N. D.
97.3
N. D.
95.6
N. D.
98.2
3-HBA
N. D.
95.6
N. D.
96.8
N. D.
94.7
3-MBA
N. D.
101.9
N. D.
99.7
N. D.
101.3
2,5-DMBA
N. D.
100.9
N. D.
102.3
0.8 ± 0.1
100.1
2-EBA
N. D.
98.2
N. D.
97.9
N. D.
96.3
C1
8.4 ± 1.2
98.7
58.2 ± 7.8
97.6
21.0 ± 3.1
98.1
C2
60.2 ± 6.5
98.3
116 ± 13
95.5
46.7 ± 4.8
97.8
C3
N. D.
100.4
N. D.
98.6
N. D.
101.3
C4
6.7 ± 0.8
96.4
13.2 ± 1.5
95.3
41.3 ± 5.1
95.5
C5
N. D.
102.1
N. D.
96.8
1.6 ± 0.2
99.1
N. D., No detection
140
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
4. Concluding remarks
The analytical methodology proposed here allows the detection and
quantification of aromatic and aliphatic LMMAs as DBPs in swimming pool water
samples by LC with DAD detector. The continuous–flow SPE configuration
developed for the in situ derivatization/preconcentration of the aldehydes in the
presence of β-CD means that manual sample manipulation is minimal; this has a
positive effect on precision and affords significant sensitivity. Thus, the proposed
SPE–LC–DAD method is a good alternative to the EPA Method 8315A [26] based
also on DNPH derivatization and LC–DAD since it provides LODs of at least one
order of magnitude lower and with simpler sample handling. This method was also
successfully used for the systematic determination of aromatic LMMAs as DBPs in
swimming pool water samples for the first time. Undoubtedly, the sample
preparation procedure in this paper is likely to facilitate the development and
validation of other methods to analyze these aldehydes in other matrixes such as
biological and food samples.
The authors gratefully acknowledge the subsidy provided by the Spanish
Inter–ministerial Commission of Science and Technology of the Ministry of
Education and Science under the CTQ2010–17008 and by the Junta de Andalucía
under PO7–FWM–02493. FEDER also provided additional funding. J. M.
Fernández–Molina acknowledges the Junta de Andalucía for awarding him a
predoctoral grant.
The authors have declared no conflict of interest.
141
Capítulo 3
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142
Mejoras en la eficiencia de la derivatización de aldehídos
aromáticos. Determinación mediante LC–DAD
12. S. D. Richardson, A. D. Thruston, Jr., T. V. Caughran, P. H. Chen, T. W.
Collette, K. M. Schenck, B. W. Lykins, Jr., C. Rav–Acha, V. Glezer, Water,
Air, & Soil Pollution 123 (2000) 95.
13. R. J. Miltner, T. F. Speth, S. D. Richardson, S. W. Krasner, H. S. Weinberg,
J. E. Simmons, Journal of Toxicology and Environmental Health A 71
(2008) 1133.
14. S. D. Richardson, A. D. Thruston, Jr., S. W. Krasner, H. S. Weinberg, R. J.
Miltner, K. M. Schenck, M. G. Narotsky, A. B. McKague, J. E. Simmons,
Journal of Toxicology and Environmental Health A 71 (2008) 1165.
15. C. Zwiener, S. D. Richardson, Trends in Analytical Chemistry 24 (2005)
613.
16. B. Cancho, F. Ventura, M. T. Galceran, Journal of Chromatography A 943
(2002) 1.
17. T. Gabrio, A. Bertsch, Journal of Chromatography A 1046 (2004) 293.
18. C. Deng, N. Yao, N Li, X. Zhang, Journal of Separation Science 28 (2005)
2301.
19. C. Zwiener, F. H. Frimmel, Analytical and Bioanalytical Chemistry 372
(2002) 615.
20. K. Takeda, S. Katoh, N. Nakatani, H. Sakugawa, Analytical Sciences 22
(2006) 1509.
21. C. E. Baños, M. Silva, Talanta 77 (2009) 1597.
22. C. E. Baños, M. Silva, Journal of. Chromatography A 1216 (2009) 6554.
23. W. J. Huang, G. C. Fang, C. C. Wang, Science of the Total Environment
345 (2005) 261.
24. W. J. Huang, L. Y. Chen, H. S. Peng, Environment International 29 (2004)
1049.
143
Capítulo 3
25. J. Dabrowska, J. Swietlik, J. Nawrocki, Water Research 37 (2003) 1161.
26. U.S. EPA. Method 8315A. Cincinnati, OH 1996.
27. J. Z. Dongg, S. C. Moldoveanu, Journal of Chromatography A 1027 (2004)
25.
28. J. M. Fernández–Molina, M., Silva, Talanta 85 (2011) 449.
144
Capítulo 4
Innovaciones en la determinación de
aldehídos aromáticos en agua y
matrices biológicas mediante LC–MS
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
En los trabajos recogidos en el presente capítulo se aborda la determinación
de aldehídos aromáticos mediante cromatografía de líquidos con detección por
espectrometría de masas (LC–MS), lo que ya de por sí supone una importante y
valiosa aportación con relación a las metodologías desarrolladas en el capítulo
anterior. La espectrometría de masas proporciona información estructural de la
molécula, aspecto que resulta de gran utilidad en el análisis de muestras complejas.
A pesar de estas ventajas, dadas las características mencionadas previamente, la
derivatización de los aldehídos sigue siendo necesaria, por lo que en las dos
publicaciones que se incluyen en este capítulo se ha empleado el sistema de µ–SPE
detallado anteriormente para realizar la preconcentración/derivatización in situ de la
muestra, aunque con importantes innovaciones. Los aspectos más destacados de la
investigación desarrollada son:
– Evaluación de las prestaciones analíticas de varios sorbentes de distinta
naturaleza del sistema de µ–SPE, entre ellos C18, LiChrolut EN, TelosTM
ENV y la resina de intercambio catiónico Dowex 50WX8. La mayoría de
ellos tienen en común su estructura copolimérica y una elevada superficie
específica. Concretamente se ha abordado el estudio de la eficiencia en el
proceso de adsorción del reactivo DNPH, de la derivatización/retención de
los aldehídos aromáticos y de la elución de las hidrazonas formadas.
– Análisis de muestras de agua sometidas a tratamientos con ozono (agua
embotellada ozonizada) y con cloro (agua de piscina) teniendo también en
cuenta, como se ha considerado en el capítulo anterior, la previsible
presencia de aldehídos alifáticos en las mismas.
147
Capítulo 4
– Análisis de muestras biológicas (orina) de personal expuesto a estos compuestos
en el laboratorio. Esta aplicación presenta un gran interés en el ámbito del
diagnóstico clínico ya que los aldehídos de bajo peso molecular pueden actuar
como biomarcadores de distintas enfermedades. Mediante el estudio de la
ingestión fundamentalmente por inhalación y su excreción en la orina se
pretende obtener información sobre la vida media de estos aldehídos de bajo
peso molecular en el cuerpo de investigadores expuestos.
.
148
Journal of Chromatography A
Trace determination of low–molecular–mass substituted
benzaldehydes in treated water using
micro solid–phase extraction followed by
liquid chromatography–mass spectrometric detection
José María Fernández–Molina and Manuel Silva
Department of Analytical Chemistry, Rabanales Campus, University of Cordoba
Received 26 February 2012; received in revised form 19 March 2013; accepted 21 April 2013
Abstract
Aldehydes are a class of water disinfection by–products (DBPs) that are an
object of special attention due to their high toxicity and carcinogenic effect. While
aliphatic low–molecular–mass aldehydes (LMMAs) are often measured in waters,
there is little information on the occurrence of aromatic LMMAs. This paper reports
the development of a simple, rapid and sensitive method for the quantitative
determination of six LMM substituted benzaldehydes (BAs) as DBPs in treated
water. The method is based on the continuous in situ derivatization/extraction of
aldehydes on a TelosTM ENV µ–solid–phase extraction (µ–SPE) column
impregnated with 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH). After elution of the
hydrazones with acetonitrile (ACN), the derivatives are analysed using liquid
chromatography–mass spectrometry (LC–MS). Under optimum conditions, limits
of detection (LODs) were obtained between 15 and 25 ng L–1 and the inter–day
precision expressed as the relative standard deviation (RSD) ranged from 6.1% to
7.7%. Matrix effects were shown to be negligible by comparing the response factors
(RFs) obtained in ultra–pure and treated waters. The proposed method is the first
contribution developed for the analysis of LMM substituted BAs as DBPs in waters
by LC–MS. Some of the aromatic LMMAs identified had not previously been
reported for swimming pool water.
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
1. Introduction
The disinfection of drinking water has led to major improvements in public
health in developed countries since it was introduced in the first half of the
twentieth century. The highly reactive nature of oxidants (chlorine, chlorine dioxide,
chloramines, ozone or their mixtures) used as disinfectants for microbial
inactivation also forms a number of DBPs through reactions with naturally
occurring organic and inorganic substances in the source water. Since the discovery
of DBPs formation in the mid–1970s, toxicological and epidemiological studies
have indicated the possible health issues posed by these harmful compounds, and
hence the potential public health problem caused by water disinfection is a great
concern worldwide [1–11].
Non–halogenated aldehydes are a class of organic chemicals known to be
primarily formed as DBPs of drinking water ozonation [8], although both chlorine
and chlorine dioxide treatment can also originate these carbonyl compounds [9-15].
Seven major aliphatic LMMAs, including formaldehyde to valeraldehyde and the
dialdehydes glyoxal and methyl glyoxal have been detected and determined in
treated water. However, the occurrence and analysis of aromatic LMMAs in water
have scarcely been reported so far. Thus, BA has been identified in drinking water
after
ozone,
chlorine
or
chlorine
dioxide
disinfection
[10,14,16];
2,5-
dihydroxybenzaldehyde (2,5-DHBA) [11] and 2-ethylbenzaldehyde (2-EBA) [10]
after
ozone
and
chlorine
dioxide
treatment,
respectively;
and
3-
hydroxybenzaldehyde (3-HBA) [17], BA and 2,5-dimethylbenzaldehyde (2,5DMBA) [18,19] in swimming pools after chlorination.
Methods for directly determining aldehydes in water require a derivatization
step before extraction and analysis by gas chromatography (GC) or LC due to the
high polarity and chemical instability of these compounds. Two well–known
151
Capítulo 4
derivatization reagents, recommended in the U.S. Environmental Protection Agency
(EPA) Methods 556.1 [20] and 8315A [21], can be used according to the
chromatographic technique involved in the separation of derivatives: o-2,3,4,5,6pentafluorobenzylhydroxylamine (PFBHA), which yields non–polar oximes that can
be easily extracted into an organic solvent and analysed by GC [20,22–26], and
DNPH, which provides hydrazones which are LC–amenable [11,17–19,21,27–33].
EPA methods [20,21] involve an extensive work–up, consume materials, and
solvents for the derivatization and the isolation of the derivatives (liquid–liquid
extraction [20] and SPE cartridges [21]) because they are formed by batch
derivatization. LC coupled with DNPH derivatization is increasingly being viewed
as a useful alternative to GC–PFBHA methods because it permits the analysis of
highly polar compounds. These methods were essentially focused on the
determination of aliphatic aldehydes [27–29,32,33] and only the analysis of BA in
the presence of aliphatic LMMAs in spiked water has been the subject of two
sporadic works [30,31]. Recently, we have reported two contributions with respect
to the determination of LMM substituted BAs in water, namely the analysis of BA
and methyl derivatives in tap, stream and swimming pool waters [18], and the
determination of six LMM substituted BAs in indoor swimming pool waters after
chlorination [19].
Regarding sample preparation methods involved in the analysis of LMMAs
in water by LC, a minor number of studies have dealt with the use of
microextraction techniques [27,30,31] as an alternative to the classical SPE
approach [17,21]. This trend can be ascribed to the incompatibility of extracting
solvents with LC mobile phases, which requires an extra step of solvent exchange
and reconstitution of extracts. Head–space single drop [31], salt–assisted liquid–
liquid microextraction with water–miscible organic solvents [30] and µ–SPE [27]
have been used for the determination of carbonyl compounds in spiked water and
152
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
aliphatic LMMAs in rainwater after derivatization with DNPH and analysis by LC
with UV detection.
The aim of this work was the development of a sensitive analytical method
for the quantification of six LMM substituted BAs in treated water, especially in
swimming pools. In previous papers [18,19,28,29] a novel DNPH derivatization
procedure using a µ–SPE unit was successfully developed for the analysis of
aldehydes in water. When compared with classical SPE, this µ–SPE approach
reduces the consumption of time, materials and solvents for the derivatization and
isolation of the hydrazones as well as increases the sensitivity because higher pre–
concentration factors can be achieved. The present work describes the development
of a TelosTM ENV µ–SPE unit for the continuous in situ derivatization/extraction
of LMM substituted BAs from treated water, followed by LC–MS. It is noteworthy
that the proposed method is the first report on the determination of aromatic
LMMAs in waters by LC–MS using DNPH as the derivatising reagent.
2. Materials and methods
2.1. Standards and solutions
All the chemicals and solvents used were of analytical grade. BA (≥99.0%),
3-methylbenzaldehyde (3-MBA, ≥97.0%), 2-EBA (≥88.0%), 2,5-DMBA (≥99.0%),
3-HBA (≥97.0%) and 2,5-DHBA (98.0%) were supplied by Aldrich (Sigma–Aldrich
Química, Madrid, Spain). Acetaldehyde (C2, ≥99.5%) was supplied by Sigma
(Sigma–Aldrich Química) whereas propionaldehyde (C3, ≥96.0%), butyraldehyde
(C4, ≥99.0%) and valeraldehyde (C5, ≥97.0%) were acquired from Fluka (Sigma–
Aldrich Química). Each aldehyde stock solution (4.0 mg mL–1) was prepared in
153
Capítulo 4
methanol (Romil Chemicals, Cambridge, UK) and stored at 4 °C. Standard mixtures
of the analytes were prepared daily by appropriate dilution of stock solutions in LC–
MS ultra–grade water (Chromasolv, Fluka). DNPH was of analytical reagent grade
(≥99%) and purchased from Fluka. A 60 mM stock solution was prepared by
dissolving 594.4 mg of the chemical in 50 mL of a solution containing 12 M
hydrochloric acid, ultra–pure water and acetonitrile (2:5:1, v/v/v) and then stored in
a freezer. Successive diluted solutions were prepared in LC–MS ultra–grade water.
RP–C18, a silica sorbent with octadecyl functional groups (particle size 50 µm,
surface area 600 m2 g–1), was acquired in Sigma; Dowex 50WX8 hydrogen form, a
strongly cation exchange polymeric resin (particle size 20–50 mesh, capacity 1.1
meq mL–1 by wetted bed volume), was supplied by Fluka; LiChrolut EN (particle
size 40–120 µm, surface area ~1200 m2 g–1) was provided by Merck (Darmstadt,
Germany); while TelosTM ENV (mean particle size 80 µm, surface area ~ 900 m2 g–1)
was kindly supplied by Kinesis Inc. (Vidrafoc S.A. Madrid, Spain).
2.2. Derivatization and preconcentration of aldehydes with the μ–SPE system
A scheme of the µ–SPE system used for derivatization/extraction of
LMMAs is depicted in Figure 1. It consisted of a Minipuls–3 peristaltic pump from
Gilson (Middleton, WI, USA) fitted with poly(vinylchloride) tubes and two model
5041 injection valves (IV) from Rheodyne (Cotati, CA, USA). The µ–SPE columns
were made from PTFE capillaries of 3 mm I. D. and 1 cm long and packed with 25
mg of different sorbent materials. The µ–columns were sealed at both ends with
small plugs of glass wool to prevent material losses and their ends were capped by
fitting 30 mm × 0.5 mm I.D. PTFE tubing into a 10 mm × 1 mm I.D. PTFE tube
to facilitate its insertion into the flow system. The µ–columns were conditioned
with different solutions according to the sorbent used: 1 mL of methanol and 1 mL
154
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
of ultra–pure water for RP–C18, 1 mL of 1.0 mol L–1 hydrochloric acid and 5 mL of
ultra–pure water for Dowex 50WX8, 0.5 mL of ACN and 1 mL of ultra–pure water
for LiChrolut EN and 1 mL of ACN and 2 mL of ultra–pure water for TelosTM
ENV. All solutions were delivered at a flow rate of 0.5 mL min–1.
W
(A)
ACN
IV2
P
ACN
W
DNPH
1.0 mL/min
IV1
Sample
2.5 mL/min
100 L
25 mg
TelosTM ENV
SV
(B)
Air
0.5 mL/min
IV2
100 L
IV1
DNPH
derivatives
ACN
P
8 L
LC–MS
Figure 1
Continuous–flow µ–SPE system developed for the derivatization/extraction of
LMMAs in treated water samples. (A) Loading DNPH and ACN.
Derivatization/extraction of aldehydes, and (B) elution of hydrazones. P,
peristaltic pump; SV, selecting valve; W, waste.
155
Capítulo 4
After conditioning, the µ–SPE column (TelosTM ENV, 25 mg, 1 cm long)
was impregnated with 2.0 mL of a 2.5 mM DNPH solution (1.0 mg of DNPH) at
1.0 mL min–1. Then volumes up to 100 mL of treated water or standard solution in
2.0 mol L–1 hydrochloric acid containing between 5 and 250 ng of aldehydes were
aspirated at 2.5 mL min–1 through the µ–SPE column. The aldehydes were in situ
derivatized with DNPH on the TelosTM ENV µ–column, located in the loop of IV1,
the sample matrix being sent to waste. Simultaneously, the loop of IV2 was filled by
hand with the eluent (ACN) by means of a syringe. Prior to elution, by switching
IV1, any residual aqueous solution remaining inside the µ–column and the
connectors was flushed by passing an air stream at 0.5 mL min–1 for 2 min. Next,
IV2 was switched to pass the loop content (100 µL of ACN) through the µ–column,
carried by an air stream at 0.5 mL min–1 and in the opposite direction of the sample,
in order to elute hydrazones. The µ–SPE column was tested for carry over effect and
no contamination was observed. The organic extract was collected in an Eppendorf
vial and, if required, it can be stored at −20 °C up to 30 days to avoid storage losses.
Aliquots of 8 µL were injected into the LC–MS for analysis. Under these conditions,
the number of samples that can be analysed with the same µ–SPE column was
estimated to be around 500 samples.
2.3. Sampling procedure
Water samples were collected in amber glass bottles (250 mL) with PTFE
screw caps. Copper sulphate pentahydrate (125 mg) was added to each bottle to
avoid microbiological decay. Ammonium sulphate (125 mg) was used to absorb
active chlorine in treated waters. Samples were stored at 4 °C and analysed within 7
days. Before analysis, 100 mL of water samples were mixed with 20.0 mL of 12 mol
L–1 hydrochloric acid to adjust acidity.
156
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
2.4. LC–MS analysis
The LC–MS instrument was a Varian (Walnut Creek, CA, USA) equipped
with two isocratic, high–pressure mixing pumps (Varian ProStar 210), an
autosampler, a thermostated compartment for the column (Varian ProStar 410) and
a triple quadrupole mass spectrometer (Varian MS 1200L) furnished with an
electrospray ionisation (ESI) interface. The LC–MS instrument was entirely
controlled by the Varian MS Workstation Version 6.3 software. Analytes were
separated using an Ascentis® Express C18 column (150 mm × 2.1 mm; 2.7 µm)
acquired from Sigma. A 0.1% formic acid (A) and ACN:methanol (75:25, v/v) (B)
solutions were employed as the mobile phase. Compounds were separated using the
following gradient: an initial concentration of 10% solvent B was held for 1 min,
and then it was raised linearly (10 min) to 100% solvent B and immediately
afterwards, held constant for 4 min. The mobile phase flow was set at 0.2 mL min–1
and the temperature of the column fixed at 40 °C. The injection volume for
standards and sample extracts was 8 µL. The ionisation conditions were adjusted as
follows: nitrogen was used as both the nebulising (50 psi) and drying (25 psi) gas;
collision–induced dissociation voltage, 45 V; capillary temperature, 300 °C; and
capillary voltage, 5500 V. The LC–MS was operated in the negative ionisation mode
with the data acquisition mode of SIM for quantification (scan time, 0.2 s). The
retention time windows and the selected m/z values, monitored by SIM mode, for
each aldehyde are shown in Table 1.
157
Capítulo 4
3. Results and discussion
3.1. Chromatographic and mass spectrometric optimisation
The LC–MS optimisation was carried out using standard mixtures of LMM
substituted BAs and aliphatic LMMAs. Aliphatic aldehydes were included taking
into account their possible coexistence in the treated water samples analysed that
may interfere with the separation of aromatic ones. Initially, the mass spectral
fragmentation pattern of each DNPH derivative was evaluated through LC–ESI–
MS operating in full scan acquisition mode. It is well known that the selected
reaction monitoring (SMR) mode is used by the majority of scientists performing
MS quantification; however, SRM mode requires pure standards for its
quantification.
Table 1 Retention time window and m/z values for aldehydes assayed.
Aldehyde
Retention time
window a, min
DNPH derivative
2,5-dihydroxybenzaldehyde
9.12 – 9.17
317
Acetaldehyde
9.65 – 9.72
223
3-hydroxybenzaldehyde
9.88 – 9. 99
301
Propionaldehyde
10.53 – 10.65
237
Butyraldehyde
11.33 – 11.42
251
Benzaldehyde
11.58 – 11.67
285
Valeraldehyde
12.09 – 12.16
265
3-methylbenzaldehyde
12.29 – 12.36
299
2-ethylbenzaldehyde
12.76 – 12.82
313
2,5-dimethylbenzaldehyde
12.94 – 13.03
313
a
158
Average of 10 injections ± 3 SD.
[M – H], m/z
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
This can be easily achieved for aliphatic LMMAs because their DNPH
derivatives in a pure form can be acquired commercially; however, a scarce number
of pure DNPH derivatives of LMM substituted BAs are available, and therefore
they must be prepared by using the method proposed in this work. In this case, the
ensuing standards contain a great excess of DNPH, which provokes important
problems in the ESI source and in the direct injection valve. As a result, the SIM
mode was selected. From the data obtained, retention time window and m/z values
for quantifier ions were chosen (see Table 1) to achieve high selectivity and
sensitivity to operate in SIM mode data acquisition. By monitoring the selected ions,
high response and symmetrical peak shape could be achieved in suitable analytical
time (<15 min), under selected chromatographic conditions. A 0.1% formic acid
concentration was used (see Section 2.4) because higher concentrations caused a
decrease in the sensitivity and precision of the signals, probably due to the
formation of adducts in the ionisation process.
3.2. Optimisation of the µ–SPE
In the last few years, some contributions have been made by our research
group to the analysis of LMMAs as DBPs in water by using a µ–SPE system for the
simultaneous derivatization and extraction of aldehydes with DNPH. These
contributions have significantly improved EPA Method 8315A [21] for the analysis
of these carbonyl compounds in water [18,19,28,29]. Regarding the µ–SPE process,
it has been shown that LMM substituted BAs could firstly be extracted on the
sorbent and then derivatized–unlike aliphatic ones–due to the presence of the
benzene aromatic ring in their chemical structure. However, this protocol provided
lower analytical signals (30–35%) when compared to the simultaneous
derivatization/extraction approach involving the initial loading of the DNPH on
159
Capítulo 4
the sorbent [19]. From these data, it is of interest to evaluate the features of
different sorbents for the µ–SPE of LMM substituted BAs with three aims on
mind: (i) to achieve the best possible retention for the DNPH; (ii) to use high
acidity values for the sample solution in order to favour the kinetics of the in situ
derivatization/extraction reaction; and (iii) to employ the least possible volume of
organic solvent for the desorption of the hydrazones.
The sorbents assayed in this study were the classical bonded hydrocarbon
phase RP–C18 (recommended for the SPE extraction of DNPH derivatives with
commercial cartridges by the EPA Method 8315A) and three styrene–
divinylbenzene (DVB) polymeric sorbents: (i) Dowex 50WX8, a fully sulphonated,
8% DVB crosslinked, cation exchange resin (proposed by Takami et al. [34] for the
in situ derivatization and extraction of formaldehyde, C2, C3 and BA with DNPH);
(ii) LiChrolut EN, a nanoporous, very highly crosslinked polymer, with both
aromatic and aliphatic moieties (used by us in previous works for the simultaneous
derivatization/extraction of LMMAs [19,28]); and (iii) TelosTM ENV, a DVB co–
polymer with a high surface area for reproducible retention of polar, water soluble
analytes from aqueous matrices due to its water–resistant character.
The retention capacity of the sorbents (25 mg) for DNPH was evaluated by
passing 2.0 mL of a 2.5 mmol L–1 DNPH solution (1.0 mg) at 1.0 mL min–1 through
the µ–SPE column. Diluted aliquots of the DNPH aqueous solutions obtained
before and after passing the derivatising reagent through the sorbent column were
analysed by LC–MS. The sorption efficiency of the sorbent material was assessed by
comparing the signals of both fractions. As it can be seen in Figure 2, DNPH was
practically quantitatively retained on TelosTM ENV and Lichrolut EN (>94%)
whereas for the other assayed sorbents the sorption was approximately 50%. This
behaviour can be ascribed to the ability of these polymeric sorbents to originate
specific interactions with polar solutes (the nitro and hydrazine groups in the
160
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
aromatic ring give DNPH a relatively polar character) in addition to the classical
retention process by hydrophobic mechanisms. Thus, electron–donor interactions
between the aromatic rings of the sorbent and π bonds of the DNPH as well as
hydrophilic interactions between the derivatising reagent and polar sites of the
sorbent “doped” with hydrophilic groups can be considered. The smaller value for
DNPH sorption when using the polymeric sorbent Dowex 50WX8 could be
ascribed to the low acidity of the DNPH solution (0.1 mol L–1 instead of 1.2 mol L–1
in hydrochloric acid as proposed by Takami et al. [34]) which decreases the possible
protonation of the hydrazine group.
To evaluate the efficiency of the derivatization/extraction process, 10 mL of
water samples at different pH values (0.5–2.5 mol L–1 in hydrochloric acid) and
spiked with aldehydes at 5 µg L–1 level were passed at 1 mL min–1 through the µ–
SPE column impregnated with 1 mg of DNPH; various organic solvents (methanol,
ACN, 2-propanol, ethanol and tetrahydrofurane) were tested for the desorption of
the hydrazones. For comparison, the maximum analytical signal (the sum of the
peak areas of each LMM substituted BAs) obtained from the organic extract given
by the most efficient sorbent at the optimum value of sample acidity, was taken as
100%, and the relative results for other sorbent materials are also shown in Figure
2. As it can be observed, LiChrolut EN and TelosTM ENV were the sorbents that
provided the most globally favourable analytical response; complete elution of
DNPH derivatives was achieved with 100 µL of ACN in both cases. The low
efficiency obtained for the Dowex 50WX8 cation exchange polymeric resin can be
ascribed to the possible underivatization of the aldehydes by steric hindrance. The
desorption process (e.g., 100 µL of ACN) provided a DNPH peak that practically
corresponds to the retained amount of DNPH and negligible peaks from some
DNPH derivatives. The even worse results supplied by RP–C18 (lower analytical
signals and high irreproducibility, RSD ranged from about 20–30%) could be due to
161
Capítulo 4
the instability of this sorbent at high values of acidity. According to the results
obtained with the four sorbents assayed (see Figure 2), it can be concluded that
TelosTM ENV and LiChrolut EN are the best materials for the continuous in situ
derivatization/extraction of LMM substituted BAs. However, TelosTM ENV
showed better features than LiChrolut EN because the derivatization/extraction of
aromatic LMMAs can be carried out at higher acidity values (2.0 mol L–1 HCl
medium). Because all aromatic aldehydes showed a similar dependence on the
efficiency of the derivatization/extraction process with the acidity of the sample for
each sorbent tested, Figure 3 shows the results of this study for BA (as a
representative example). The use of TelosTM ENV as sorbent material makes
possible to work at higher acidity for water samples, which improves the rate–
determining step of the derivatization reaction of the aldehydes (the protonation of
carbonyl oxygen prior to the nucleophilic attack of the amine group to form the
corresponding hydrazone [35]) and consequently, the analytical sensitivity. As a
result, µ–SPE columns were packed with TelosTM ENV for further studies.
Figure 2
162
Effect of sorbent materials on the efficiency of DNPH sorption (grey bar) and
the simultaneous derivatization/extraction of LMM substituted BAs (black
bar). Error bars are the standard deviations for three measurements.
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
Figure 3
Effect of acidity of the sample solution on the derivatization/extraction of 5 µg
L–1 of BA using different sorbent materials impregnated of DNPH. TelosTM
ENV (○), LiChrolut EN (●) and RP–C18 (□). Sample volume, 10 mL. Other
conditions as described in Section 2. Error bars are the standard deviations for
three measurements.
The breakthrough volume of the sample is another important feature for
selecting an appropriate sorbent since this parameter is closely related to the
enrichment factor, and hence to the sensitivity of the method. This study was
carried out by preparing 100 ng of each aromatic aldehyde in variable volumes of
ultra–pure water (from 10 to 125 mL) in 2.0 mol L–1 HCl. Sample volumes up to
100 mL can be used with negligible changes in LC–MS signals, and therefore it was
selected for further experiments, which provided an enrichment factor of 1000 for
LMM substituted BAs. The optimum values of other variables affecting the
derivatization/extraction process are listed in Table 2, which also includes those
corresponding to LiChrolut EN for comparison purposes. As it can be seen,
TelosTM ENV was a more powerful sorbent than LiChrolut EN because it
163
Capítulo 4
improved sample breakthrough volume (analytical sensitivity) and speed (higher
sample–flow rate) in the analysis of these aldehydes in water.
Table 2
Selected variable values for the extraction/derivatization of LMM
substituted BAs with DNPH by µ–SPE using Telos ENV and
LiChrolut EN as sorbent materials.
Conditions
Telos ENV
LiChrolut EN a
Sample medium, mol L–1 HCl
2.0
1.25
DNPH amount, mg
1.0
1.0
Sorbent amount, mg
25
25
Sample flow–rate, mL min–1
2.5
1.0
ACN volume, µL
100
100
Sample breakthrough volume, mL
100
50
a Results
obtained from [19].
3.3. Method performance
A series of sample analyses was performed under optimum conditions to
evaluate the performance of the method for the determination of LMM substituted
BAs in water in terms of linearity, LOD, limit of quantification (LOQ), precision
and accuracy. Method validation was also extended to aliphatic LMMAs, bearing in
mind the possible presence of these carbonyl compounds in the water samples that
will be analysed. Table 3 summarises analytical characteristics of aldehydes through
the use of the method proposed. Formaldehyde was not included because it cannot
be quantitatively determined due to the high uncertainty associated with the MS
signal of its DNPH derivative [17,28]; therefore, it can only be qualitatively detected
164
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
in water. The linearity of the method was estimated from calibration curves
prepared from aldehyde standards spiked in 100 mL of mineral water and by
plotting the peak area versus the concentration of the corresponding standard.
LODs and LOQs were estimated as the lowest concentration of the analyte in a
sample that provides a chromatographic signal 3 or 10 times higher, respectively,
than background noise [36]. The precision, expressed as RSD, was evaluated by
calculating intra– and inter–day precision of six analysis of different working
solutions of the aldehydes at the same concentration (100 mL of mineral water
spiked with 1.0 µg L–1 of each aldehyde) under the same experimental conditions on
three consecutive days (n = 3). As it can be inferred from data in Table 3, the
intra– and inter–day precision of the method has average values of 6.2 ± 0.6% and
7.0 ± 0.5%, respectively. The accuracy of the method (matrix effect) was evaluated
by using RFs defined as the ratio between the area counts produced by an aldehyde,
and the amount of aldehyde that produces the signal. For this purpose, matrix–
matched calibration plots for each aldehyde were prepared in 100 mL of indoor
swimming pool water and analysed by using the optimised µ–SPE/LC–MS method.
No significant differences at a confidence level of 95% were found (a paired t–test
was used) between the RFs of the matrix–matched calibration graph for each
aldehyde and those obtained in ultra–pure water (experimental t–values ranged
from 0.65 to 1.37, being the corresponding t critical value of 3.18), which suggests
that both calibrations were statistically similar and therefore no matrix effect was
observed in the determination of the LMMAs.
At this point, it may be interesting to compare the analytical features of the
proposed method with reported LC alternatives for the determination of LMM
substituted BAs in water samples. The following comments can be inferred: (i) the
proposed µ–SPE system surpasses reported microextraction alternatives for the
determination of carbonyl compounds in water samples (also based on the DNPH–
LC system) such as µ–SPE using a polypropylene membrane to envelope the
165
Capítulo 4
sorbent [27], salt–assisted liquid–liquid microextraction [30] and headspace in–drop
derivatization [31] in terms of LOQs, operational simplicity and robustness.
Because of the high enrichment factor achieved by the proposed method,
the LOQs obtained for LMMAs were one– [27] or about three–orders [30,31] of
magnitude lower than those achieved by these alternatives; (ii) the LC–MS method
proposed for the determination of LMM substituted BAs provides LOQs about
one order of magnitude lower than the LC–DAD methods we reported previously
[18,19]. These better results can be ascribed to both the higher enrichment factor
provided by the TelosTM ENV material as compared to LiChrolut EN and the
detection system used; and (iii) the proposed µ–SPE/LC–MS method is a good
alternative to EPA Method 8315A [21] based also on DNPH derivatization but
using LC with UV detection since it provides LOQs that are at least two orders of
magnitude lower and does not consume many organic solvents, has better
operational simplicity and shows higher enrichment factors.
3.4. Analysis of real water samples
In recent years, methods for the determination of aliphatic LMMAs as
DBPs in water have grown significantly due to the widespread presence of these
water–soluble carbonyl compounds in treated water samples. Despite the potential
health issues of LMMAs, there is no regulatory limit for these compounds in these
types of water samples, and scarce information has been reported on the occurrence
of aromatic LMMAs in treated water. The World Health Organisation suggests a 10
µg L–1 guideline value for chloral hydrate [37]. In order to improve the knowledge
on the occurrence of LMMAs in this type of samples, water samples subjected to
oxidative treatment with ozone (ozonated drinking water) or by chlorination
(swimming pool) were analysed by using the µ–SPE/LC–MS method proposed. If
166
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
the concentration of an analyte lay out–side the linear range, then the sample
concerned was diluted with LC–MS ultra–grade water to bring it inside. Analyses
were performed in triplicate and results of the target compounds found in water,
including aliphatic LMMAs, are shown in Table 4.
As expected, aliphatic LMMAs were the compounds present to the greatest
extent in all water analysed, at concentrations from 0.65 to 12.4 µg L–1. These results
are consistent with those reported previously by us as well as by other authors [17–
19,27–30,32]. With respect to LMM substituted BAs, BA was found in all samples
analysed at concentrations from 0.76 to 4.7 µg L–1, whereas the other aromatic
aldehydes, except 2,5-DHBA, were only detected in swimming pool waters. From
these results it can be inferred the higher ability of the chlorination process for
generating LMM substituted BAs as DBPs with respect to the treatment with
ozone.
The higher aromatic LMMA concentrations found in this type of treated
water, especially in indoor swimming pools, can be ascribed to the presence of large
amounts of disinfectants and organic matter from organic fluids from swimmers,
among other sources. Worth special note in this respect is that some of the
identified LMM substituted BAs, such as 3-MBA and 2-EBA, had not previously
been determined in swimming pool water. To our knowledge, very little information
has currently been reported on the occurrence of aromatic LMMAs in swimming
pools: two recent reports from our research group on the presence of BA and 2,5DMBA [18,19] and the contribution of Zwiener et al. [17] that only reports the
presence of 3-HBA. With respect to formaldehyde, it was detected in all treated
waters. Finally, Figure 4 shows the SIM mode chromatograms obtained in the
analysis of ozonated drinking water and indoor swimming pool water sample 2 (see
Table 4).
167
Table 3 Analytical features of the µ–SPE method developed for the determination of LMMAs in water by LC–MS.
r2
Linear range
(µg L–1)
RSD (%)
LOD
LOQ
Intra–day Inter–day
(ng L–1) (ng L–1)
(n = 6)
(n = 3)
Target analytes
Calibration curve
Benzaldehyde
y = 31.3(±0.8)x + 0.5(±0.4)
0.9963
0.05 – 2.50
19.9
65.7
5.2
6.1
3–methylbenzaldehyde
y = 25.7(±0.7)x + 0.5(±0.4)
0.9957
0.10 – 2.50
23.9
78.9
5.8
6.9
2–ethylbenzaldehyde
y = 23.9(±0.5)x + 0.6(±0.5)
0.9981
0.10 – 2.50
26.0
85.8
6.6
7.4
2,5–dimethylbenzaldehyde
y = 24.2(±0.7)x + 0.7(±0.6)
0.9968
0.10 – 2.50
25.0
82.5
6.4
7.2
3–hydroxybenzaldehyde
y = 43.1(±0.9)x + 0.8(±0.6)
0.9963
0.05 – 2.50
14.8
48.8
6.1
6.8
2,5–dihydroxybenzaldehyde
y = 44.5(±0.9)x + 0.5(±0.4)
0.9974
0.05 – 2.50
16.1
53.1
5.6
6.3
Acetaldehyde
y = 29.4(±0.8)x + 0.5(±0.4)
0.9972
0.05 – 2.50
20.1
66.3
5.5
6.4
Propionaldehyde
y = 25.0(±0.8)x + 0.7(±0.7)
0.9964
0.10 – 2.50
24.1
79.5
6.9
7.5
Butyraldehyde
y = 23.1(±0.6)x + 0.8(±0.6)
0.9971
0.10 – 2.50
26.1
86.1
6.8
7.3
Valeraldehyde
y = 25.3(±0.6)x + 0.7(±0.5)
0.9983
0.10 – 2.50
24.0
79.2
7.1
7.7
a
a
±SD (n=10); y: peak area (Mcounts s–1); x: standard concentration (µg L–1).
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
Figure 4
Chromatogram obtained in the analysis of 100 mL of (A) ozonated drinking
water, and (B) chlorinated indoor swimming pool water sample 2 (see Table
4). C2, acetaldehyde; 3-HBA, 3-hydroxybenzaldehyde; C3, propionaldehyde;
C4, butyraldehyde; BA, benzaldehyde; C5, valeraldehyde; 3-MBA, 3methylbenzaldehyde; 2-EBA, 2-ethylbenzaldehyde; 2,5-DMBA, 2,5dimethylbenzaldehyde. For experimental conditions see Section 2.
4. Conclusion
New reliable techniques are needed for the analysis of aldehydes in waters.
This is the first study to develop the determination of six LMM substituted BAs in
169
Capítulo 4
treated water based on µ–SPE derivatization and the extraction of aldehydes with
DNPH followed by LC–MS analysis in ESI mode.
The method is rapid and simple with good sensitivity (LOQs at the
nanogram per litre level) and precision, free from interferences and environmentally
friendly because of low organic solvent consumption. In comparison to previous
research, the LOQs provided by the proposed method were significantly better than
those obtained by other methods described so far [18,19,27,30,31]. As consequence,
the proposed method has allowed the detection, for the first time, of the occurrence
of some LMM substituted BAs in the treated water, such as 3-MBA and 2-EBA in
swimming pools. Regarding EPA Method 8315A [21], the µ–SPE method proposed
presents the following innovations: (i) the derivatization reaction with DNPH and
extraction of derivatives can be performed at the same time at room temperature
for 40 min (100 mL of sample) versus the 40 °C for 80 min required by EPA
Method 8315A for sequential derivatization and SPE steps of the same sample
volume; and (ii) the use of an aqueous/organic phase ratio of 1000 versus 10 (EPA
Method 8351A) improved sensitivity with LOQs at ng L–1 levels. In summary, the
proposed method provides a “green”, fast, economical and simple tool for the
determination of LMM substituted BAs in treated water.
170
Table 4 Results for the determination of aldehydes in treated water by the proposed µ–SPE/LC–MS method.
Concentration found in water ± SD (µg L–1; n = 3)
Target analytes
Ozonated
drinking water a
Indoor swimming pool a
Outdoor swimming pool a
Sample 1
Sample 1
Sample 2
Sample 2
Benzaldehyde
0.76  0.07
4.4  0.6
4.7  0.5
1.8  0.2
2.2  0.2
3-methylbenzaldehyde
N. D.
0.17  0.02
0.43  0.04
N. D.
0.12  0.02
2-ethylbenzaldehyde
N. D.
N. D.
0.23  0.03
N. D.
N. D.
2,5-dimethylbenzaldehyde
N. D.
0.15  0.01
0.83  0.08
N. D.
0.34  0.03
3-hydroxybenzaldehyde
N. D.
0.28  0.03
0.47  0.06
0.14  0.02
0.23  0.02
2,5-dihydroxybenzaldehyde
N. D.
N. D.
N. D.
N. D.
N. D.
Acetaldehyde
4.8  0.6
10.9  0.9
12.4  1.1
7.4  0.8
9.1  0.8
Propionaldehyde
1.8  0.2
3.3  0.3
1.2  0.1
2.6  0.3
0.9  0.1
Butyraldehyde
3.2  0.3
4.9  0.5
3.4  0.3
3.7  0.3
1.8  0.2
Valeraldehyde
2.1  0.2
3.3  0.4
1.5  0.2
1.4  0.2
0.65  0.06
N. D., not detected.
a
Two–fold dilution before LC–MS analysis except for acetaldehyde quantification in swimming pool (5–fold dilution).
Capítulo 4
Acknowledgments
The authors gratefully acknowledge the subsidy provided by the Spanish
Inter–Ministerial Commission of Science and Technology of the Ministry of
Education and Science under the CTQ2010–17008 and by the Junta de Andalucía
under PO7–FWM–02493. European Regional Development Fund (ERDF) also
provided additional funding. J.M. Fernández–Molina would also like to
acknowledge the Junta de Andalucía for awarding him a predoctoral Grant. The
authors also thank Kinesis Inc. for supplying TelosTM ENV sorbent.
172
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
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Chromatographia
http://link.springer.com/journal/10337
ORIGINAL
LC–MS analytical method for biomonitoring of aliphatic and
aromatic low–molecular–mass aldehydes in human urine
José María Fernández–Molina and Manuel Silva
Department of Analytical Chemistry, Rabanales Campus, University of Cordoba
Abstract
The aim of this study was to monitor aliphatic and aromatic low–molecular–
mass aldehydes (LMMAs) in human urine to obtain a way to assess exposure.
Aliquots of 12.5 mL of urine samples, diluted 1:1 with 4 mol L–1 hydrochloric acid,
were aspirated into a TelosTM ENV µ–SPE column impregnated with 2,4dinitrophenylhydrazine for the cleanup, derivatization and pre–concentration of the
aldehydes. Determination was achieved by LC with a MS detector operating in the
SIM mode. The method is fast and provided low LODs (90–300 ng L–1) with good
precision (the intra– and inter–assay precision, expressed as RSD, ranged from 6.1
to 8.8% and 7.1–9.1%, respectively). Average recoveries from urine samples, which
were spiked with the target analytes at levels of 2.5 and 10 µg L–1, ranged from 95 to
99%. Only aliphatic LMMAs were found in urine samples from exposed researchers
taken after handling these compounds. From the excretion kinetics of aldehydes
(half–life times between 0.9 and 1.4 h) it was found that the dosage absorbed was
eliminated within ~ 6 h after exposure.
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
1. Introduction
Low–molecular mass aldehydes (LMMAs) are a class of carbonyl compound
known for their adverse health effects, hence the growing interest in their analysis in
recent years. There are different aldehyde sources for humans, such as aldehydes of
environmental or occupational concerns, dietary and drug aldehydes, aldehydes
present in treated waters as disinfection by–products and aldehydes formed
endogenously by intermediary metabolism [1–6]. In view of the widespread
presence of these compounds, accurate aldehyde measurements in biological fluids
are important in order to evaluate their implications for human health. Analysis of
aldehydes in human urine is a non–invasive and simple assay widely used for this
purpose. Many reported methods have focused on the determination of
endogenous reactive aldehydes (malondialdehyde, hexanal, heptanal, glyoxal,
methylglyoxal, among others) formed in lipid peroxidation processes as a result of
radical–induced oxidative stress [7–13]. The presence of these aldehydes in human
urine samples as lipid peroxidation products is linked to various pathological
conditions, such as carcinogenesis [7–12] and Alzheimer´s disease [13]. Urinary
aldehyde concentration has been also used as a biomarker for other deficiencies.
Thus, urinary acetaldehyde excretion is related to alcohol consumption [14] and the
monitoring of urinary acrolein in patients receiving cyclophosphamide and
ifosphamide can indicate when to take heightened preventive measures against
hemorrhagic cystitis [15]. Finally, and to our knowledge, only one reference has
been found relating the determination of one aldehyde (formaldehyde) in urine
from exposed healthy volunteers, although no data on the excretion kinetics of
formaldehyde have been reported [16].
Direct analysis of aldehydes is complicated due to their high volatility and
chemical instability; as a result, derivatization of aldehydes prior to analysis is
necessary
to
achieve
quantitative
results.
O-2,3,4,5,6-(pentafluorobenzyl)
179
Capítulo 4
hydroxylamine (PFBHA) and 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) are the typical
reagents for the derivatization of aldehydes with GC and LC analysis, respectively.
To analyze urinary aldehydes, LC–DNPH methods [7,9,17] are largely used instead
of GC–PFBHA ones [16]. Regarding sample preparation methods, in general these
DNPH methods consist of the batch derivatization of the aldehydes, which entails
an extensive work–up and consuming of materials and solvents for the
derivatization and the subsequent extraction of the derivatives.
Based on the above considerations, the originality of the present work
resides in two main aspects: (i) to optimize a Telos ENV µ–SPE module for the
derivatization and extraction of aliphatic and aromatic LMMAs with DNPH from
urine samples prior to their determination by LC–MS, which provides a high degree
of sensitivity in a short analysis time. (This µ–SPE unit was developed by us early
on for the determination of these aldehydes in treated water [6]); and (ii) to obtain
information about the half–lives of aliphatic and aromatic LMMAs in the body of
researchers exposed through handling these chemicals. To date, there has been a
lack of information about the kinetics of the urinary excretion of these compounds,
and therefore this work constitutes the first approach into this field.
2. Materials and methods
2.1. Standards and reagents
All chemicals and solvents used were of analytical–reagent and
chromatographic grade, respectively. Acetaldehyde was purchased from Sigma
(Sigma–Aldrich Química, Madrid, Spain) whereas propionaldehyde, butyraldehyde
180
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
and valeraldehyde were acquired from Fluka (Sigma–Aldrich Química).
Benzaldehyde,
3-methylbenzaldehyde,
2,5-dimethylbenzaldehyde,
2-
ethylbenzaldehyde, 3-hidroxybenzaldehyde and 2,5-dihydroxybenzaldehyde were
supplied by Aldrich (Sigma–Aldrich Química). A 60 mmol L–1 DNPH (Fluka) stock
solution was made by dissolving 594.4 mg of the derivatizing reagent in 50 mL of a
solution containing 12 mol L–1 hydrochloric acid, LC–MS ultra–grade water
(Chromasolv, Fluka) and acetonitrile (ACN) (2:5:1, v/v/v) and then stored in a
freezer. Successive diluted solutions were prepared in LC–MS ultra–grade water.
Telos ENV (mean particle size 80 µm, surface area ~ 900 m2 g–1) was kindly
supplied by Kinesis Inc. (Vidrafoc S.A. Madrid, Spain). Surine™ Negative Control,
a simulated urine matrix, was purchased from DynaTek Inc. (Lenexa, KS, USA).
2.2. Preparation of standards and calibration curves
Each aldehyde stock solution (4.0 mg mL–1) was prepared in methanol
(Romil Chemicals, Cambridge, UK) and stored at 4 C. The stock solutions were
diluted daily with LC–MS ultra–grade water to prepare working solutions between
0.05 and 2.5 µg mL–1. Ten working standard solutions containing all aldehydes were
prepared by spiking synthetic urine (Surine™ Negative Control) diluted 1:1 with 4
mol L–1 hydrochloric acid with working solutions of LMMAs. These working
standard solutions covered concentration ranges of 0.3–25 µg L–1.
2.3. Urine samples
Urine samples from two researchers who routinely worked with LMMAs
were taken. Samples were collected before, within 15 min after exposure (sample
considered at time 0) and 0.5, 1, 2, 4, 6 and 8 h after exposure in sterilized
181
Capítulo 4
polyethylene bottles of 100 mL without headspace to prevent the formation of air
bubbles, in an area separated from the site of exposure in order to avoid the risk of
contamination. At the same time, urine samples of three researchers who worked in
other laboratories and did not manipulate LMMAs were also collected following the
same procedure. Each urine samples were analyzed directly in triplicate after
collection or stored at 4 C up to 72 h if required. When the time between urine
collection and analysis exceeds 72 h, samples can be stored at –20 C up to 30 days
to avoid storage losses. The frozen urine samples were left in a refrigerator until
completely thawed. If required, the thawed urine samples can be stored for 4 h
prior to their analysis in a refrigerator. Before derivatization, 12.5–mL aliquots of
urine sample were filtrated through 0.45–mm mesh (4 mm in diameter, Micron
Separations, Westboro, MA) at a flow–rate of 1.0 mL min–1 using a peristaltic pump
(Gilson, Middleton, WI, USA).
2.4. Derivatization and pre–concentration of aldehydes with the µ–SPE system
Aldehydes were derivatized and pre–concentrated by using the µ–SPE
system recently developed from our research group for the determination of
LMMAs in treated waters [6]. Briefly, the procedure was as follows: a laboratory–
made µ–SPE column packed with 25 mg of Telos ENV and placed in the loop of
an injection valve was conditioned with 1 mL of ACN and 2 mL of ultra–pure
water. The µ–SPE column was loaded with 2.0 mL of a 2.5 mmol L–1 DNPH
solution at 1.0 mL min–1 and then aliquots of 12.5 mL of human or spiked synthetic
urine samples (diluted 1:1 with 4 mol L–1 hydrochloric acid) were aspirated through
the µ–SPE system at 2.5 mL min–1 for aldehyde derivatization and extraction.
DNPH derivatives were eluted with 100 µL of ACN. The extract was collected in
an Eppendorf vial and, if required, could be stored at –20 ºC up to 30 days to avoid
182
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
storage losses. Under these conditions, the µ–SPE column exhibited reproducible
signals for the analysis of around 500 samples.
2.5. LC–ESI–MS instrumentation and chromatographic conditions
The LC–MS instrument was a Varian (Walnut Creek, CA, USA) equipped
with two isocratic, high–pressure mixing pumps, an autosampler, a thermostated
compartment for the column and a triple quadrupole mass spectrometer furnished
with an ESI interface. The mass spectrometer was operated in the negative
ionization mode with the data acquisition mode of SIM for quantitative analysis
(scan time, 0.2 s). The ionization conditions were adjusted as follows: nitrogen was
used as both the nebulizing (50 psi) and drying (25 psi) gas; collision–induced
dissociation voltage, 45 V; capillary temperature, 300 °C; and capillary voltage, 5500
V. The ion that provided the highest intensity (see Table 1) was chosen as the
quantifying ion.
Chromatographic separation was performed on an Ascentis® Express C18
column (150 mm × 2.1 mm; 2.7 µm) acquired from Sigma. A 0.1% formic acid (A)
and ACN:methanol (75:25, v/v) (B) solutions were employed as the mobile phase.
DNPH derivatives were separated using the following gradient: an initial
concentration of 10% solvent B was held for 1 min, and then it was raised linearly
(10 min) to 100% solvent B and, immediately afterwards, held constant for 4 min.
The mobile phase flow was set at 0.20 mL min–1 and the temperature of the column
fixed at 40 °C. The injection volume for standards and sample extracts was 8 µL.
Retention times for each DNPH derivative are shown in the Table 1.
183
Table 1 Analytical characteristics of the –SPE method for the determination of LMMAs in urine samples by LC–MS.
RSD (%)
Aldehyde
m/z
Retention time a)
(min)
Linear range
(µg L–1)
LOD
(ng L–1)
2,5–dihydroxybenzaldehyde
317
9.15 ± 0.03
0.4–20
120
6.6
7.5
Acetaldehyde
223
9.69 ± 0.04
0.5–20
150
6.2
7.2
3–hydroxybenzaldehyde
301
9.94 ± 0.05
0.3–20
90
7.1
7.9
Propionaldehyde
237
10.59 ± 0.06
0.8–25
240
8.8
8.8
Butyraldehyde
251
11.38 ± 0.05
1.0–25
300
8.3
8.4
Benzaldehyde
285
11.62 ± 0.05
0.5–20
150
6.1
7.1
Valeraldehyde
265
12.13 ± 0.04
0.8–25
240
8.5
9.1
3–methylbenzaldehyde
299
12.32 ± 0.04
0.8–25
240
6.8
8.1
2–ethylbenzaldehyde
313
12.79 ± 0.03
1.0–25
300
7.8
8.5
2,5–dimethylbenzaldehyde
313
12.98 ± 0.04
1.0–25
300
7.5
8.3
a)
± SD (n = 10)
Intra–day
(n = 6)
Inter–day
(n = 3)
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
3. Results and discussion
3.1. Method development
The determination of urinary aldehydes as biomarkers for human exposure
in the workplace is a complex task that requires sample purification and pre–
concentration procedures for improving selectivity and sensitivity. Recently, we
have demonstrated that LMMAs can be readily quantified at nanogram–per–litre
levels in treated waters by LC–MS after their DNPH derivatization/pre–
concentration using a continuous Telos ENV µ–SPE unit [6]. As a result of the
good features of this method, it was used in the present work to study the excretion
kinetics of aliphatic and aromatic LMMAs via urine of researchers exposed by
handling these carbonyl compounds in the laboratory.
In order to evaluate a possible matrix effect of the urine samples on the
analytical signal, it is necessary to re–study some variables in the continuous µ–SPE
system such as the pH, the DNPH amount and especially the breakthrough volume
of the urine sample because it is closely related to the dilution factor required for
the analysis of the target urinary aldehydes. For this study, synthetic urines spiked
with aldehydes at 5.0 µg L–1 level were used as the sample matrix. The effect of
urine dilution was evaluated over the range 1:1 to 1:5 using urine volumes from 12.5
to 50 mL. In all cases, dilutions were carried out with hydrochloric acid in order to
achieve a final proton concentration of 2 mol L–1. Dilution factors higher than 1:5
were rejected to avoid low aldehyde concentrations in the diluted urine sample.
From the experimental data, accuracy results (recoveries over 95%) can be achieved
when 12.5 mL of urine sample are diluted 1:1 with 4 mol L–1 hydrochloric acid.
Although higher volumes of urine (up to 50 mL) could be analyzed using this
dilution factor, in order to reduce analysis time 12.5 mL of urine sample were
chosen because the sensitivity achieved in these conditions was enough for the
185
Capítulo 4
whole and accurate characterization of the excretion kinetic curve of aldehydes in
the urine of researchers exposed. Moreover, using this dilution factor, none of the
above mentioned variables (pH and DNPH amount) showed significant changes in
their dependency with respect to that observed in the method reported elsewhere
for the determination of aldehydes in treated water samples [6]. Finally, and as can
be seen in Table 2, it is noteworthy to mention that the features of the proposed µ–
SPE sample preparation method surpasses those provided by the method
developed for our research group for the determination of aliphatic LMMAs in
urine samples using LiChrolut EN as sorbent material [17].
Table 2 Selected variable values for the urine sample preparation by µ–SPE using
Telos ENV and LiChrolut EN as sorbent materials.
Conditions
Telos ENV
LiChrolut EN a)
Urine sample pH
2.0 mol L–1 HCl
1.5
Dilution factor
1:1
1:1
DNPH amount, mg
1.0
1.0
Sorbent amount, mg
25
50
Sample flow–rate, mL min–1
2.5
1.0
Urine sample breakthrough volume, mL
50
10
a) Results
186
obtained from [17]
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
3.2. Analytical performance characteristics
The method was validated according to ICH guidelines for bioanalytical
method validation [18,19]. Calibration curves were obtained by using synthetic urine
(diluted 1:1 with 4 mol L–1 hydrochloric acid) spiked with aldehyde standards and by
plotting the peak area against the analyte concentration. Table 1 lists analytical
figures of merit of the method and Figure 1A shows the efficient separation of the
target aldehydes under optimal experimental conditions. Calibration curves showed
a wide linear range (from 0.3 to 25 µg L–1) with adequate linearity (correlation
coefficients greater than 0.998). Inter–day variation of calibration slopes (3
consecutive days) measured as the RDS was less than 2%. Formaldehyde was not
included because it cannot be quantitatively determined due to the high uncertainty
associated with the MS signal of its DNPH derivative [20]. LODs were calculated as
the lowest concentration of the analyte that can be reliably differentiated from the
background level (S/N = 3) and LOQs as the lowest concentration of the analyte
that can be measured with a stated level of confidence (the lower limit of the linear
range) [18]. As can be seen in Table 1, the method allows the determination of
these aldehydes at very low levels in urine samples: the calculated LODs ranged
from 90 to 300 ng L–1, and the estimated LOQs were in the range of 0.3–25 µg L–1.
These values reflect the very high degree of sensitivity provided by the method. The
precision, expressed as RSD, was evaluated by calculating the intra– and inter–day
precision of six analyses of different working solutions of the aldehydes at the same
concentration (12.5 mL of synthetic urine diluted 1:1 with 4 mol L–1 hydrochloric
acid were spiked with each aldehyde at a concentration level of 5.0 µg L–1) under the
same experimental conditions on three consecutive days (n = 3). As shown in
Table 1, the repeatability and the reproducibility were satisfactory, ranging from 7.4
± 0.9% to 8.1 ± 0.7%, respectively.
187
Capítulo 4
Figure 1
LC–MS chromatograms (SIM mode) obtained in the analysis of 12.5 mL of a)
synthetic urine containing 5 µg L–1 of each LMMA and b) human urine taken
after exposure (the ACN extract was diluted 20–fold before LC–MS analysis).
Peak identification: 1, 2,5-dihydroxybenzaldehyde; 2, acetaldehyde; 3, 3hydroxybenzaldehyde; 4, propionaldehyde; 5, butyraldehyde; 6, benzaldehyde;
7, valeraldehyde; 8, 3-methylbenzaldehyde; 9, 2-ethylbenzaldehyde; and 10, 2,5dimethylbenzaldehyde. Other conditions as described in Material and Methods
Section.
In order to validate the developed method for the determination of LMMAs
in human urines samples, a recovery study was conducted. Since certified reference
material was not available, treated synthetic urine samples were spiked with the
LMMAs at two different concentrations (2.5 and 10 µg L–1) and analyzed in
188
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
triplicate. The average recoveries found were satisfactory, ranging between 95 and
99%, which testify the applicability of the proposed method in urine samples.
Here it may be interesting to compare the analytical features of the method
proposed to reported chromatographic alternatives for the determination of urinary
LMMAs. The following conclusions can be inferred: (i) as far as we know, no
method for determining aromatic LMMAs in human urine samples has been
reported to date; (ii) the LODs afforded by the proposed LC–MS method are lower
than those achieved by recent LC–DAD [7,9] and GC alternatives, the latter with
MS [12,15] or electron capture [12,16] detection; and (iii) only one recent
contribution of our research group provides slightly lower LODs, although only for
aliphatic LMMAs because aromatic ones are not included in the study [17]. In this
work, the use of Telos ENV allows the derivatization of aldehydes at more acidic
solutions than LiChrolut EN (see Table 2) which enhances the derivatization
efficiency for aromatic LMMAs whereas the sensitivity for aliphatic ones does not
decrease significantly.
3.3. Study of human exposure to aldehydes through the use of urine samples
In order to study the excretion kinetics of aliphatic and aromatic LMMAs,
urine samples from two exposed researchers, who handled these chemicals during
the preparation of stock solutions (4 g L–1 in methanol), were collected before
exposure and at 0, 0.5, 1, 2, 4, 6 and 8 h after termination of exposure. The sample
collected within 15 min after exposure is considered the sample at time 0 and the
rest follow this initial sample at determined intervals of time. Aliphatic LMMAs
were the only compounds found at concentrations above the LOQ in the urine
samples from two exposed researchers, whereas aromatic LMMAs were not
detected within 15 min of exposure probably due to their low volatility, which
189
Capítulo 4
prevents their inhalation. As can be observed in Figure 2, excretion curves
followed a first–order kinetics and the concentration decline was described by an
exponential decay function, obeying the equation y = y0 + A × exp (–kt). In this
equation, the rate constant (k) indicates the fraction of the determination in the
body removal per unit of time. The biological half–life (t1/2) of a substance in a body
fluid denotes the time needed to reduce the biological level of the substance in half
[21]. Half–life is inversely related to the elimination constant (k = ln 2/t1/2) and is
the most useful parameter to describe the elimination process. Similar results were
obtained for the two researchers studied and the rate constants and the biological
half–lives obtained for both researchers using a first–order model are listed in
Table 3.
Aliphatic LMMAs were detected in the urine of exposed researchers
throughout the 24–216 µg L–1 range (see Table 3) after preparation of stock
solutions. Because these results exceeded the highest concentration of the linear
range studied for these aldehydes (see Table 1), urine samples were appropriately
diluted before LC–MS analysis. None of the aldehydes, except acetaldehyde at a
concentration level of ca. 15 µg L–1, were found in the urine samples of researchers
taken before exposure (after a week without any contact with the laboratory),
similar to that found in researchers who worked in other laboratories (unexposed
people). The presence of acetaldehyde in urine of unexposed people can be
associated with its endogenous formation from lipid peroxidation processes [12]. As
a result, the presence of aliphatic LMMAs in urine was attributed to exposure
during standard solution preparation, because the urine samples of researchers who
worked in other laboratories and did not manipulate these compounds were not
contaminated with LMMAs. In summary, these results showed that the most
volatile aldehydes studied (aliphatic LMMAs) can be rapidly absorbed by inhalation
and readily eliminated through urine within  6 h after exposure. This behaviour
190
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
was in line with the results of other researchers, in which the proportion of
compound excreted in urine with the amount absorbed was usually low and
depended on the hydrophobicity of the chemical [21]. By way of example, Figure
1B shows the chromatogram obtained from the urine sample of researcher 1 taken
after exposure.
4. Conclusion
This work successfully develops a simple and environmentally friendly
method to determine aliphatic and aromatic LMMAs in human urine samples at
nanogram–per–litre levels based on combining µ–SPE with LC–MS. Because of the
lack of methods for assessing human exposure to LMMs using urine samples and
the high sensitivity provided by the method proposed, its reliability for studying the
excretion kinetics of these aldehydes in this non–invasive sample was evaluated.
From the obtained results, it can be inferred that: (i) urine is a suitable matrix for
the biomonitoring of these compounds in exposed researchers who handled these
compounds during the preparation of their standard solutions in a laboratory; (ii)
the inhalation of aromatic aldehydes during the preparation of stock solutions is not
significant because they are not detected in urine samples; and (iii) although
aliphatic aldehydes are detected in urine samples at relatively high concentrations
after exposure, kinetic data reveals that they are all practically excreted in about 6 h.
In summary the method provides a fast, economical and simple tool for the
quantification of LMMAs in urine samples as biomarkers for the evaluation of
occupational hazards.
191
Table 3 Concentrations, rate constants (k) and biological half–lives (t1/2) for aliphatic LMMAs found in exposed researcher’s urine after
exposure.
Aldehyde
Researcher 1
Researcher 2
Concentration (µg L–1)
k (h–1)
t1/2 (h)
Concentration (µg L–1)
k (h–1)
t1/2 (h)
Acetaldehyde
216 ± 16
0.54  0.06
1.3  0.2
198 ± 15
0.49  0.06
1.4  0.2
Propionaldehyde
160 ± 15
0.63  0.06
1.1  0.1
135 ± 12
0.61  0.06
1.2  0.1
Butyraldehyde
72 ± 7
0.75  0.08
0.92  0.08
52 ± 6
0.73  0.08
0.9  0.1
Valeraldehyde
34 ± 4
0.76  0.07
0.91  0.09
24 ± 3
0.71  0.07
1.0  0.1
Innovaciones en la determinación de aldehídos aromáticos
en agua y matrices biológicas mediante LC–MS
Acknowledgments
The authors gratefully acknowledge the subsidy provided by the Spanish
Inter–Ministerial Commission of Science and Technology of the Ministry of
Education and Science under the CTQ2013–42701 and by the Junta de Andalucía
under PO9–FQM–4732. European Regional Development Fund also provided
additional funding. J.M. Fernández–Molina would also like to acknowledge the
Junta de Andalucía for awarding him a predoctoral Grant.
Conflict of Interest
The authors have declared no conflict of interest.
193
Capítulo 4
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Capítulo 4
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196
Capítulo 5
Determinación de aldehídos
aromáticos en muestras de agua
tratadas mediante MEKC–DAD
Determinación de aldehídos aromáticos en
muestras de agua tratadas mediante MEKC–DAD
En el campo de la electroforesis capilar (CE) es destacable la ausencia de
métodos analíticos para la determinación de aldehídos aromáticos de bajo peso
molecular en muestras de agua. Este aspecto es sorprendente si se consideran las
ventajas que presenta la CE sobre otras técnicas de separación con mayor recorrido,
como por ejemplo la cromatografía de líquidos. Por este motivo y debido al interés
presente a lo largo de esta Memoria por la propuesta de metodologías innovadoras
para la determinación de aldehídos en muestras acuosas, se aborda en el presente
capítulo el desarrollo de una metodología de electroforesis capilar en la modalidad
cromatografía electrocinética micelar con detección por diodos en fila para
determinar aldehídos aromáticos en muestras de agua. Al potencial de la
cromatografía electrocinética micelar en la resolución de los diferentes derivados
(selectividad) se une las que proporciona el sistema µ–SPE utilizado en capítulos
anteriores en términos de sensibilidad. Los aspectos más destacables de la
investigación desarrollada son:
– Desarrollo de la primera metodología de CE para llevar a cabo la
determinación de forma sistemática de aldehídos aromáticos en aguas. En
efecto, no existen hasta la fecha alternativas electroforéticas que determinen
mezclas de aldehídos aromáticos y alifáticos en tales muestras de agua; si
bien se ha desarrollado un número escaso de metodologías que se centran
fundamentalmente en la determinación de aldehídos alifáticos en aire.
– Estudio de distintos buffers de separación con objeto de desarrollar un
sistema micelar efectivo y simple con la eficiencia óptima para la adecuada
separación de los DNPH–derivados.
199
Capítulo 5
– Entender el empleo del sistema µ–SPE para derivatizar y preconcentrar
simultáneamente los aldehídos aromáticos con objeto de mejorar la
sensibilidad del método electroforético propuesto.
– Aplicación del método a muestras reales, incidiendo en el estudio de la
presencia de aldehídos de bajo peso molecular en muestras de agua
sometidas a proceso de desinfección oxidativos, como cloración (agua de
piscina) y ozonización (agua embotellada tratada). Para ello, la metodología a
desarrollar ha de proporcionar unos niveles de sensibilidad que permitan la
determinación de estos compuestos en la concentración en los que
típicamente se encuentran en las muestras estudiadas.
200
http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1002/(ISSN)1522-2683
Electrophoresis 35 (2014) 819–826
Micro solid–phase derivatization analysis of
low–molecular mass aldehydes in treated water
by micellar electrokinetic chromatography
José María Fernández–Molina and Manuel Silva
Department of Analytical Chemistry, Rabanales Campus, University of Cordoba
Received 7 September 2013; received in revised form 1 December 2013; accepted 1 December 2013
Abstract
A MEKC method was developed for the determination of aliphatic and
aromatic low–molecular mass aldehydes (LMMAS) in treated water samples. The
method involves the pre–capillary derivatization and extraction of the aldehydes on
a Telos ENV µ–SPE column impregnated with 2,4-dinitrophenylhydrazine
(DNPH). After elution of the hydrazones with ACN, the derivatives were analyzed
using MEKC–DAD. Resolution of the MEKC procedure was studied changing the
pH and the concentration of the buffer, the type and the concentration of surfactant,
and the organic modifier content in the BGE. A running buffer consisting of a
phosphate buffer (pH 7.2, 75 mmol L–1) with CTAB (50 mmol L–1) and ACN (30%)
gave the best results. Linearity was established over the concentration range 0.5–500
µg L–1 and LODs from 65 to 775 ng L–1; the inter–day precision was expressed as the
RSD of the aldehydes ranging from 6.6% to 8.4%. Matrix effects were shown to be
negligible by comparing the response factors obtained in ultra–pure and treated
waters. Aldehydes were readily determined at 1.1–8.4 µg L–1 levels in ozonated and
chlorinated water samples, the method proposed being the first CE contribution
developed for the systematic analysis of both aliphatic and aromatic LMMAs in
water samples.
Determinación de aldehídos aromáticos en
muestras de agua tratadas mediante MEKC–DAD
1. Introduction
The link between water quality and health has been known since early times.
However, only since the last century, disinfectants have widely been applied by
drinking water companies to prevent the spread of diseases and to improve water
quality [1–3]. In this treatment, disinfection by–products (DBPs) are formed
through the reaction of a chemical disinfectant (chlorine, chlorine dioxide,
chloramines, ozone or their mixtures) with organic (natural organic matter) or
inorganic (certain halide ions) precursors naturally present in the water [4–6]. The
health effects of DBPs in drinking water have been a concern worldwide since
DBPs were first reported in the mid–1970s because of their potential cancer effects
[3,7]. Among DBPs, non–halogenated low–molecular–mass aldehydes (LMMAs)
constitute a group primarily formed by drinking water ozonation [4,8,9], although
they can also be formed by treatment with chlorine or chlorine dioxide [6,10–12].
Despite the high toxicity and carcinogenic effect of these DBPs [3,13,14], no
legislation has thus far been reported for their control in drinking water.
The direct determination of aldehydes is complicated due to their volatility,
high polarity and chemical instability, and the absence of chromophore or
fluorophore. Because of these limitations, derivatization reactions are required prior
to their detection by chromatographic techniques. One of the derivatization
reactions most frequently used is based on the formation of hydrazones by reaction
with 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH), which are LC–amenable [15–22]. For GC
analysis with MS [23–29] or electron capture detector detection [30] o-2,3,4,5,6pentafluorobenzylhydroxylamine is commonly used. Both derivatizing reagents are
recommended by the United States Environmental Protection Agency (EPA) in
Methods 8315A [31] and 556.1 [32], respectively for the derivatization of free
carbonyl compounds in various matrices.
203
Capítulo 5
In recent years, CE with its extremely high column efficiency, speed of
analysis and low operational costs appears to be an interesting alternative to
chromatographic methods for LMMA analysis [33–47]. Nevertheless, a look at
scientific literature gives evidence of the lack of studies devoted to the development
of CE methodologies for the determination of LMMAs in water samples [39–42]
because, as in LC analysis, most methods proposed have been applied to the
determination of these aldehydes in air samples [33–38]. In addition, in most of
these studies the target analytes are generally aliphatic LMMAs although dicarbonyl
(glyoxal and methyl glyoxal) [42] and unsaturated (acrolein and crotonaldehyde)
[33–37] aldehydes have also been analyzed in some research. To the best of our
knowledge, only one study has been reported to date on the CE determination of
carbonyl compounds including aromatic aldehydes, namely benzaldehyde, o-, m-, pmethylbenzaldehyde and 2,5-dimethylbenzaldehyde [37]. After their derivatization
with DNPH, a total of 16 carbonyl compounds were determined in air by using a
continuous–flow gradient–elution MEKC method with DAD detection. DNPH is
the most popular derivatization reagent for CE analysis of carbonyl LMMAs
[37,38,39,43,45]; other hydrazine–based reagents have also been used for this
purpose to a greater or lesser degree, such as dansylhydrazine [34, 40] and 4hydrazinobenzoic acid [35,44], among others [36,41,42,47]. Derivatization of
LMMAs usually requires a clean–up step prior to CE separation. This off line
sample pretreatment step is also used to concentrate aldehydes before CE analysis.
For this purpose, liquid–liquid extraction is the most common extraction method,
although in recent years, SPE has played a prominent role in CE analysis since it
allows the extraction of chemicals with a lower consumption of organic solvents,
greater operational simplicity and higher recovery and enhancement factors [48].
This work implemented a MEKC–DAD method for the rapid and sensitive
determination of aliphatic and aromatic LMMAs in treated water based on their
204
Determinación de aldehídos aromáticos en
muestras de agua tratadas mediante MEKC–DAD
derivatization with DNPH. Because using SDS and mixed surfactant systems only
allowed the separation of DNPH derivatives of aliphatic LMMAs, a cationic
surfactant such as CTAB was used to overcome this selectivity limitation. DNPH
derivatization and the extraction of aldehydes was carried out using a µ–SPE unit
[15], which allowed LODs to be achieved for aliphatic LMMAs similar to those
obtained in a recent CZE report by our research group using LIF detection [42].
This off line sample concentration approach allowed LODs at ng L–1 levels using
DNPH–DAD, notwithstanding the low sensitivity provided by CE methodologies
when using absorbance–based detection. Moreover, MEKC resolution was
improved because the migration of the DNPH and its possible impurities did not
interfere with that of the derivatives, unlike the above–mentioned highly sensitive
fluorescent probe that was based on fluorescein [42]. It is noteworthy that the
proposed method is the first report on the determination of aliphatic and aromatic
LMMAs in treated waters by MEKC.
2. Materials and methods
2.1. Reagents
All chemicals and solvents were of analytical grade. Formaldehyde (37%
w/v solution in water) and acetaldehyde (≥99.5%) were purchased from Sigma
(Sigma–Aldrich Química, Madrid, Spain) whereas, propionaldehyde (≥96.0%) and
butyraldehyde (≥99.0%) were acquired from Fluka (Sigma–Aldrich Química).
Benzaldehyde (≥99.0%), 2-ethylbenzaldehyde (≥99.0%), 3-methylbenzaldehyde
(≥97.0%),
2,5-dimethylbenzaldehyde
(≥99.0%)
and
3-hydroxybenzaldehyde
(≥97.0%) were obtained from Aldrich (Sigma–Aldrich Química). Individual
205
Capítulo 5
standard solutions of aldehydes at concentrations of 4.0 mg mL–1 were prepared in
chromatographic grade methanol (Romil Chemicals, Cambridge, UK) and stored at
4° C. Standard mixtures of the analytes were prepared daily by appropriate dilution
of stock solutions in LC–MS ultra–grade water (Chromasolv, Fluka). A 60 mmol
L–1 DNPH (≥99%, Fluka) stock solution was prepared by dissolving 594.4 mg of
the chemical in 50 mL of a solution containing 12 mol L–1 hydrochloric acid, ultra–
pure water and ACN (2:5:1, v/v/v) and then stored in a freezer. Successive diluted
solutions were prepared in ultra–pure water. Telos ENV (mean particle size 80
µm, surface area ~ 900 m2 g–1) was kindly supplied by Kinesis Inc. (Vidrafoc S.A.
Madrid, Spain). The surfactants CTAB, SDS, polyethylene glycol tert-octylphenyl
ether
(Triton
X–100),
polyoxyethylene
(23) lauryl
ether
(Brij–35)
and
polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween 20) were purchased from Fluka,
whereas sodium cholate was obtained from Aldrich. Other solvents and chemicals
were purchased from Romil Chemicals (Cambridge, UK) and Merck (Darmstadt,
Germany), respectively.
2.2. Derivatization and extraction of aldehydes with the µ–SPE system
A diagram of the whole analytical procedure followed in this work is
depicted in Figure 1, including a scheme of the continuous–flow µ–SPE system
used for the in situ DNPH derivatization and extraction of aldehydes. The µ–SPE
column was made from PTFE capillaries of 3 mm id and 1 cm long, packed with 25
mg of Telos™ ENV sorbent material and located in the loop of the injection valve
IV1 (Rheodyne, Cotati, CA, USA). It was conditioned with 1.0 mL of ACN and 2.0
mL of ultra–pure water delivered at a flow rate of 0.5 mL min–1 using a Minipuls–3
peristaltic pump (Gilson, Middleton, WI, USA) fitted with poly (vinylchloride)
tubes. After conditioning, the µ–SPE column was impregnated with 2.0 mL of a 2.5
206
Determinación de aldehídos aromáticos en
muestras de agua tratadas mediante MEKC–DAD
mmol L–1 DNPH solution at 1.0 mL min–1. Then, volumes up to 100 mL of
standard solution or treated water in 2.0 mol L–1 hydrochloric acid containing
between 0.02 and 50 µg of aldehydes was continuously loaded into the system at 2.5
mL min–1 through the µ–SPE column.
Collect the water samples [250 mL PTFE bottles containing
125 mg of CuSO4·5H2O and 125 mg of (NH4)2SO4]
Transport to the laboratory in a portable freezer
Storage at –20 ºC up to 60 days
Storage at 4 ºC up to 7 days
Leave the frozen samples at room
temperature until completely thawed
Derivatization
extraction
ACN
IV2
Air
W
100 L
DNPH
IV1
W
Water
100 mL
SV
PUMP
TelosTM ENV
column
Analysis by MEKC–DAD
Figure 1 Flow diagram representing the whole protocol carried out for determining
LMMAs in treated water samples. A scheme of the µ–SPE system used for
derivatization and extraction of aldehydes is also depicted. SV, selecting valve;
W, waste.
207
Capítulo 5
The aldehydes were derivatized in situ with DNPH on the Telos ENV µ–
column and the sample matrix was sent to waste. Simultaneously, the loop of
injection valve IV2 (Rheodyne) was filled by hand with ACN (eluent) using a
syringe. Prior to elution, by switching IV1, any residual aqueous solution remaining
inside the µ–column and the connectors was flushed by passing an air stream at 0.5
mL min–1 for 2 min. In the elution step, IV2 was switched to pass the loop content
(100 µL of ACN) through the µ–column, carried by an air stream at 0.5 mL min–1
and in the opposite direction of the sample, to elute DNPH derivatives. The
organic extract was collected in an Eppendorf vial, and if required, can be stored at
–20 °C up to 30 days to avoid storage losses.
2.3. Sampling procedure
Water samples were collected in amber glass bottles (250 mL) with PTFE
screw caps. Copper sulfate pentahydrate (125 mg, 2.0 mmol L–1) and ammonium
sulfate (125 mg, 3.8 mmol L–1) were added to each bottle to avoid microbiological
decay and to absorb active chlorine, respectively. The bottles were completely filled
to avoid evaporation of the volatile compounds, stored at 4 ºC and analyzed within
7 days after collection. When the time between sample collection and analysis
exceeded one week, water samples were stored at –20 °C up to 60 days to avoid
storage losses. Before analysis, 20.0 mL of 12 mol L–1 hydrochloric acid were added
to 100 mL of sample to adjust acidity.
2.4. Micellar electrokinetic chromatography
MEKC was carried out on a P/ACE MDQ capillary electrophoresis
instrument equipped with DAD detector (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).
208
Determinación de aldehídos aromáticos en
muestras de agua tratadas mediante MEKC–DAD
The capillary was a 57 cm (50 cm effective length) by 50 µm id (375 µm od) piece of
fused–silica capillary tubing (Beckman) accommodated in a cartridge for DAD.
When a new capillary was installed, it was rinsed with HCl (0.1 mol L–1, 5 min),
ultra–pure water (2 min), NaOH (0.1 mol L–1, 8 min), ultrapure–water (5 min) and
the BGE (7 min) prior to the first analysis. Between analyses, the capillary was
rinsed with NaOH (0.1 mol L–1, 3 min), ultra–pure water (1 min) and the BGE (5
min). Samples were injected with hydrodynamic mode into the capillary for 5 s by
applying 0.5 psi at the cathodic end of the capillary. The BGE consisted of 75 mmol
L–1 disodium hydrogen phosphate (adjusted to pH 7.2 with diluted HCl) with 50
mmol L–1 CTAB and 30% ACN. Separations were performed under reversed
conditions at 25.0 ± 0.1° C using a separation voltage of 25 kV and detection at 360
nm.
3. Results and discussion
The aim of this work is to develop the first CE methodology for the
determination of both aliphatic and aromatic LMMAs in treated water. Therefore,
not only are the major aliphatic LMMAs (formaldehyde to butyraldehyde) detected
and determined in the treated water under study, but there are also five aromatic
ones (benzaldehyde, 3-methyl, 2-ethyl, 2,5-dimethyl and 3-hydroxybenzaldehyde)
based on their frequent or suspected presence in these kind of samples [15–17,23].
However, prior to CE analysis, aldehydes should be derivatized with DNPH
because the direct determination of these compounds is troublesome due to the
absence of a chromophore group in their chemical structure (the benzene ring in
aromatic aldehydes does not provide the sufficient chromaticity to develop sensitive
methods) and high polarity and volatility. For this purpose, LMMAs were
209
Capítulo 5
derivatized under experimental conditions reported elsewhere [15] and described in
Section 2.2 using a novel DNPH derivatization procedure based on a µ–SPE unit.
The studied range and the selected values for each variable affecting the
derivatization/extraction process are shown in Table 1. Under these experimental
conditions, up to 100 mL of water sample containing LMMAs at µg L–1 levels can
be simultaneously derivatized and extracted providing an enrichment factor of 1000
and up to around 500 samples can be analyzed with the same Telos ENV µ–SPE
column. Compared to classical SPE, this µ–SPE approach minimizes the
consumption of time, materials and solvents as well as increasing sensitivity because
higher pre–concentration factors can be achieved. After separation, the migration
times and peak areas of the DNPH derivatives are used, respectively, for the
identification and quantification of the analytes.
Table 1 Conditions for the continuous derivatization/extraction of LMMAs with
DNPH by µ–SPE using Telos ENV as sorbent material [15].
Variable
Studied range (selected value)
Sample medium, mol L–1 HCl
0.5 – 2.5 (2.0)
DNPH amount, mg
0.1 – 2.0 (1.0)
Telos ENV amount, mg
10 – 50 (25)
Sample flow–rate, mL min–1
1.0 – 5.0 (2.5)
Eluent
Methanol, ACN, 2-propanol, ethanol,
tetrahydrofurane (ACN)
ACN volume, µL
50 – 250 (100)
Sample breakthrough volume, mL
10 – 125 (100)
210
Determinación de aldehídos aromáticos en
muestras de agua tratadas mediante MEKC–DAD
3.1. Optimization of separation conditions
The reported MEKC–DNPH methods for the determination of carbonyl
compounds in air or water samples have been focused on the determination of
aliphatic LMMAs [38,39,43,45]. The only MEKC contribution including the
separation of both aliphatic and aromatic LMMAs is based on a gradient–elution
approach in which the solvent gradient is created using a microprocessor–
controlled syringe pump [37]. From these results, and to achieve the separation of
the target analytes using a simpler micellar system, the starting experimental
conditions were similar to those described in MEKC–DNPH methods for aliphatic
LMMAs. Thus, a BGE consisted of 20 mmol L–1 sodium borate adjusted to pH 9.0
and 50 mmol L–1 SDS was initially employed [39]. By using this BGE, the efficiency
of the separation was only enough to resolve aliphatic aldehydes, because aromatic
ones were co–eluted lately as a single peak. Additional experiments were carried out
varying the concentration and the pH of the buffer as well as the SDS
concentration. No remarkable increases in the separation efficiency were observed.
Finally, organic modifiers, such as methanol, ethanol, 2-propanol and ACN, were
added to the BGE at a concentration range between 5% and 30% each to expand
the migration window via reduction of EOF. From experimental results it can be
concluded that only ACN at 10% provided a slight enhancement in the resolution
since only the 3-hydroxybenzaldehyde peak was partially resolved from those of
other aromatic LMMAs (see Figure 2A). These results are similar to those detailed
in the literature by using SDS–MEKC [33,38,39,43,45] since only the separation of
DNPH derivatives of aliphatic aldehydes was reported; benzaldehyde was the only
aromatic aldehyde studied in mixtures with aliphatic ones in a sporadic work [33].
To our knowledge, only by using the above–mentioned continuous–flow gradient–
elution SDS–MEKC system [37] the separation of mixtures of aliphatic and
aromatic aldehydes using DNPH can be carried out.
211
Capítulo 5
To further enhance resolution, several MEKC alternatives were studied
based on the use of nonionic (Triton X–100, Brij 35 and Tween 20), cationic
(CTAB) and bile salt (sodium cholate) surfactants, in the absence and in the
presence of organic modifiers and with phosphate (pH 7.2) or borate (pH 9.2) as
running buffers. After many experiments, the most relevant results were as follows:
(i) a single wide band for DNPH derivatives, near the DNPH excess peak, was
observed when using nonionic micelles. This behavior can be assigned to the
complete solubilization of the DNPH derivatives within the micelles and therefore
they migrate at the micelle velocity; and (ii) CTAB micelles were the most useful
choice for improving the resolution because aliphatic and aromatic LMMAs can be
separated at base line, except for the DNPH derivatives of 2-ethyl and 2,5dimethylbenzaldehyde (see Figure 2B).
It is not easy to explain the different behavior of DNPH–derivatives of
benzaldehyde and its alkyl derivatives in SDS– and CTAB–MEKC systems because
they are neutral compounds in both BGEs: borate (pH = 9.2) and phosphate (pH =
7.2) buffers in the presence of ACN as organic modifier. However, and as stated
above, the complete separation of DNPH derivatives of benzaldehyde and its alkyl
derivatives (3-methyl, 2-ethyl and 2,5-dimethylbenzaldehyde) using SDS was
unfeasible (see Figure 2A), whereas this mixture can be resolved by using CTAB
(see Figure 2B). A similar situation has been reported in the literature for the
separation of nitrobenzenes by MEKC [49], in which the use of micelles of cetyl
trimethylammonium chloride allows the resolution of some nitrobenzene isomers,
which are unresolved by using SDS. In the same way as the separation of
nitrobenzenes, CTAB can alter the hydrophobic interactions between DNPH
derivatives of aromatic LMMAs and micelles allowing their resolution.
Finally, once that the micellar system was selected, the effect of variables
affecting resolution of DNPH derivatives was studied, namely the effect of pH
212
Determinación de aldehídos aromáticos en
muestras de agua tratadas mediante MEKC–DAD
(6.5–9.2) and phosphate buffer concentration (25–100 mmol L–1), surfactant
concentration (10–50 mmol L–1) and modifier content (10–30% ACN) bearing in
mind the attainment of a better resolution of the derivatives with high S/N. The
migration time was practically independent on the pH over the range studied (the
DNPH derivatives are neutral analytes) and increased with increasing of the buffer
concentration owing to the high ionic strength of the resulting electrophoretic
medium. A phosphate buffer (75 mmol L–1; pH 7.2) was chosen to ensure
acceptable resolution with short analysis time and good buffering capacity. The
effect of the most relevant variables (surfactant concentration and ACN content) on
the migration time of the DNPH–derivatives of aromatic LMMAs is shown in
Figure 3. As can be seen, the best resolution of the DNPH derivatives can be
achieved at 50 mmol L–1 CTAB concentration in the presence of ACN at 30%, and
therefore these values were selected as optimum.
213
Capítulo 5
Figure 2 Separation of DNPH–derivatized LMMAs by using different micellar systems:
(A) MEKC–SDS separation, BGE: 50 mmol L–1 SDS, 20 mmol L–1 borate (pH
9.2) and 10% ACN; and (B) MEKC–CTAB separation, BGE: 50 mmol L–1
CTAB, 75 mmol L–1 phosphate (pH 7.2) and 30% ACN. Peak identification: 1,
formaldehyde; 2, acetaldehyde; 3, propionaldehyde; 4, butyraldehyde; 5, 3hydroxybenzaldehyde; 6, benzaldehyde; 7, 3-methylbenzaldehyde; 8, 2ethylbenzaldehyde; 9, 2,5-dimethylbenzaldehyde; and *, unreacted DNPH. The
extra peaks eluted before the main peaks of acetaldehyde, propionaldehyde and
butyraldehyde can be assigned to the typical E–/Z–isomers of their
corresponding hydrazones. All other conditions as in Section 2. Further
explanations can be found in the text.
214
Table 2 Analytical features of the DNPH method developed for the determination of LMMAs in water by MEKC–DAD.
RSD (%)
Aldehydes
Calibration curve a)
r2
Linear range
(µg L–1)
LOD
(ng L–1)
Formaldehyde
y = 0.393(±0.009)x – 0.4(±0.4)
0.9971
0.5 – 200
165
545
6.7
7.5
Acetaldehyde
y = 0.851(±0.009)x + 0.3(±0.4)
0.9992
0.2 – 100
65
215
5.9
6.8
Propionaldehyde
y = 0.408(±0.007)x – 0.4(±0.3)
0.9984
0.5 – 200
160
530
6.4
7.2
Butyraldehyde
y = 0.452(±0.008)x – 0.3(±0.4)
0.9985
0.5 – 200
145
480
6.1
7.0
Benzaldehyde
y = 0.238(±0.004)x – 0.2(±0.1)
0.9990
1.0 – 250
275
910
5.7
6.6
3-methylbenzaldehyde
y = 0.126(±0.003)x + 0.1(±0.1)
0.9979
2.0 – 500
525
1730
6.7
7.8
2-ethylbenzaldehyde
y = 0.097(±0.002)x – 0.1(±0.1)
0.9988
2.5 – 500
675
2225
7.4
8.2
2,5-dimethylbenzaldehyde
y = 0.084(±0.003)x + 0.1(±0.1)
0.9941
2.5 – 500
775
2560
7.5
8.4
3-hydroxybenzaldehyde
y = 0.202(±0.002)x – 0.1(±0.1)
0.9995
1.0 – 250
300
990
6.1
6.7
a)
±SD (n = 10); y: peak area (mAU × s); x: standard concentration (µg L–1).
LOQ
Intra–day
–1
(ng L ) (n = 6)
Inter–day
(n = 3)
Capítulo 5
3.2. Method performance
A series of mixed standard solutions of LMMAs with different
concentrations were analyzed under optimum conditions to evaluate the
performance of the method in terms of linearity, LOD, LOQ, precision and
accuracy. Table 2 gives the corresponding analytical features. Calibration graphs
were prepared from aldehyde standards spiked in 100 mL of ultra–pure water and
by plotting the peak area of the DNPH derivative against the concentration of the
corresponding standard. LODs and LOQs were estimated to be the lowest
concentration of the analyte in a sample that provides an electrophoretic signal 3 or
10 times higher, respectively, than background noise [50].
The precision, expressed as RSD, was evaluated by calculating intra– and
inter–day precision of six analyses of different working solutions of the aldehydes at
the same concentration (100 mL of ultra–pure water spiked with 5.0 or 15 µg L–1 of
each aliphatic or aromatic aldehyde, respectively) under the same experimental
parameters on three consecutive days (n = 3). As can be seen, the method allows
the determination of these carbonyl compounds at very low levels (LODs ranged
from 65 to 775 ng L–1), all with good precision, viz. RSDs for the migration time
between 1.1% – 2.3% and those for peak area from 6.6% to 8.4%. The higher
sensitivities achieved for aliphatic LMMAs can be ascribed to the lower
derivatization efficiencies of aromatic ones. This behavior can be due to a possible
deactivating effect of the aromatic ring on the protonation of carbonyl oxygen of
the C=O bond prior to the nucleophilic attack of the amine group of DNPH to
form the corresponding hydrazone [51]. Here, it is also of interest to compare the
LODs of the target analytes achieved by the proposed MEKC–DAD method to
other electrophoretic options reported in the bibliography for the determination of
these aldehydes in water samples.
216
Determinación de aldehídos aromáticos en
muestras de agua tratadas mediante MEKC–DAD
The following comments can be inferred: (i) the method proposed is a
useful choice for the determination of these aldehydes as it provides higher
sensitivity than existing CZE [40–42] and MEKC [39] alternatives: the LODs
obtained for LMMAs were about two– [40] or three–orders [39,41] of magnitude
lower than those achieved by these methods. Only similar LODs for aliphatic
aldehydes can be achieved with LIF detection; however, derivatization should be
carried out for 3 h at 60 °C [42]; and (ii) the aim of the reported methods was
essentially the determination of aliphatic LMMAs, and only one of them was also
focused on the analysis of one aromatic, namely benzaldehyde [40].
Figure 3 Effect of (A) CTAB concentration and (B) ACN content on the migration time
of the DNPH derivatives of aromatic LMMAs. 3-HBA (○), BA (●), 3-MBA (□),
2 EBA (■), and 2,5-DMBA (). Other conditions are as described in Section 2.
Each data point represents an average of three individual runs and error bars
indicate SD.
217
Capítulo 5
Finally, the accuracy (matrix effect) of the MEKC–DAD method was
evaluated using the so–called response factor [52], which is calculated as follows:
For this purpose, calibration plots for each aldehyde were prepared in 100
mL of indoor swimming pool water and analyzed by using the proposed method.
No significant differences at a confidence level of 95% were found (a paired t–test
was used) between response factors of the matrix–matched calibration graphs for
each aldehyde and those obtained in ultra–pure water (experimental t–values ranged
from 0.73 to 1.48, the corresponding t critical value being 3.18). These results reveal
that both calibrations were statistically similar and therefore no matrix effect was
observed.
3.3. Determination of aldehydes in treated water samples
To evaluate the effectiveness of the µ–SPE/MEKC–DAD method
developed two types of water samples were analyzed: subjected to oxidative
treatment with ozone (ozonated drinking water) or by chlorination (swimming
pool). For this purpose, volumes of 100 mL of water were derivatized and analyzed
under conditions described in the Experimental Section; the determination results
are listed in Table 3 and the electropherogram obtained from the indoor swimming
pool water is shown in Figure 4. As expected, aliphatic LMMAs were the
compounds present to the greatest extent in all types of water analyzed; their
concentrations ranged from 1.1 to 8.4 µg L–1. With respect to aromatic LMMAs,
benzaldehyde was the only aromatic aldehyde found and merely in swimming pool
218
Determinación de aldehídos aromáticos en
muestras de agua tratadas mediante MEKC–DAD
water at concentrations about 3.0 µg L–1. This behavior can be due to that aromatic
LMMAs need the presence of large amounts of disinfectant and organic matter for
their occurrence. These results are similar to those reported in the literature on the
occurrence of LMMAs in swimming pool water (LMMA concentration range: 0.9–
38 and 0.2–15.3 µg L–1 for aliphatic and aromatic aldehydes, respectively) [15–
17,20,23], and they clearly demonstrate the robustness and good performance of the
method proposed for the analysis of trace levels of aldehydes in treated water
samples.
Figure 4 Electropherogram obtained in the analysis of 100 mL of water from an indoor
swimming pool (see Table 3). Peak assignment the same as in Figure 2 and
conditions as described in Section 2.
219
Table 3 Analysis of water samples treated with different disinfectants by the proposed MEKC–DAD method.
Aldehydes
Concentration found  SD (µg L–1; n = 3)
Drinking water
(ozonation)
Indoor swimming pool
(chlorination)
Outdoor swimming pool
(chlorination)
Formaldehyde
1.1  0.1
4.0  0.5
1.2  0.2
Acetaldehyde
3.2  0.3
8.4  0.8
5.8  0.6
Propionaldehyde
2.2  0.2
5.7  0.7
3.4  0.4
Butyraldehyde
3.9  0.4
2.8  0.3
1.3  0.2
Benzaldehyde
N. D.
3.2  0.3
2.6  0.3
3-methylbenzaldehyde
N. D.
N. D.
N. D.
2-ethylbenzaldehyde
N. D.
N. D.
N. D.
2,5-dimethylbenzaldehyde
N. D.
N. D.
N. D.
3-hydroxybenzaldehyde
N. D.
N. D.
N. D.
N. D., not detected.
Determinación de aldehídos aromáticos en
muestras de agua tratadas mediante MEKC–DAD
4. Concluding remarks
In this work we demonstrated that µ–SPE coupled to MEKC–DAD is a
powerful tool for the derivatization and extraction of LMMAs with DNPH as well
as for separation and sensitive determination of these carbonyl compounds. The
simplicity of the proposed method makes it suitable for the routine analysis of
LMMAs in treated water samples. The following conclusions can be drawn from its
performance: (i) the proposed CTAB–MEKC method is the simplest approach
proposed to date for the separation of a mixture of aliphatic and aromatic aldehydes
with DNPH using a commercial CE instrument; (ii) it extends the scope of CE for
the determination of aldehydes in water samples, since little work has been done in
this field so far; (iii) the use of the µ–SPE system for the derivatization and
extraction of the aldehydes provides a rapid and simple MEKC method with good
sensitivity (LODs at the nanogram per liter level) and precision, free from
interferences and environmentally friendly because of low organic solvent
consumption; (iv) the proposed MEKC–DAD method, with its satisfying sensitivity
and selectivity, is suitable for the determination of the aldehydes in ozonated and
chlorinated waters at very low levels; and (v) to our knowledge, this is the first
report on the systematic analysis of aromatic LMMAs in treated water samples by
CE, which is possible thanks to the high sensitivity and selectivity provided by the
method proposed.
221
Capítulo 5
Acknowledgments
The authors gratefully acknowledge the subsidy provided by the Spanish
Inter–Ministerial Commission of Science and Technology of the Ministry of
Education and Science under the CTQ2010–17008 and by the Junta de Andalucía
under PO7–FWM–02493. European Regional Development Fund (ERDF) also
provided additional funding. J. M. Fernández–Molina would also like to
acknowledge the Junta de Andalucía for awarding him a predoctoral Grant. The
authors also thank Kinesis Inc. for supplying Telos™ ENV sorbent.
The authors have declared no conflict of interest.
222
Determinación de aldehídos aromáticos en
muestras de agua tratadas mediante MEKC–DAD
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224
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225
Capítulo 5
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226
Capítulo 6
Resultados y discusión
Resultados y discusión
La Normativa Reguladora de los Estudios de Doctorado de la Universidad
de Córdoba en su artículo 24.4 sobre presentación de la Tesis como compendio de
publicaciones (modalidad de la presente Tesis Doctoral) no indica que sea necesario
incluir en la Memoria una sección de discusión conjunta de los resultados. Sin
embargo, dado que esta discusión de resultados se considera de gran interés, en este
capítulo se incluye:
a) Un resumen de los principales resultados derivados de la investigación
desarrollada en la Tesis Doctoral enfocada fundamentalmente a la
determinación de aldehídos aromáticos en muestras de interés ambiental
mediante técnicas cromatográficas y electroforéticas empleando distintos
sistemas de detección, y
b) Una discusión de los mismos con objeto de valorar la aportación científica
realizada en esta Tesis Doctoral mediante un estudio comparativo de las
ventajas y limitaciones de las metodologías propuestas frente a los métodos
descritos en la bibliografía existente.
Las investigaciones desarrolladas se centran principalmente en la propuesta
de metodologías analíticas para la determinación de aldehídos aromáticos como
subproductos de desinfección (disinfection by–products, DBPs) de aguas sometidas a
diferentes tratamientos (aguas de piscina, consumo, embotelladas, etc.). Sin
embargo, estos métodos contemplan también la determinación de aldehídos
alifáticos de bajo peso molecular dada la presencia de los mismos, incluso a niveles
superiores de concentración, en las muestras de agua analizadas. Desde un punto de
229
Capítulo 6
vista toxicológico se ha evaluado la incidencia sobre el autor de estas investigaciones
de la posible inhalación de estos analitos en el proceso de preparación de las
correspondientes disoluciones estándar. Mediante estudios cinéticos de excreción de
aldehídos alifáticos y aromáticos realizados en muestras de orina, se ha confirmado
la validez de esta muestra no invasiva y el carácter de biomarcadores de estos
aldehídos para evaluar la exposición a estos compuestos carbonílicos del personal
de laboratorio.
Se discuten a continuación las aportaciones realizadas para lo cual tras la
descripción de los analitos objeto de estudio se abordan las contribuciones en el
contexto de la derivatización/preconcentración de los aldehídos con 2,4dinitrofenilhidracina mediante un sistema de extracción en fase sólida.
Posteriormente se discuten las características analíticas de las metodologías
propuestas para la determinación de aldehídos mediante cromatografía de líquidos
(LC) con detección por diodos en fila (DAD) y por espectrometría de masas (MS)
así como por cromatografía electrocinética micelar (MEKC) con detección por
DAD. Finalmente, mediante el método desarrollado para la determinación de
aldehídos en muestras de orina se evalúan los efectos de la exposición y excreción
de estos compuestos carbonílicos del personal expuesto en el laboratorio.
1. Analitos objeto de estudio
El objetivo principal de esta Memoria es la propuesta de metodologías
analíticas para la determinación de aldehídos aromáticos de bajo peso molecular
(benzaldehído y derivados) ya que constituyen un grupo de contaminantes
emergentes no regulados, originados en el proceso de desinfección del agua y para
los cuales no existen prácticamente métodos analíticos ni información sobre su
230
Resultados y discusión
ocurrencia en algunos tipos de aguas tratadas. La determinación de estos analitos
presenta importantes problemas debido a su alta reactividad y polaridad por lo que
es necesaria una etapa de derivatización de manera previa a su determinación.
La determinación de benzaldehído como DBP junto con la de otros
aldehídos aromáticos se ha abordado escasamente hasta la fecha, a pesar de que nos
encontramos expuestos a estas sustancias de manera continuada por el agua de
consumo. El benzaldehído es el único compuesto carbonílico de carácter aromático
incluido como analito objeto de estudio por la Agencia de Protección Ambiental de
Estados Unidos (EPA) en los dos métodos recomendados para la determinación de
compuestos carbonílicos en agua y otros tipos de muestra: Método EPA 8315A [1]
y Método EPA 556.1 [2], si bien el primero de ellos también incluye los derivados
metilados 3-metil- y 2,5-dimetilbenzaldehído. En el contexto de estudios realizados
sobre la identificación de estos compuestos en aguas tratadas se ha descrito la
presencia de benzaldehído y 2,5-hidroxibenzaldehído cuando se emplea ozono en
este tratamiento [3,4], así como de benzaldehído, 3-hidroxi- y 2-etilbenzaldehído
cuando se utiliza cloro y dióxido de cloro [3–5].
Los métodos desarrollados en esta Tesis Doctoral, aunque optimizados para
conseguir una mayor eficiencia en el proceso de derivatización de los aldehídos
aromáticos, se han utilizado para la determinación conjunta de aldehídos aromáticos
y alifáticos de cadena corta (formaldehído, acetaldehído, propionaldehído,
butiraldehído y valeraldehído) dada la presencia de estos últimos en las muestras de
agua analizadas, por lo que las separaciones cromatográficas y electroforéticas se
han optimizado de acuerdo a este aspecto.
231
Capítulo 6
2. Derivatización/preconcentración de aldehídos mediante
µ–SPE
La determinación directa de aldehídos de bajo peso molecular en aguas
mediante cromatografía de líquidos presenta importantes problemas debido a la alta
reactividad, polaridad y volatilidad de estos compuestos, junto a la ausencia de un
grupo cromóforo o fluoróforo en su molécula, por lo que es necesaria una etapa de
derivatización previa a su determinación. El reactivo derivatizante más empleado es
la 2,4-dinitrofenilhidracina (DNPH) debido a su alta reactividad y selectividad con
los compuestos carbonílicos (aldehídos y cetonas), siendo utilizado generalmente
para llevar a cabo la derivatización de los aldehídos en medio ácido con objeto de
facilitar su determinación en matrices acuosas y otras más complejas de distinta
naturaleza.
El procedimiento típico conlleva la derivatización en batch de los aldehídos
para formar las hidrazonas, tal como se recomienda en el Método EPA 8315A [1].
Sin embargo existen ciertas discrepancias en la bibliografía sobre el procedimiento
experimental en diferentes aspectos, tales como la acidez de la muestra (pH oscila
entre 1.5 y 3.0), tiempo de derivatización (en algunos casos su duración es igual o
superior a 1 h, aunque algunas investigaciones alargan este período hasta 24 h) y
temperatura de derivatización (algunos autores calientan a 40–60 ºC para acelerar la
cinética de la reacción, aunque en la mayoría de los casos el proceso se lleva a cabo a
temperatura ambiente). Tras este proceso, la muestra pasa por un cartucho de RP–
C18 donde se retienen las hidrazonas ya formadas. La elución de las mismas se
produce mediante un disolvente orgánico, generalmente acetonitrilo, aunque
también se pueden utilizar otros disolventes orgánicos. El extracto orgánico se
puede llevar a sequedad y reconstituirlo en un volumen inferior de disolvente
232
Resultados y discusión
orgánico para así aumentar el factor de preconcentración y, con ello, la sensibilidad
del método.
Sin embargo y pese al uso extendido de esta metodología de derivatización,
existen ciertos inconvenientes como (i) necesidad de un elevado tiempo de
derivatización; (ii) problemas de selectividad en la etapa de preconcentración por la
retención de compuestos indeseados en el sorbente C18; y (iii) consumo elevado de
disolvente orgánico.
Se han descrito recientemente ciertas alternativas al sistema de SPE en
cartucho que utilizan un formato miniaturizado para la derivatización in situ de los
aldehídos alifáticos con DNPH. Las ventajas de estas propuestas radican en su
rapidez, bajo consumo de disolvente y la eliminación del paso extra de concentrar el
extracto en un pequeño volumen de disolvente orgánico. Una de estas propuestas,
llevada a cabo por Zhang y col. [6], emplean columnas capilares de polímeros
monolíticos para determinar aldehídos en saliva o bien hexanal y heptanal en
plasma. Pese a las ventajas indicadas, estos métodos presentan varios
inconvenientes, como la necesidad de sintetizar el polímero monolítico en el propio
laboratorio y el reducido volumen de muestra que permite (1 mL), por lo que no
son adecuados para la determinación de estos compuestos carbonílicos en muestras
de agua.
Con el objetivo de soslayar las limitaciones de estos métodos, nuestro
Grupo de Investigación [7] ha desarrollado un sistema de flujo continuo de SPE
para la derivatización–preconcentración in situ de aldehídos alifáticos con DNPH
empleando una minicolumna de SPE (µ–SPE) fabricada en el laboratorio. En este
formato miniaturizado el sorbente impregnado con el reactivo derivatizante retiene
a los aldehídos por formación de las correspondientes hidrazonas. Debido al
233
Capítulo 6
reducido formato de la minicolumna (50–100 mg) tan sólo es necesario un pequeño
volumen de disolvente para eluir las hidrazonas de los correspondientes aldehídos.
Las investigaciones que se han desarrollado en esta Tesis Doctoral hacen
uso de este sistema µ–SPE para llevar a cabo la determinación de aldehídos
aromáticos de bajo peso molecular en muestras de agua. Sin embargo, debido a las
condiciones de trabajo requeridas, en relación con los analitos estudiados, esta etapa
de µ–SPE ha sido rediseñada. En la Figura 1 se muestra un esquema del sistema de
flujo continuo empleado para el desarrollo de la etapa de µ–SPE.
Acetonitrilo
Bomba peristáltica
Aire
IV2
Desecho
Desecho
DNPH
SV
IV1
Muestra de agua
Sorbente
Figura 1
234
Diagrama del sistema de flujo continuo de SPE empleado en este Memoria para
llevar a cabo los procesos de derivatización/preconcentración in situ de
aldehídos en aguas.
Resultados y discusión
Las sucesivas etapas que se desarrollan en este sistema µ–SPE en las
investigaciones realizadas se indican a continuación.
1) Acondicionamiento de la minicolumna sorbente (25 mg, 1 cm longitud, 3
mm diámetro interno) con acetonitrilo y agua purificada en contracorriente
a un caudal de 0.5 mL min–1.
2) Carga del sorbente con el reactivo derivatizante mediante el paso de 2 mL
de disolución de reactivo derivatizante DNPH a 1 mL min–1.
3) Introducción de la muestra acidificada con ácido clorhídrico y en presencia
de SDS o β-ciclodextrina como “agentes micelares” según el tipo sorbente
utilizado.
4) Secado de la columna mediante una corriente de aire a 0.5 mL min–1 durante
1 min. Durante este tiempo se llena el bucle de la válvula de inyección IV 2
con 100 µL de acetonitrilo.
5) Elución de las hidrazonas con acetonitrilo y posterior recolección del
extracto en un vial Eppendorf.
6) Inyección de los extractos recogidos de manera inmediata en el sistema de
separación/detección utilizado en su caso (LC–DAD, LC–MS o MEKC–
DAD), o almacenamiento en frío (a 4 °C hasta 2 semanas) para su posterior
análisis.
La finalidad primordial de las metodologías desarrolladas en esta Memoria
es su aplicación a muestras de agua con objeto de evaluar la presencia de aldehídos
como DBPs en las mismas. Debido a la coexistencia natural de aldehídos alifáticos
con aromáticos en las muestras de agua estudiadas, la optimización de las diferentes
metodologías ha previsto la presencia de los principales aldehídos alifáticos de
cadena corta (formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, butiraldehído y
235
Capítulo 6
valeraldehído) en las mismas, aunque optimizando las distintas variables de cara a
obtener la máxima sensibilidad en el proceso de µ–SPE para la determinación de los
aldehídos aromáticos.
Inicialmente, el sistema µ–SPE empleado en esta Tesis Doctoral utiliza una
minicolumna de LiChrolut EN. Este sorbente es un polímero nanoporoso con
centros de reacción alifáticos y aromáticos, el cual ha proporcionado buenos
resultados en la preconcentración/derivatización de aldehídos alifáticos con DNPH
en anteriores investigaciones realizadas por nuestro Grupo de Investigación [7]. Sin
embargo, las variables que afectan al sistema µ–SPE (LiChrolut EN) han sido re–
optimizadas dada la naturaleza de los analitos abordados en la presente Tesis
Doctoral, aldehídos aromáticos.
El pH de la muestra es una variable fundamental, ya que influye de manera
directa en el proceso de derivatización de los aldehídos con DNPH. Los estudios de
optimización realizados muestran que, para los aldehídos aromáticos estudiados
(benzaldehído, 3-metil y 2,5-dimetilbenzaldehído conforme al Método EPA 8315A),
la derivatización se obtiene la máxima eficiencia en el proceso de derivatización
cuando la acidez se ajusta a una concentración 1 mol L–1 de ácido clorhídrico, como
se aprecia en la Figura 2.
Estas condiciones son mucho más ácidas que las utilizadas para la
derivatización de aldehídos alifáticos, debido a la distribución de carga en el grupo
carbonilo de ambos tipos de aldehídos. En efecto, el enlace C=O en los aldehídos
aromáticos presenta un mayor momento dipolar y por ello se requiere mayor acidez
para favorecer la protonación del oxígeno carbonílico de manera previa al ataque
nucleofílico del grupo amino terminal de la DNPH. Es por ello que un rasgo
diferenciador de las metodologías propuestas en la presente Memoria radica en las
236
Resultados y discusión
condiciones de alta acidez de las muestras de agua, lo que contrasta con el medio
moderadamente ácido recomendado por el Método EPA 8315A, donde la muestra
se acidifica a un pH 3 aproximadamente utilizando una disolución de citrato de
sodio.
Figura 2
Efecto de la acidez de la muestra en el proceso de derivatización de aldehídos
aromáticos. Benzaldehído (○), 3-metilbenzaldehído (Δ) y 2,5dimetilbenzaldehído (●). Volumen de muestra: 10 mL. Las barras de error
corresponden a las desviaciones estándar para tres medidas.
Tras optimizar el método de µ–SPE para realizar la preconcentración y
derivatización in situ de los aldehídos en la minicolumna sorbente de LiChrolut EN
impregnada con DNPH y en la búsqueda de estrategias enfocadas a obtener mayor
sensibilidad se han ensayado diversas alternativas.
Inicialmente, y dada la presencia en los aldehídos aromáticos de un anillo
bencénico a diferencia de los alifáticos, se ha ensayado un procedimiento
alternativo a la hora de desarrollar la etapa de µ–SPE. Este consiste en llevar a
237
Capítulo 6
cabo en primer lugar la retención en medio ácido de los aldehídos aromáticos en la
minicolumna sorbente de LiChrolut EN (el anillo aromático hace que estos analitos
presenten menor polaridad y volatilidad que los aldehídos alifáticos) y
posteriormente llevar a cabo el proceso de derivatización in situ con DNPH. Cabe
destacar que aunque esta estrategia es de gran interés ya que permitiría llevar a cabo
una especiaciación entre aldehídos aromáticos y alifáticos, no es viable en la
práctica. En efecto, se observa una disminución de la señal analítica (del orden del
30–35%) debido a una pérdida de eficiencia en el proceso de derivatización con
DNPH, a pesar de hacer uso bajas velocidades de flujo para la disolución del
reactivo derivatizante.
Otra alternativa utilizada para incrementar la eficiencia en el proceso de
derivatización in situ de los aldehídos con DNPH, se basa en la modificación de la
composición de la muestra de agua mediante la adición de diferentes agentes
micelares. Estos “agentes micelares” producen distintos resultados dependiendo de
su naturaleza y su concentración así como de las propiedades químicas del aldehído
que se determina.
Se han ensayado tres tipos de surfactantes tras optimizar las variables del
sistema de µ–SPE: no iónico (Triton X–100 y Brij–35), catiónico (CTAB) y
aniónico (SDS). Los resultados obtenidos desestimaron la utilización de los
surfactantes no iónicos y catiónicos. Los primeros apenas modifican la eficiencia de
la reacción de derivatización (no se aprecian cambios significativos en los picos de
los DNPH–derivados) y los catiónicos originan interferencias en la etapa
cromatográfica final que impiden la determinación de algunos aldehídos aromáticos.
Sin embargo, al añadir SDS a la muestra se observa que este surfactante influye
favorablemente en la reacción de derivatización, aunque a concentraciones
superiores a su concentración micelar crítica. Como se muestra en la Figura 3, la
presencia en la muestra de micelas de SDS a una concentración de 50 mmol L–1,
238
Resultados y discusión
origina un aumento en la sensibilidad, en torno al 30–40%, en la determinación de
benzaldehído y sus derivados metilados. Este efecto se puede adscribir a una
interacción entre el anillo aromático de los analitos y el núcleo de la micela de SDS,
que favorece la protonación del oxígeno del grupo carbonilo y aumenta de esta
manera la eficiencia de la reacción de derivatización.
Figura 3
Efecto de la concentración de SDS sobre la derivatización de los aldehídos
aromáticos benzaldehído (○), 3-metilbenzaldehído (Δ)
y 2,5dimetilbenzaldehído (●). Volumen de muestra: 10 mL. Las barras de error
corresponden a las desviaciones estándar para tres medidas.
En este punto, y con objeto de extender el alcance de la metodología
propuesta para la determinación de aldehídos aromáticos de bajo peso molecular en
muestras de agua, se ha ampliado el número de analitos objeto de estudio con la
inclusión de 2-etilbenzaldehído y los derivados hidroxilados 3-hidroxibenzaldehído
y 2,5-dihidroxibenzaldehído. Como se ha indicado anteriormente, hasta la fecha
estos aldehídos aromáticos han sido escasamente estudiados debido a que su
239
Capítulo 6
presencia
en
muestras de
agua
no está
muy
documentada.
El 2,5-
dihidroxibenzaldehído ha sido identificado como DBP tras someter al agua a
procesos de ozonización, encontrándose también el 3-hidroxibenzaldehído y el 2etilbenzaldehido en aguas tratadas con cloro y con dióxido de cloro. Debido al
incremento de analitos objeto de estudio, las variables del sistema µ–SPE fueron re–
optimizadas: 1) la cantidad de DNPH que impregna la minicolumna de LiChrolut
EN se incrementa hasta 1 mg, y 2) el estudio de acidez mostró una máxima
eficiencia en el proceso de derivatización cuando ésta se ajusta a 1.25 mol L–1 en
ácido clorhídrico. Bajo estas nuevas condiciones experimentales, se comprobó que
no existían cambios significativos en la señal analítica con volúmenes de muestras
de agua de hasta 50 mL, por lo que se seleccionó finalmente este volumen de
muestra.
En estas condiciones se abordó de nuevo el estudio de la influencia de
“agentes micelares” sobre la eficiencia en el proceso de derivatización de los
aldehídos aromáticos bajo estudio. Se obtuvieron diversos resultados. En presencia
de SDS se origina una reducción de la sensibilidad del método de hasta un 65% para
los aldehídos aromáticos hidroxilados. Esta acusada bajada en la señal analítica se
puede asignar a las fuertes interacciones que se establecen entre los grupos hidroxilo
de estos aldehídos, protonados por las condiciones de trabajo fuertemente ácidas, y
la carga negativa de las micelas de SDS, lo cual dificulta la reacción de
derivatización. Se han ensayado el efecto de otros “agentes micelares” como por
ejemplo las ciclodextrinas, aunque a bajas concentraciones (2 mmol L–1) ya que su
concentración en la muestra de agua queda limitada por la baja solubilidad de estos
oligosacáridos cíclicos. De entre ellas, la β-ciclodextrina (β-CD) permite mejorar la
eficiencia del proceso de derivatización de todos los analitos con DNPH, superando
incluso el efecto del sistema micelar de SDS en el caso del benzaldehído y sus
alquilderivados como se muestra en la Figura 4. Por otro lado, y pese a que la
240
Resultados y discusión
mejora no es tan acusada para aldehídos hidroxilados, el área de los picos
correspondiente tanto al 2,5-dihidroxi- y 3-hidroxibenzaldehído se incrementa en
presencia de β-CD.
Figura 4 Efecto de micelas de SDS y β-CD sobre la derivatización y preconcentración de
aldehídos aromáticos de bajo peso molecular mediante –SPE.
El volumen de ruptura es un parámetro crucial en los métodos SPE, debido
a que está directamente relacionado con el factor de enriquecimiento (relación Vfase
acuosa
/Vfase orgánica) y, por lo tanto, con la sensibilidad del método. La optimización del
volumen de ruptura para el sistema µ–SPE propuesto consiste simplemente en
optimizar el volumen de muestra máximo que puede pasar a través de la
minicolumna sorbente sin que se origine una pérdida apreciable de eficiencia en el
proceso de derivatización de los aldehídos. En las condiciones experimentales
indicadas (muestras de agua con una acidez 1.25 mol L–1 de ácido clorhídrico) el
241
Capítulo 6
volumen de ruptura es de 50 mL, lo que supone un factor de preconcentración de
500.
Hasta el momento las alternativas ensayadas para mejorar la eficiencia del
proceso de derivatización/preconcentración de aldehídos aromáticos de bajo peso
molecular mediante µ–SPE se han enfocado a la adición de agentes micelares a la
muestra de agua a analizar con objeto de modificar su composición química. Se han
obtenido resultados satisfactorios, aunque no una importante mejora en la
sensibilidad de los métodos LC–DAD desarrollados. En las investigaciones
incluidas en esta Memoria que hacen uso de LC–MS, además de emplear una
técnica de detección cromatográfica con mayores prestaciones analíticas que la
DAD en términos de detección cuali y cuantitativa, se han ensayado distintos
materiales sorbentes en el sistema de µ–SPE con objeto de evaluar su influencia
sobre la eficiencia de la etapa de preconcentración/derivatización in situ de los
aldehídos aromáticos. De esta manera se pretende conseguir una configuración del
sistema µ–SPE que proporcione mayor sensibilidad en el método analítico
propuesto.
Además del LiChrolut EN, utilizado en todas las experiencias anteriores, se
han ensayado dos sorbentes que se pueden denominar “clásicos”, como son RP–
C18 y Dowex 50WX8 y otro de reciente comercialización como es el TelosTM
ENV. El RP–C18 es una sílice con grupos octadecilo utilizada en formato de
cartuchos comerciales en la mayoría de las aplicaciones que realizan una extracción
en fase sólida de aldehídos, generalmente alifáticos, una vez formados los
correspondientes DNPH–derivados. Su uso, por lo general, adolece de problemas
de selectividad, debido a la retención de compuestos no deseados durante el
proceso de extracción. La resina de intercambio catiónico Dowex 50WX8 se ha
incluido en el estudio dado que existen antecedentes bibliográficos sobre su empleo
en sistemas de SPE en formato de cartuchos para la derivatización y extracción de
242
Resultados y discusión
benzaldehído y de los principales aldehídos alifáticos de cadena corta [8].
Finalmente, el TelosTM ENV es un copolímero de elevada superficie específica,
indicado especialmente para la retención de compuestos polares en muestras
acuosas, cuyo empleo con fines analíticos no se ha descrito en la bibliografía.
El proceso analítico empleado para la preconcentración/derivatización de
aldehídos aromáticos mediante µ–SPE implica inicialmente la retención del reactivo
derivatizante DNPH en la minicolumna, la posterior adsorción de los DNPH–
derivados de los aldehídos presentes en la muestra y finalmente la elución de los
mismos. En este sentido, el primer aspecto que se ha considerado en este estudio es
evaluar el grado de retención de DNPH que se consigue con cada sorbente. En los
resultados mostrados en la Figura 5 se aprecian dos comportamientos bien
diferenciados.
Por un lado los denominados sorbentes “clásicos” (RP–C18 y Dowex
50WX8) retienen al reactivo derivatizante con una eficiencia cercana al 50%,
mientras que con LiChrolut EN y TelosTM ENV se obtienen valores elevados de
retención debido al carácter polimérico que poseen estos sorbentes que originan
distintos tipos de interacciones: (i) específicas con solutos polares como el DNPH;
(ii) entre los enlaces π del reactivo derivatizante y los anillos aromáticos del
sorbente; y (iii) hidrofílicas que se producen en las zonas polares de los mismos.
En el proceso de derivatización/preconcentración in situ la muestra se pasa
por la minicolumna de sorbente previamente impregnada de reactivo derivatizante
DNPH. Con objeto de obtener mayores rendimientos en la reacción de
derivatización, el grupo carbonilo del aldehído aromático ha de estar en su forma
protonada para favorecer de esta manera la adición nucleofílica y posterior
formación de la hidrazona correspondiente. Por ello, se ha re–optimizado la acidez
de la muestra de agua hasta valores de 2.5 mol L–1 en ácido clorhídrico. Los
resultados obtenidos se muestran en la Figura 6.
243
Capítulo 6
Figura 5
Efecto de los distintos materiales sorbentes sobre la eficiencia en el proceso de
de adsorción del DNPH (barra gris) y la derivatización/retención de
benzaldehído y derivados (barra negra). Las barras de error corresponden a las
desviaciones estándar para tres mediciones.
Figura 6
Efecto de la acidez de la muestra sobre la derivatización/preconcentración de 5
µg L–1 de benzaldehído empleando distintos materiales sorbentes impregnados
de DNPH. TelosTM ENV (○), LiChrolut EN (●) y RP–C18 (□). Volumen de
muestra 10 mL. Las barras de error corresponden a las desviaciones estándar
para tres medidas.
244
Resultados y discusión
Como se aprecia en esta figura, el sorbente TelosTM ENV es el que
proporciona una mayor señal analítica al preconcentrar y derivatizar los aldehídos a
altos valores de acidez, hasta 2.0 mol L–1 de ácido clorhídrico. Como es conocido, el
RP–C18 a estos niveles de acidez proporciona resultados irreproducibles y,
concretamente en este caso, inferiores a los obtenidos con los otros sorbentes.
Finalmente, en la Tabla 1 se muestra un estudio comparativo de los
parámetros de SPE optimizados para ambos sorbentes: LiChrolut EN y TelosTM
ENV. Se observa claramente que el sorbente TelosTM ENV presenta mejores
características analíticas: (i) la mayor retención del reactivo derivatizante y el poder
trabajar con muestras de agua con una mayor acidez favorece la eficiencia del
proceso de derivatización de los aldehídos; (ii) se incrementa la retención de los
DNPH–derivados ya que se aumenta el volumen de ruptura de 50 a 100 mL (factor
de preconcentración: 1000) y además se puede trabajar con mayores velocidades de
flujo de la muestra (de 1.0 a 2.5 mL min–1); y (iii) en ambos casos la elución de los
DNPH–derivados se consigue con 100 µL de acetonitrilo. Todas estas
características redundan en un aumento significativo de la sensibilidad cuando se
emplean minicolumnas de TelosTM ENV en el sistema de µ–SPE.
El estudio realizado concluye con la propuesta del sorbente TelosTM ENV
en el contexto de la derivatización/preconcentración de aldehídos con DNPH
mediante µ–SPE. Esta propuesta supera a otros métodos de microextracción
publicados para la determinación de compuestos carbonílicos en muestras de agua,
basados en sistemas DNPH–LC. Además de conseguirse límites de cuantificación
para los aldehídos aromáticos de bajo peso molecular de uno a tres órdenes de
magnitud inferiores a los obtenidos por las alternativas miniaturizadas recogidas en
la bibliografía [9–11], el uso de este sorbente permite el desarrollo de metodologías
que presentan una mayor simplicidad operativa y robustez. Finalmente, y debido a
estas excelentes características analíticas, se ha desestimado la adición de “agentes
245
Capítulo 6
micelares” a la muestra de agua ya que prácticamente no se ha observado un
incremento de sensibilidad reseñable, y en cambio se elimina una etapa en el
proceso de preparación de la muestra.
Tabla 1
Valores seleccionados para la derivatización/preconcentración de
benzaldehído y derivados, empleando DNPH mediante µ–SPE
con los sorbentes Telos ENV y LiChrolut EN.
Condiciones
Telos ENV
LiChrolut EN
Acidez de la muestra, mol L–1 HCl
2.0
1.25
Cantidad de DNPH, mg
1.0
1.0
Cantidad de sorbente, mg
25
25
Caudal de muestra, mL min–1
2.5
1.0
Volumen de ACN, µL
100
100
Volumen de ruptura de muestra, mL
100
50
3. Análisis cromatográfico de los DNPH–derivados
Se discuten seguidamente los aspectos más relevantes de las metodologías
propuestas
que
emplean
cromatografía
de
líquidos
para
la
separación/determinación de los DNPH–derivados, así como los resultados
obtenidos en las mismas. Como se ha indicado anteriormente, en este análisis
cromatográfico además de los analitos objeto de estudio en la presente Tesis
Doctoral (aldehídos aromáticos), se han incluido aldehídos alifáticos de bajo peso
molecular (desde formaldehído a valeraldehído) dada su posible presencia en las
aguas objeto de análisis.
246
Resultados y discusión
Las investigaciones descritas en el Capítulo 3 de esta Memoria emplean la
cromatografía de líquidos con detección mediante diodos en fila (LC–DAD) para
llevar a cabo la determinación de los derivados de aldehídos aromáticos de bajo
peso molecular en muestras de agua. A modo de resumen, el procedimiento
experimental es el siguiente: 50 mL de muestra de agua en medio ácido (clorhídrico
1.25 mol L–1) y en presencia de β–CD (2.0 mmol L–1) se pasan por un sistema µ–
SPE con una minicolumna de 25 mg de LiChrolut EN donde se lleva a cabo de
manera simultánea la preconcentración y la derivatización con DNPH de los
aldehídos, eluyendo las hidrazonas formadas con 100 µL de acetonitrilo. Los
DNPH–derivados se separan en una columna de C18 (250 × 4.6 mm, 5 µm) en
aproximadamente 18 min (ver Figura 7A) mediante un gradiente lineal de fase
móvil comprendido entre 60 y 80% de acetonitrilo–agua a una velocidad de flujo de
1.2 mL min–1. Como se aprecia en esta figura la separación es completa a línea de
base salvo para los derivados del 3-hidroxibenzaldehído y acetaldehído, aunque la
separación conseguida es suficiente para poder obtener resultados cuantitativos en
la determinación de ambos aldehídos.
Por otro lado los métodos propuestos en el Capítulo 4 hacen uso de la
cromatografía de líquidos con detección mediante espectrometría de masas (LC–
MS) para abordar la determinación de aldehídos de bajo peso molecular en las
muestras de aguas tratadas analizadas. Este sistema de detección es muy útil en el
análisis de muestras complejas y a diferencia de la detección por DAD ofrece mayor
selectividad y un aumento de la sensibilidad. Existen muy pocos antecedentes la
determinación de aldehídos aromáticos de bajo peso molecular mediante LC–MS, y
éstos se limitan a la determinación de benzaldehído y algunos de sus derivados en
muestras de agua que contienen aldehídos alifáticos.
247
Figura 7
Cromatograma representativo para los DNPH–derivados en condiciones optimizadas mediante: A) LC–DAD (aldehídos
a concentración 20 µg L–1) y B) LC–MS (aldehídos a concentración 1.0 µg L–1). Asignación de los picos: 1, 2,5dihidroxibenzaldehído; 2, formaldehído; 3, 3-hidroxibenzaldehido; 4, acetaldehído; 5, propionaldehído; 6, butiraldehído;
7, benzaldehído; 8, valeraldehído; 9, 3-metilbenzaldehído; 10, 2-etilbenzaldehído; y 11, 2,5-dimetilbenzaldehído. IS,
estándar interno.
Resultados y discusión
Frente a la detección mediante DAD es necesario señalar que no es posible
la cuantificación del DNPH–derivado del formaldehído debido al alto nivel de
incertidumbre que se produce en la señal MS del mismo [7,12]. En este caso, el
procedimiento experimental es como sigue: 100 mL de muestra de agua en medio
ácido (2.0 mol L–1 en ácido clorhídrico) se pasan por un sistema µ–SPE con una
minicolumna de 25 mg de TelosTM ENV donde se lleva a cabo la
preconcentración/derivatización con DNPH de los aldehídos, eluyendo las
hidrazonas formadas con 100 µL de acetonitrilo. Los DNPH–derivados de los
aldehídos aromáticos y alifáticos se separan en una columna de C18 (150 mm × 2.1
mm; 2.7 µm) en tan sólo 14 min (ver Figura 7B) mediante un gradiente lineal de
fase móvil entre ácido fórmico al 0.1% y acetonitrilo–metanol (75:25 v/v) a una
velocidad de flujo de 0.2 mL min–1. Como se muestra en esta figura la separación de
todos los derivados es completa a línea de base.
En la Tabla 2 se muestran los parámetros analíticos de interés de estos
métodos cromatográficos y en una columna adicional se comparan estos valores
con los proporcionados por el Método EPA 8315A. Destaca los excelentes
resultados obtenidos en términos de sensibilidad que proporciona la metodología
LC–DAD, con los límites de detección comprendidos entre 60 y 150 ng L–1,
mejorando en tres órdenes de magnitud los proporcionados por el Método EPA
8315A (7.8–110.2 µg L–1). Sin embargo, y como era presumible, las mejores
características analíticas en términos de sensibilidad se obtienen cuando se hace uso
de LC–MS para la separación/cuantificación de los DNPH–derivados: los límites
de detección se sitúan entre 14.8 y 26.1 ng L–1 dado el incremento del factor de
preconcentración que se alcanza cuando se utiliza TelosTM ENV como sorbente y
las mejores prestaciones de la detección MS versus DAD.
249
Tabla 2
Resultados analíticos proporcionados por las metodologías propuestas y el Método EPA 8315A.
µ–SPE (β-CD)/LC–DAD
EPA
8315A
µ–SPE/LC–MS
Aldehído
Intervalo
lineal
(µg L–1)
LOD
(ng L–1)
RSD (%)
Intervalo
lineal
(µg L–1)
LOD
(ng L–1)
RSD
(%)
LOD
(µg L–1)
Benzaldehído
0.2 – 100
60
3.6
0.05 – 2.50
19.9
5.7
-
3-metilbenzaldehído
0.2 – 100
60
7.2
0.10 – 2.50
23.9
6.4
-
2,5-dimetilbenzaldehído
0.3 – 150
100
7.5
0.10 – 2.50
25.0
6.8
-
2-etilbenzaldehído
0.4 – 150
120
7.6
0.10 – 2.50
26.0
7.0
-
3-hidroxibenzaldehído
0.4 – 150
120
5.0
0.05 – 2.50
14.8
6.5
-
2,5-dihidroxibenzaldehído
0.2 – 100
60
5.7
0.05 – 2.50
16.1
6.0
-
Formaldehído
0.3 – 150
100
13.6
-
-
-
23.2
Acetaldehído
0.2 – 100
60
10.4
0.05 – 2.50
20.1
6.0
110.2
Propionaldehído
0.3 – 100
100
11.2
0.10 – 2.50
24.1
7.2
8.4
Butiraldehído
0.5 – 100
150
11.6
0.10 – 2.50
26.1
7.1
7.8
Valeraldehído
0.5 – 100
150
11.8
0.10 – 2.50
24.0
7.4
13.4
Resultados y discusión
4. Análisis electroforético de los DNPH–derivados
A la hora de abordar el estudio bibliográfico sobre los métodos analíticos
propuestos para la determinación de aldehídos aromáticos de bajo peso molecular
en muestras de agua, destaca la ausencia de alternativas en el campo de la
electroforesis capilar. Este aspecto es aún más sorprendente si se consideran las
ventajas que presenta la electroforesis capilar sobre la cromatografía de líquidos,
técnica de separación más asentada.
Ante esta falta de metodologías electroforéticas, el método electroforético
(Capítulo 5) desarrollado para la determinación de aldehídos aromáticos en
presencia de alifáticos en muestras de agua pretende conseguir los siguientes
objetivos: (i) contribuir a la implantación de la electroforesis capilar de manera
efectiva en los laboratorios de análisis de aguas; (ii) minimizar el consumo de
disolvente orgánico, siguiendo los actuales enfoques de la Química Verde; y (iii)
aprovechar las posibilidades de la electroforesis capilar en relación con su reducido
consumo de muestra, su elevada rapidez de análisis y su mayor resolución frente a la
LC, lo cual puede ser muy útil a la hora de la separación de isómeros de DNPH–
derivados.
La derivatización de los aldehídos aromáticos (y alifáticos) sigue siendo
necesaria cuando se trabaja en electroforesis capilar, empleándose a tal efecto el
DNPH como agente derivatizante y el sistema de µ–SPE descrito anteriormente
para la preconcentración off line de los analitos. Debido al carácter neutro de las
hidrazonas formadas, éstas se separan haciendo uso de la modalidad de
cromatografía electrocinética micelar (MEKC) con micelas de surfactante que
actúan como pseudofase estacionaria (PSP).
Para la preparación del buffer electroforético se han ensayado micelas de
distinta naturaleza en la búsqueda de un medio micelar efectivo. Inicialmente se
251
Capítulo 6
evaluó las posibilidades de micelas aniónicas de SDS, ampliamente utilizadas en
las determinaciones mediante MEKC, y por tanto en algunos métodos donde se
describe su empleo en la determinación de aldehídos alifáticos [13]. Los resultados
han demostrado su efectividad para la separación efectiva de aldehídos alifáticos,
pero no en las mezclas de éstos con aldehídos aromáticos. Como se muestra en la
Figura 8A, se presenta un importante grado de solapamiento entre los DNPH–
derivados de benzaldehído y sus alquil derivados, lo que impide su determinación
cuantitativa. Con el empleo de surfactantes no iónicos, tales como Triton X–100,
Brij 35 y Tween 20 tampoco se ha logrado la separación efectiva de los DNPH–
derivados. En este caso prácticamente no se observa separación entre los mismo ya
que las hidrazonas migran en un único pico, lo cual se puede adscribir a la fuerte
interacción de estos derivados con las micelas no iónicas. Sin embargo, se han
obtenido resultados satisfactorios con el empleo de micelas catiónicas de CTAB, tal
como se muestra en la Figura 8B. En este caso se obtiene la resolución de todos
los DNPH–derivados a línea de base a excepción de la separación de los
correspondientes al 2-etil y 2,5-dimetilbenzaldehído, aunque la separación lograda
permite la determinación cuantitativa de ambos. Por otra parte, la gran resolución
que presenta las micelas de CTAB debido fundamentalmente a interacciones
hidrofóbicas entre los DNPH–derivados y las micelas permite la separación de
isómeros de algunos aldehídos, tal como se aprecia en la Figura 8B en el caso de
acetaldehído, propionaldehído y butiraldehído. La utilización de este surfactante
catiónico supone una interesante novedad en el campo de las separaciones
electroforéticas mediante MEKC, debido a su escaso empleo. La composición del
buffer de separación se ha completado con la presencia de buffer fosfato, estudiado
para lograr una resolución óptima (75 mmol L–1, pH 7.2) y la presencia de
acetonitrilo en un 30% en volumen actuando como modificador orgánico. Se
consigue de esta manera la separación de los DNPH–derivados en menos de 15 min
tal como se muestra en la Figura 8B.
252
Figure 8
Separación de los DNPH–derivados de aldehídos de bajo peso molecular mediante el empleo de diferentes
metodologías MEKC: A) MEKC–SDS, BGE: 50 mmol L–1 SDS, 20 mmol L–1 borato (pH 9.2) y 10% ACN; y B)
MEKC–CTAB, BGE: 50 mmol L–1 CTAB, 75 mmol L–1 fosfato (pH 7.2) and 30% ACN. Identificación de los picos:
1, formaldehído; 2, acetaldehído; 3, propionaldehído; 4, butiraldehído; 5, 3-hidroxibenzaldehído; 6, benzaldehído; 7, 3metilbenzaldehído; 8, 2-etilbenzaldehído; 9, 2,5-dimetilbenzaldehído; y *, exceso de DNPH. Los otros picos anteriores a
los picos de acetaldehído, propionaldehído y butiraldehído pueden ser asignados a los típicos isómeros E/Z de sus
correspondientes hidrazonas.
Capítulo 6
En la Tabla 3 se muestran las características analíticas del método
propuesto para la determinación de aldehídos aromáticos y alifáticos mediante
MEKC. A pesar de hacer uso de la detección por DAD, se obtienen límites de
detección al nivel de ng L–1 debido al empleo del sistema de µ–SPE para la
derivatización y preconcentración de los aldehídos con DNPH.
Tabla 3 Resultados analíticos obtenidos mediante el empleo de la
metodología µ–SPE (TelosTM ENV)/MEKC (CTAB)–DAD
Intervalo lineal
(µg L–1)
LOD
(ng L–1)
RSD (%)
Benzaldehído
1.0 – 250
275
6.1
3-metilbenzaldehído
2.0 – 500
525
7.2
2,5-dimetilbenzaldehído
2.5 – 500
775
7.9
2-etilbenzaldehído
2.5 – 500
675
7.8
3-hidroxibenzaldehído
1.0 – 250
300
6.4
Formaldehído
0.5 – 200
165
7.1
Acetaldehído
0.2 – 100
65
6.3
Propionaldehído
0.5 – 200
160
6.8
Butiraldehído
0.5 – 200
145
6.5
Aldehído
254
Resultados y discusión
5. Innovaciones aportadas por los métodos LC y MEKC
En este apartado se realiza un estudio crítico sobre las características
analíticas de los métodos desarrollados y las que presentan las alternativas existentes
en la bibliografía.
Se han desarrollado varias metodologías basadas en el empleo de la
cromatografía de líquidos con DAD y MS como sistemas de detección para la
determinación aldehídos aromáticos en aguas. Por un lado, los métodos LC–DAD
desarrollados suponen una alternativa rápida, simple y de bajo coste frente a los
métodos descritos en la bibliografía, con excelentes resultados en términos de
sensibilidad y automatización. En concreto, mediante el empleo del método µ–SPE
(β-CD)/LC–DAD se consigue la determinación de los aldehídos aromáticos y
alifáticos objetos de estudio en la presente Memoria con una mejora apreciable en la
sensibilidad debido al incremento en la eficiencia del proceso de derivatización con
DNPH, hasta en un 60%, gracias a la adición de β-CD a la muestra de agua. El
sistema µ–SPE de flujo continuo desarrollado para llevar a cabo la
derivatización/preconcentración in situ de los aldehídos en presencia de β-CD
permite la citada mejora de sensibilidad y una manipulación mínima de la muestra,
lo que repercute en su precisión. Es por ello que este método representa una
excelente alternativa al Método EPA 8315A (mediante LC–DAD) al proporcionar
límites de detección de, al menos, un orden de magnitud inferior, con un
tratamiento de la muestra mucho más simple. Por otro lado la sensibilidad alcanzada
es mayor que la obtenida por otras alternativas LC publicadas, excepto las que
emplean detección MS/MS.
En cuanto al método LC–MS desarrollado para la determinación de
aldehídos en muestras de agua, además de constituir una de las escasas alternativas
existente en la bibliografía para la determinación de estos compuestos carbonílicos
255
Capítulo 6
en muestras de agua, presenta las siguientes ventajas frente a las dos metodologías
propuestas más representativas en este campo. El método propuesto por Zwiener y
col. [12] presenta para los aldehídos estudiados en esta Memoria unos límites de
detección comprendidos entre 0.23 y 0.17 µg L–1, que son un orden de magnitud
superior a los obtenidos en el método aquí propuesto. Además, dicho método
requiere unos requisitos experimentales que implican diversas etapas en el proceso
de formación de DNPH–derivados: (i) derivatización previa de los aldehídos con
DNPH mediante la técnica de batch con tiempos de reacción que pueden alcanzar
las 12 a 24 h, (ii) extracción en fase sólida con cartuchos de 200 mg de C 18 de las
hidrazonas formadas con posterior reducción a sequedad y (iii) reconstitución del
eluido antes de su inyección en el cromatógrafo de líquidos. Tales operaciones
suponen una mayor manipulación y gasto de tiempo que contrasta enormemente
con la sencillez y simpleza del método LC–MS desarrollado que se propone en la
presente Memoria. La otra alternativa relevante para la determinación de aldehídos
mediante LC–MS se refiere a una contribución de nuestro Grupo de Investigación
[7]. Como se ha comentado en algunos apartados de esta Memoria, dicha
contribución hace uso de un sistema similar de µ–SPE con LiChrolut EN para la
derivatización sólo aldehídos alifáticos de bajo peso molecular y su determinación
mediante LC–MS/MS. Aunque la determinación de aldehídos alifáticos con el
método propuesto en esta Memoria presenta límites de detección similares, hay que
indicar que esta metodología se ha optimizado para aldehídos aromáticos. El
emplear una mayor acidez en la etapa de derivatización conlleva una menor
sensibilidad para los aldehídos alifáticos, aunque ésta se compensa con el
incremento del factor de preconcentración al utilizar TelosTM ENV en lugar de
LiChrolut EN. En resumen, el método µ–SPE (TelosTM ENV)/LC–MS propuesto
para determinación de aldehídos en muestras de agua es rápido, simple y con una
excelente precisión, permitiendo una determinación libre de interferencias con un
bajo consumo de disolvente orgánico. Los bajos límites de detección obtenidos
256
Resultados y discusión
posibilitan, por primera vez, la detección de derivados de benzaldehído que no han
sido determinados hasta la fecha en aguas sometidas a procesos de desinfección, tal
y como se comentará más adelante. Finalmente, y para concluir, se puede establecer
como la metodología µ–SPE/LC propuesta es una excelente alternativa a
desarrollar la etapa de derivatización en batch, empleada en la mayoría de los
métodos propuestos en la bibliografía. Esta alternativa es simple, de bajo coste y
permite trabajar con grandes volúmenes de muestra (hasta 100 mL), lo que
proporciona una alta sensibilidad y precisión.
También se han realizado interesantes aportaciones en la metodología
desarrollada mediante electroforesis capilar. Existen algunas publicaciones en la
bibliografía donde se realizan separaciones electroforéticas de DNPH–derivados de
aldehídos alifáticos (incluyendo el benzaldehído de manera singular) y sólo una
referencia que aborde la resolución de una mezcla de aldehídos alifáticos y
aromáticos [14]. En este último caso se emplea como PSP un sistema de gradiente
entre un buffer compuesto por 20 mmol L–1 borato, 50 mmol L–1 SDS y 20%
metanol a pH 8.9 y otro constituido por 20 mmol L–1 borato, 50 mmol L–1 SDS y
35% ACN para detectar aldehídos presentes en muestras de aire. Se puede concluir
indicando que no existe ninguna referencia que contemple la determinación de
aldehídos aromáticos en muestras de agua de forma conjunta.
El empleo del sistema de µ–SPE utilizado en las metodologías LC como
etapa previa a la determinación MEKC propuesta elimina el inconveniente de la
baja sensibilidad típicamente asociada a la CE–DAD, ocasionada por el bajo
volumen de muestra y por la menor longitud de paso óptico. En el método
propuesto se obtienen unos límites de detección del orden de ng L–1, inferiores a los
obtenidos en las alternativas CE–UV y similares a los que se consiguen con CE–
LIF, mejorando además la resolución al obviarse las interferencias originadas por las
impurezas del reactivo derivatizante utilizado en LIF. En el método propuesto el
257
Capítulo 6
exceso de DNPH no afectan a la separación de los DNPH–derivados. Además, se
aprovechan las ventajas derivadas del empleo del sorbente TelosTM ENV en la etapa
de µ–SPE antes mencionadas.
Además de las comentadas ventajas en el contexto de la sensibilidad la
metodología µ–SPE/MEKC (CTAB)–DAD desarrollada presenta además otras
importantes características, tales como (i) bajo volumen de muestra, (ii) consumo
mínimo de disolvente orgánico, y (iii) rapidez de la separación electroforética (tan
sólo 14 min para un grupo de 5 aldehídos aromáticos y 4 aldehídos aromáticos). La
alternativa electroforética propuesta en la presente Memoria destaca por su
versatilidad y por su carácter innovador en el ámbito de la determinación de
aldehídos aromáticos en muestras de agua mediante CE.
6. Análisis de muestras de agua
En los últimos años y debido al progresivo conocimiento del papel que
juegan para la salud humana los aldehídos de bajo peso molecular, se ha producido
un incremento en el estudio de métodos que determinan estos compuestos en
muestras de agua tratadas. Sin embargo, aún no existe una normativa que regule la
presencia de estos analitos en agua a pesar de los efectos potenciales que pueden
tener sobre la salud del consumidor.
El análisis de muestras de aguas sometidas a diferentes tratamientos permite
evaluar la utilidad de la metodología analítica desarrollada para así aportar
información sobre la presencia de aldehídos aromáticos (y/o alifáticos) de bajo peso
molecular en aguas sometidas a procesos de desinfección oxidativos, tales como
ozonización o cloración. Por ello es fundamental plantear el estudio del análisis de
258
Resultados y discusión
diversas muestras de agua sometidas a distintos tratamientos para conocer las
posibilidades de aplicación de los métodos propuestos una vez optimizados.
Agua de bebida tratada con ozono
Este agua de bebida, disponible comercialmente, ha sido embotellada tras
someterse a procesos de purificación adicionales como filtración, desinfección
ultravioleta, osmosis inversa y ozonización. Debido a que los aldehídos presentes en
el agua como DBPs proceden mayoritariamente de los tratamientos de desinfección
con ozono, la concentración de aldehídos de bajo peso molecular suele ser mayor
en estas muestras que las encontradas en las otras aguas de bebida. En la Tabla 4 se
muestran los resultados obtenidos mediante LC–MS y MEKC–DAD.
Tabla 4
Concentraciones de aldehídos de bajo peso molecular en muestras de agua de
bebida ozonizada según las metodologías LC–MS y MEKC–DAD propuestas.
Aldehído
Agua potable ozonizada
(µ–SPE/LC–MS)
Agua potable ozonizada
(µ–SPE/MECK–DAD)
Benzaldehído
0.76 ± 0.07
N. D.
3-metilbenzaldehído
N. D.
N. D.
2,5-dimetilbenzaldehído
N. D.
N. D.
3-hidroxibenzaldehído
N. D.
-
2,5-dihidroxibenzaldehído
N. D.
N.D.
2-etilbenzaldehído
N. D.
N.D.
Formaldehído
-
1.1 ± 0.1
Acetaldehído
4.8 ± 0.6
3.2 ± 0.3
Propionaldehído
1.8 ± 0.2
2.2 ± 0.2
Butiraldehído
3.2 ± 0.3
3.9 ± 0.4
Valeraldehído
2.1 ± 0.2
-
N. D., no detectado. Concentraciones en µg L–1 ± SD
259
Capítulo 6
Es destacable la presencia de benzaldehído, aunque a bajos niveles de
concentración (del orden de ng L–1) en este tipo de aguas. Esta cuantificación ha
sido posible gracias a la gran sensibilidad que presenta el método µ–SPE/LC–MS;
sin embargo, no es detectable por el método electroforético µ–SPE/MEKC–DAD.
Los niveles de concentración de aldehídos alifáticos proporcionados por ambos
métodos son similares, en el intervalo 1.1–4.8 µg L–1. Se ha de recordar la dificultad
de determinar cuantitativamente formaldehído mediante la metodología LC–MS.
En la Figura 9 se muestra el cromatograma correspondiente al análisis de la
muestra de agua tratada con ozono mediante el método µ–SPE/LC–MS.
Figura 9 Cromatograma obtenido en el análisis de 100 mL de agua de bebida ozonizada
mediante LC–MS. Asignación de los picos: 1, acetaldehído; 2, propionaldehído;
3, butiraldehído; 4, benzaldehído; y 5 valeraldehído.
260
Resultados y discusión
Agua de piscina
Se ha analizado agua de piscina haciendo uso de todas las metodologías
desarrolladas en esta Memoria, procedentes de piscinas cubiertas y otras al aire libre.
En términos generales se puede indicar que la información cuantitativa obtenida
tanto para aldehídos alifáticos como aromáticos de bajo peso molecular en este tipo
de muestras está en consonancia con el origen del agua de piscina analizada.
A diferencia de las aguas de bebida tratadas con ozono, es presumible que
los aldehídos aromáticos estén presentes en este tipo de aguas, ya que están
sometidas a procesos de desinfección con cloro (más intensos que con ozono) y
además poseen una mayor carga de materia orgánica. Por otra parte, es previsible
encontrar mayores niveles de aldehídos aromáticos (así como de alifáticos) en las
piscinas interiores teniendo en cuenta factores como su moderada volatilidad.
Los resultados encontrados en las diferentes muestras de agua de piscina se
muestran en la Tabla 5. Se pueden establecer las siguientes conclusiones:
(i) aunque se han analizado diferentes tipos de agua de piscinas en diferentes
periodos estacionales, se puede concluir que el nivel de concentración de aldehídos
presentes en las mismas es por lo general bastante homogéneo;
(ii) los aldehídos alifáticos están presentes en todos los tipos de muestra,
siendo el acetaldehído el que se encuentra generalmente a mayores niveles de
concentración, incluso a niveles de 116 µg L–1;
(iii) sólo las metodologías que emplean detección DAD permiten la
cuantificación de formaldehído en este tipo de muestras;
(iv) a excepción del benzaldehído, los demás aldehídos aromáticos se
presentan en menor medida en las muestras analizadas. Esto se puede asignar al
hecho de que estos aldehídos requieren la presencia de mayores cantidades de
materia orgánica y de desinfectante para su formación;
261
Tabla 5
Análisis de las muestras de agua de piscina mediante las distintas metodologías LC y CE propuestas.
LC–DAD
LC–MS
MEKC–DAD
Piscina
interior 1
Piscina
interior 2
Piscina
interior 3
Piscina
interior 1
Piscina
interior 2
Piscina
exterior 1
Piscina
exterior 2
Piscina
interior
Piscina
exterior
BA
2.1 ± 0.1
15.3 ± 0.7
6.1 ± 0.3
4.4 ± 0.6
4.7 ± 0.5
1.8 ± 0.2
2.2 ± 0.2
3.2 ± 0.3
2.6 ± 0.3
3-MBA
N. D.
N. D.
N. D.
0.17 ± 0.02 0.43 ± 0.04 N. D.
0.12 ± 0.02
N. D.
N. D.
2,5-DMBA
N.D.
N.D.
0.8 ± 0.1
0.15 ± 0.01 0.83 ± 0.08 N. D.
0.34 ± 0.03
N. D.
N. D.
3-HBA
N.D.
N.D.
N. D.
0.28 ± 0.03 0.47 ± 0.06 0.14 ± 0.02 0.23 ± 0.02
N. D.
N. D.
2,5-DHBA
N.D.
N.D.
N. D.
N.D
N. D.
N. D.
N. D.
-
-
2-EBA
N.D.
N.D.
N. D.
N. D.
0.23 ± 0.03
N. D.
N. D.
N. D.
N. D.
C1
8.4 ± 1.2
58.2 ± 7.8
21.0 ± 3.1
-
-
-
-
4.0 ± 0.5
1.2 ± 0.2
C2
60.2 ± 6.5
116 ± 13
46.7 ± 4.8
10.9 ± 0.9
12.4 ± 1.1
7.4 ± 0.8
9.1 ± 0.8
8.4 ± 0.8
5.8 ± 0.6
C3
N. D.
N. D.
N. D.
3.3 ± 0.3
1.2 ± 0.1
2.6 ± 0.3
0.9 ± 0.1
5.7 ± 0.7
3.4 ± 0.4
C4
6.7 ± 0.8
13.2 ± 1.5
41.3 ± 5.1
4.9 ± 0.5
3.4 ± 0.3
3.7 ± 0.3
1.8 ± 0.2
2.8 ± 0.3
1.3 ± 0.2
C5
N. D.
N. D.
1.6 ± 0.2
3.3 ± 0.4
1.5 ± 0.2
1.4 ± 0.2
0.65 ± 0.06
-
-
N. D., no detectado. Concentraciones en µg L–1 ± SD. BA: Benzaldehído; 3-MBA: 3-metilbenzaldehído; 2,5-DMBA: 2,5-dimetilbenzaldehído; 2EBA: 2-etilbenzadehído; 3-HBA: 3-hidroxibenzaldehído; 2,5-DHBA: 2,5-dihidroxibenzaldehído. C1: formaldehído; C2: acetaldehído; C3:
propionaldehído; C4: butiraldehído; C5: valeraldehído.
Resultados y discusión
(v) sólo en una muestra de agua de piscina de interior se han cuantificado los
aldehídos aromáticos estudiados a excepción del 2,5-dihidroxibenzaldehído; y
(vi) es remarcable el hecho de que algunos derivados del benzaldehído que
han sido cuantificados por la metodología LC–MS, como el 3-metilbenzaldehído y
el 2-etilbenlzadehído, no han sido detectados anteriormente en este tipo de agua por
las alternativas existentes en la bibliografía.
Como ejemplo, en la Figura 10 se observa el cromatograma de una muestra
de agua de piscina de interior tratada con cloro obtenido mediante LC–MS.
Figura 10
Cromatograma obtenido en el análisis de 100 mL de agua de piscina cubierta
sometida a cloración. Asignación de los picos: 1, acetaldehído; 2, 3hidroxibenzaldehído; 3, propionaldehído; 4, butiraldehído; 5, benzaldehído; 6,
valeraldehído; 7, 3-metilbenzaldehído; 8, 2-etilbenzaldehído; y 9, 2,5dimetilbenzaldehído.
263
Capítulo 6
7. Determinación de aldehídos en muestras de orina de
investigadores expuestos
El método desarrollado para la determinación de aldehídos de bajo peso
molecular en aguas mediante LC–MS se ha utilizado para evaluar la presencia de
aldehídos aromáticos y alifáticos en la orina de investigadores expuestos a estos
analitos (Capítulo 4) en el proceso de preparación de las disoluciones estándar de
trabajo (4 g L–1 en metanol).
Inicialmente se ha re–optimizado el sistema de µ–SPE (TelosTM ENV)/LC–
MS con objeto de evaluar el posible efecto matriz de la orina. Utilizando las
condiciones establecidas en dicha metodología, no se ha observado efecto matriz
cuando la orina se diluye 1:1 con ácido clorhídrico 4.0 mol L–1. Aunque se pueden
utilizar volúmenes de orina de hasta 50 mL se ha optado por emplear 12.5 mL
(volumen total de muestra tratada, 25 mL) dado que se obtiene una sensibilidad
adecuada para la completa definición de la curva cinética de excreción de los
aldehídos y además se reduce el tiempo de tratamiento de la muestra.
Para evaluar el efecto de la exposición de investigadores expuestos a estos
analitos y la excreción de los mismos mediante el análisis de muestras de orina, la
toma de muestra se ha realizado a diferentes tiempos: 0, 0.5, 1, 2, 4, 6 y 8 h tras
finalizar la exposición para los mismos, así como de otros tres investigadores que
trabajan en diferentes laboratorios y que no están sujetos a la exposición de los
aldehídos objeto de estudio. La muestra tomada a los 15 min se ha considerado
como la muestra a tiempo 0.
Tras el estudio realizado se observa que sólo los aldehídos alifáticos están
presentes en las muestras de orina a concentraciones superiores a su límite de
cuantificación, mientras que los aromáticos no se detectan debido probablemente a
que su baja volatilidad imposibilita en gran medida su inhalación. Al estudiar la
cinética de excreción de los aldehídos alifáticos se ha encontrado que estas
264
Resultados y discusión
responden a funciones de decaimiento exponencial del tipo y = y 0 + A×exp(–kt) tal
como se muestra en la Figura 11.
Figura 11
Curvas cinéticas correspondientes a la excreción de aldehídos alifáticos de bajo
peso molecular en la orina del Investigador 1 tras exposición. Acetaldehído
(), propionaldehído (), butiraldehído () y valeraldehído ().
En la Tabla 6 se muestran los parámetros cinéticos que definen el proceso
de excreción de cada uno de los aldehídos alifáticos para cada investigador. Se
observa que los valores son similares para ambos investigadores y que la tendencia
en los valores de los parámetros cinéticos está en consonancia con el carácter
hidrofóbico del analito. En todos los casos, al cabo de aproximadamente seis horas
se produce la completa excreción del aldehído en estudio, lo que supone un tiempo
de vida media en el organismo (tiempo necesario para que un compuesto presente
265
Capítulo 6
en un organismo, cuerpo o tejido disminuya su presencia a la mitad) de
aproximadamente 1 h.
Como se observa en la Figura 11, en el caso del acetaldehído la curva
cinética de excreción, al cabo incluso de las ocho horas, presenta un nivel de
concentración de este compuesto de aproximadamente 15 µg L–1 a diferencia de
otros aldehídos cuya concentración tiende a cero. Esta concentración es del orden
de la encontrada en la orina de los tres investigadores que trabajan en diferentes
laboratorios y que no están sujetos a la exposición de los aldehídos objeto de
estudio (personal no expuesto), así como a la de los investigadores expuestos
cuando estos han estado ausentes del laboratorio al menos una semana. En
consecuencia, se puede afirmar conforme con la bibliografía, que la presencia de
acetaldehído en la orina se debe a su formación endógena mediante procesos de
peroxidación lipídica.
En la Tabla 6 se muestran además los valores de concentración de aldehído
en orina, los cuales oscilan entre 24 y 216 µg L–1. Los resultados de esta
investigación permite concluir que: (i) la orina es una matriz adecuada para la
biomonitorización de estos compuestos en investigadores expuestos durante el
proceso de preparación de sus disoluciones estándar; (ii) la inhalación de aldehídos
aromáticos durante el proceso de preparación de disoluciones estándar no es
significativa ya que éstos no se han detectado en las muestras de orina analizadas; y
(iii) aunque los aldehídos más volátiles (alifáticos) se absorben fundamentalmente
mediante la inhalación y se detectan en la orina a concentraciones relativamente
altas, éstos se excretan con la orina en aproximadamente seis horas. En resumen, el
método propuesto supone una excelente alternativa de carácter no–invasivo para la
detección de aldehídos en la orina de personal expuesto a ambientes donde tales
analitos están presentes.
266
Tabla 6 Concentración, constante de velocidad (k) y tiempo de vida media (t1/2) para los aldehídos alifáticos encontrados en la orina de
los investigadores expuestos.
Aldehído
Investigador 1
Investigador 2
Concentración (µg L–1)
k (h–1)
t1/2 (h)
Concentración (µg L–1)
k (h–1)
t1/2 (h)
Acetaldehído
216 ± 16
0.54  0.06
1.3  0.2
198 ± 15
0.49  0.06
1.4  0.2
Propionaldehído
160 ± 15
0.63  0.06
1.1  0.1
135 ± 12
0.61  0.06
1.2  0.1
Butiraldehído
72 ± 7
0.75  0.08
0.92  0.08
52 ± 6
0.73  0.08
0.9  0.1
Valeraldehído
34 ± 4
0.76  0.07
0.91  0.09
24 ± 3
0.71  0.07
1.0  0.1
Capítulo 6
8. Estimación del grado de consecución de los objetivos
planteados
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en las investigaciones
contenidas en esta Tesis Doctoral, comentados y discutidos en la presente sección,
se considera que el grado de consecución de los objetivos planteados es bastante
elevado.
Aunque se ha estudiado y determinado los principales aldehídos aromáticos
y alifáticos que surgen como DBPs en aguas tratadas, sin embargo y pese a su
importancia, no se ha podido abordar la determinación de compuestos
dicarbonílicos como el glioxal y el metilglioxal. El empleo de DNPH como reactivo
derivatizante no permite esta determinación mediante el sistema de µ–SPE utilizado
en la presente Tesis Doctoral, dado que la cinética de la reacción de derivatización
es extremadamente lenta. Algunos autores, como Zwiener y col. [12] tras el
correspondiente estudio, concluyen que estos dialdehídos requieren un período de
hasta 24 h para llevar a cabo su derivatización completa con DNPH. Tampoco se
han obtenidos resultados de interés con el empleo de otros reactivos derivatizantes
debido, como en el caso anterior, a tiempos de reacción excesivamente lo que
excluye el empleo de sistema de derivatización in situ mediante µ–SPE desarrollado
en esta Memoria.
En cuanto a los objetivos conseguidos, se han desarrollado metodologías
analíticas de gran interés para la determinación de aldehídos aromáticos y alifáticos
de bajo peso molecular en aguas de distinta naturaleza empleando cromatografía de
líquidos y electroforesis capilar en conjunción con un innovador sistema de µ–SPE
para la derivatización y preconcentración simultánea de estos compuestos
carbonílicos. Estas metodologías superan a las alternativas existentes en términos de
sensibilidad, rapidez, bajo coste y simplicidad. Por último, la aplicación del método
268
Resultados y discusión
µ–SPE/LC–MS a la determinación de estos compuestos en muestras de orina ha
permitido concluir que esta matriz es adecuada para la biomonitorización de estos
compuestos en la orina de investigadores expuestos a los mismos.
269
Capítulo 6
9. Bibliografía
1. U.S. Environmental Protection Agency, Method 8315A. Determination of
carbonyl compounds by high performance liquid chromatography (HPLC).
Cincinnati, OH (1996).
2. U.S. Environmental Protection Agency, Method 556.1. Determination of carbonyl
compounds in drinking water by fast gas chromatography. Cincinnati, OH (1999).
3. S. D. Richardson, T. V. Caughran, T. Poiger, Y. Guo, F. G. Crumley. Application
of DNPH derivatization with LC/MS to the identification of polar carbonyl
disinfection byproducts in drinking water. Ozone: Science & Engineering 22 (2000)
653–675.
4. S. D. Richardson, A. D. Thruston Jr., T. V. Caughran, P. H. Chen, T. W. Collette,
K. M. Schenck, B. W. Lykins Jr., C. Rav–Acha, V. Glezer. Water. Identification of
new drinking water disinfection byproducts from ozone, chlorine dioxide,
chloramine, and chlorine. Water, Air & Soil Pollution 123 (2000) 95–102.
5. A. Dabrowska, J. Swietlik, J. Nawrocki. Formation of aldehydes upon ClO2
disinfection. Water Research 37 (2003) 1161–1169.
6. H. J. Zhang, J. F. Huang, H. Wang, Y. Q. Feng. Determination of low–aliphatic
aldehyde derivatizatives in human saliva using polymer monolith microextraction
coupled to high–performance liquid chromatography. Analytica Chimica Acta 565
(2006) 129–135.
7. C. E. Baños, M. Silva. Comparison of several sorbents for continuous in situ
derivatization and preconcentration of low–molecular mass aldehydes prior to
liquid chromatography–tandem mass spectrometric determination in water
samples. Journal of Chromatography A 1216 (2009) 6554–6559.
8. K. Takami, K. Kuwata, A. Sugimae, M. Nakamoto. Trace determination of
aldehydes in water by high–performance liquid chromatography. Analytical
Chemistry 57 (1985) 243–245.
270
Resultados y discusión
9. C. Basheer, S. Pavagadhi, H. Yu, R. Balasubramanian, H. K. Lee. Determination of
aldehydes in rainwater using micro–solid–phase extraction and high–performance
liquid chromatography. Journal of Chromatography A 1217 (2010) 6366–6372.
10. K. Takeda, S. Katoh, N. Nakatani, H. Sakugawa. Rapid and highly sensitive
determination of low–molecular–weight carbonyl compounds in drinking water
and natural water by preconcentration HPLC with 2,4-dinitrophenylhydrazine.
Analytical Sciences 22 (2006) 1509–1514.
11. A. K. K. V. Pillai, K. Gautam, A. Jain, K. K. Verma. Headspace in–drop
derivatization of carbonyl compounds for their analysis by high–performance
liquid chromatography–diode array detection. Analytica Chimica Acta 632 (2009)
208–215.
12. C. Zwiener, T. Glauner, F. H. Frimmel. Method optimization for the
determination of carbonyl compounds in disinfected water by DNPH
derivatization and LC–ESI–MS–MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry 372
(2002) 615–621.
13. S. Takeda, S. Wakida, M. Yamane, K. Higashi. Analysis of lower aliphatic aldehydes
in water by micellar electrokinetic chromatography with derivatization to 2,4dinitrophenylhydrazones. Electrophoresis 15 (1994) 1332–1334.
14. H. Sun, K. Y. Chan, Y. S. Fung. Determination of gaseous and particulate
carbonyls
in
air
by
gradient–elution
micellar
electrokinetic
capillary
chromatography. Electrophoresis 29 (2008) 3971–3979.
271
Capítulo 7
Conclusiones
Conclusiones
Las investigaciones realizadas durante esta Tesis Doctoral se han centrado
fundamentalmente en el desarrollo de diversas metodologías para la determinación
de aldehídos aromáticos de bajo peso molecular como subproductos de
desinfección en muestras de agua y orina (se han incluido en la mayoría de los casos
aldehídos alifáticos dada la naturaleza de las muestras analizadas), empleando para
ello métodos cromatográficos y electroforéticos acoplados a distintos sistemas de
detección.
A partir del trabajo realizado que se recoge en esta Memoria se pueden
extraer las siguientes conclusiones:
(1) Se han desarrollado diferentes metodologías rápidas y de bajo coste basadas
en la utilización de sistemas continuos de extracción en fase sólida
miniaturizados (µ–SPE) para llevar a cabo los procesos de derivatización y
preconcentración
in
situ
de
aldehídos
aromáticos
con
2,4-
dinitrofenilhidracina en muestras de agua, dada su presencia en las mismas
como subproductos de desinfección originados principalmente tras el
tratamiento con ozono.
(2) Los métodos analíticos propuestos son también aplicables a la detección y
cuantificación de los principales aldehídos alifáticos de bajo peso molecular
(de formaldehído a valeraldehído), cuya ocurrencia en las muestras de agua
analizadas es más común y a mayores niveles de concentración. Las
condiciones experimentales optimizadas con vistas a conseguir la máxima
sensibilidad para los aldehídos aromáticos proporcionan también buenos
275
Capítulo 7
resultados en términos de recuperación, sensibilidad y reproducibilidad para
los aldehídos alifáticos.
(3) Los sistemas µ–SPE desarrollados presentan interesantes ventajas frente al
Método Oficial EPA 8315A, entre las que destacan: (i) considerable ahorro
de tiempo al realizarse la preconcentración y derivatización de los analitos
de manera simultánea, (ii) formación y extracción de las hidrazonas a
temperatura ambiente frente a la modalidad batch establecida por la EPA que
requiere 60 min a 80 °C, (iii) mínimo consumo de disolvente orgánico, y (iv)
metodología simple y económica encuadrada en los principios de la Química
Verde.
(4) Se han abordado diversas estrategias en el proceso de optimización del
sistema de µ–SPE con objeto de incrementar la eficiencia de las etapas de
derivatización y preconcentración in situ de los aldehídos, las cuales han
proporcionado los siguientes resultados:
a. La adición de β-ciclodextrina a las muestras de agua mejora la
eficiencia de la reacción de derivatización de los aldehídos
aromáticos, incrementando la sensibilidad del método analítico
propuesto en un 50% aproximadamente.
b. De los distintos sorbentes estudiados, los mejores resultados en
términos de eficiencia en el proceso de derivatización y volumen de
ruptura fueron proporcionados por el TelosTM ENV frente a los
sorbentes convencionales ensayados como C18, amberlita Dowex
50WX8 y LiChrolut EN. Con el empleo de TelosTM ENV se pueden
tratar volúmenes elevados de muestras de agua (100 mL) lo que
permite alcanzar factores de preconcentración del orden de 1000.
276
Conclusiones
No se tiene referencia sobre el empleo de TelosTM ENV como
sorbente en sistemas de SPE utilizados en metodologías para la
determinación de aldehídos de bajo peso molecular.
(5) Con el empleo de la etapa previa de µ–SPE se han desarrollado métodos
cromatográficos para la determinación de estos aldehídos en muestras de
agua basados en el empleo de la cromatografía de líquidos (LC) con
detección mediante diodos en fila y espectrometría de masas. Aunque
evidentemente se consiguen menores límites de detección con el empleo de
la espectrometría de masas (del orden de ng L–1), el empleo de la detección
mediante DAD también permite alcanzar límites de detección a nivel de ng
L–1 aunque entre 5 y 10 veces superiores. Según se desprende de estos
resultados y considerando el problema analítico a resolver, métodos LC–
DAD pueden constituir una alternativa real a los de LC–MS.
(6) Se
ha
desarrollado
una
metodología
µ–SPE/CE–DAD
para
la
determinación de aldehídos aromáticos mediante electroforesis capilar en la
modalidad de cromatografía electrocinética micelar (MEKC) para la
separación de DNPH–derivados de benzaldehído y sus metilderivados, con
límites de detección a niveles de ng L–1. Se trata de la única alternativa
publicada hasta la fecha para la determinación de aldehídos aromáticos de
bajo peso molecular en muestras de agua.
(7) Los resultados obtenidos por las metodologías propuestas en esta Memoria
para la determinación de aldehídos aromáticos de bajo peso molecular son
muy favorables cuando se comparan con los proporcionados por diversas
alternativas propuestas en la bibliografía. Los límites de detección obtenidos
son inferiores con el valor añadido de una simplificación considerable dado
el empleo del sistema de µ–SPE desarrollado.
277
Capítulo 7
(8) Se ha demostrado la utilidad analítica de los métodos desarrollados mediante
su aplicación a la determinación de los aldehídos aromáticos de bajo peso
molecular (incluyendo alifáticos) como subproductos de desinfección o bien
como posibles contaminantes en diversos tipos de aguas. Se ha de destacar
que las investigaciones que se recogen en la Memoria han puesto de
manifiesto por vez primera la presencia de ciertos aldehídos en este tipo de
aguas, como por ejemplo 3-metil y 2-etilbenzaldehído.
(9) Finalmente, la metodología LC–MS se ha aplicado a la determinación de
estos aldehídos en muestras de orina de investigadores expuestos a los
mismos durante el proceso de preparación de sus disoluciones estándar. No
fue necesario en ningún caso un tratamiento significativo de la muestra de
orina, a excepción de un ajuste de pH y dilución. Los resultados obtenidos
en el estudio cinético de absorción y excreción de los aldehídos permite
concluir que la metodología desarrollada es una herramienta útil para la
biomonitorización de estos aldehídos en muestras de orina de
investigadores expuestos a estos compuestos.
278
ANEXO
PRODUCCIÓN CIENTÍFICA
Producción científica
Artículos científicos
1. Improved solid–phase extraction/micellar procedure for the derivatization/preconcentration of
benzaldehyde and methyl derivatives from water samples
J. M. Fernández–Molina, M. Silva
Talanta 85 (2011) 449–454
2. Simple and sensitive determination of low–molecular–mass aromatic aldehydes in swimming
pool water by LC–diode array detector
J. M. Fernández–Molina, M. Silva
Journal of Separation Science 34 (2011) 2732–2738
3. Trace determination of low–molecular–mass substituted benzaldehydes in treated water using
micro solid–phase extraction followed by liquid chromatography–mass spectrometric detection
J. M. Fernández–Molina, M. Silva
Journal of Chromatography A, 1300 (2013) 180–186
4. LC–MS analytical method for biomonitoring of aliphatic and aromatic low–molecular–mass
aldehydes in human urine
J. M. Fernández–Molina, M. Silva
Enviado a Chromatographia (Springer)
281
Anexo
5. Micro solid–phase derivatization analysis of low–molecular mass aldehydes in treated water by
micellar electrokinetic chromatography
J. M. Fernández–Molina, M. Silva
Electrophoresis 35 (2014) 819–826
Comunicaciones a congresos
Analysis of benzaldehyde and its alkyl and hydroxyl derivatives in water samples by liquid
chromatography
J. M. Fernández–Molina
XII Reunión del grupo regional andaluz de la Sociedad de Química Analítica
(GRASEQA). Córdoba, 2010. Comunicación en póster
Nuevas estrategias analíticas para el control de aldehídos como subproductos de desinfección de
aguas por cromatografía de líquidos y electroforesis capilar
J. M. Fernández–Molina
II Congreso científico de investigadores en formación de la Universidad de
Córdoba
Córdoba, 2012. Comunicación oral
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