Diagnóstico in Vitro: Sistema POC basados en Lab-On-a-Foil. Raúl Reyero

IV Conferencia Anual de las Plataformas
Tecnológicas de Investigación Biomédica
Madrid, 28 de febrero de 2011
Octubre 2010
Dr. Raúl REYERO ([email protected])
Lab-On-a-Chip para aplicaciones diagnósticas POC
IV Conferencia Anual de las Plataformas Tecnológicas de Investigación Biomédica - MADRID
Lab-On-a-Chip
para aplicaciones
diagnósticas “POC”
(Capacidades de IKERLAN-IK4)
28 Febrero 2011
1
ÍNDICE
1
 CONTEXTO DEL POC / POCT
2
 TECNOLOGÍAS MICROFLUÍDICAS PARA EL DIV POC
3
 SECUENCIA EN UN SISTEMA DE DIV POC
4
 SISTEMA DE DIV POC - LOC
5
 IKERLAN MICROSISTEMAS
6
 IKERLAN MONDRAGÓN
7
 INFORMACIÓN Y CONTACTO
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Diagnóstico In Vitro
1. CONTEXTO
 Las actividades de Diagnóstico “In Vitro” (DIV) se realizan
fundamentalmente en tres ámbitos:
- Laboratorios centralizados (ej. Hasta 50.000 test
diarios y 500 parámetros)
- Laboratorios distribuidos (ej. Regionales, locales,
hospitalarios, etc.)
- Sistemas DIV próximos al paciente (ej. POC, OTC, etc.)
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POC /POCT
1. CONTEXTO
 Definición: POC / POCT
(Point Of Care / Point Of Care Testing)
Análisis biológico de orina, sangre u otros fluidos corporales accesibles
por procedimientos sencillos y realizado en la proximidad del paciente
bajo la responsabilidad de facultativos y profesionales.
 Definición: OTC (Over The Counter)
Análisis biológico de venta libre y disponible sin prescripción médica.
 Aplicaciones de los POC / POCT
-
Test de embarazo
Marcadores cardíacos
Coagulación
Cáncer colorectal
Monitorización de glucosa
Gases y electrolitos
Etc.
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POC /POCT distribuido
1. CONTEXTO
Ubicación de los sistemas POC
 Los sistemas POC acercan la analítica al
paciente allá donde éste los necesite:
- Unidades
de emergencia, UVIs,
localizaciones remotas, hospital, etc.
 Los sistema POC se integran en la estructura
del proceso asistencial a través de los LIS.
 Los sistemas POC responden a los futuros
requisitos de la medicina personalizada y la
medicina distribuida
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El DIV y los sistemas POC
1. CONTEXTO
Sistema de DIV cuantitativo
Sistema de DIV cualitativo POC
Hay una gran brecha entre los
precisos sistemas de análisis
clínicos y los dispositivos
portátiles y rápidos
 La solución viene de la mano de los
sistemas POC
cuantitativa.
con
capacidad
Sistemas de DIV POC cuantitativos
 Estos modernos sistemas de DIV
POC hacen uso de las tecnologías:
-
Microelectrónica
Microfluídica
Biosensores
Marcadores
Etc
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El DIV, los sistemas POC y los LOC
1. CONTEXTO
El requisito clave de las empresas de
DIAGNÓSTICO
 Realizar diagnósticos mejores, más
rápidos con menores volúmenes de
muestra, pero altamente reproducibles, sensibles y fiables.
Los MICROSISTEMAS pueden aportar
soluciones a todos los requisitos
 Integrando todas las funciones de los
sistemas de análisis cuantitativo de un
laboratorio en un componente :
Lab-On-a-Chip ó “LOC”
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2. TECNOLOGÍAS MICROFLUIDICAS PARA EL DIV POC
Tipo de Test
Preparación de
la muestra
Detección
Óptica
Análisis químico e
Inmunoensayo
Reactivos químicos y
marcadores
Electroquímica
Otros
Tecnologías Microfluídicas
para sistemas de DIV POC
Citometría
Sin preparación
Óptica
Óptica
Análisis químico e
Inmunoensayo
Electroquímica
Pruebas ADN / ARN
Preparación de la muestra sin amplificación
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Magnética y biosensores
electroquímicos
3. SECUENCIA EN UN SISTEMA DE DIV POC
 Descripción de los pasos para realizar un análisis POC completo.
 Los pasos pueden reducirse en función de la aplicación o la tecnología
utilizada.
Recogida de
la Muestra:
Inserción de
la muestra:
- Sólidos
- Torunda
- Solución acuosa
- Sangre
- Etc.
- Interface
Micro-Macro
- Conectores
- Etc.
Preparación
de la
muestra:
Amplificación:
- Mezcla de
reactivos
-Purificación y
filtración
-Concentración
- Lisis
- PCR
- qPCR
- RPA
- Etc.
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Detección:
-Óptica
- Fluorescencia
- Electroquímica
- Etc.
4. SISTEMA DE DIV POC - LOC
 IKERLAN es un Centro de Investigación Tecnológico que ha
desarrollado, entre otras, una plataforma para aplicaciones de
Diagnóstico In Vitro basada en un micro-sistema (Lab-On-a-Chip)
integrado y flexible basado en la tecnología PCR.
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Micro PCR
4. SISTEMA DE DIV POC - LOC
 La técnica de PCR permite el diagnóstico mediante la
detección de secuencias genéticas
La aplicación se hace hoy en día en el laboratorio por
personal especializado
 La MICRO-PCR es el resultado de la combinación de
desarrollos microfluídicos, nanobiotecnología y biología
molecular
PCR
La aplicación se puede hacer en “campo” por personal
especializado o no especializado, dependiendo de la
aplicación a la que vaya dirigida
Micro PCR
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Proceso integrado de la Micro PCR
Después de la recogida de la muestra y su inyección en el dispositivo
Procesos de diagnóstico integrados Micro PCR
4. SISTEMA DE DIV POC – LOC
Preparación de la Muestra
Purificación , Concentración, Lisis, etc.
Captura de la Diana
Reconocimiento de Biomoléculas con alta afinidad y especificidad
Generación de señal y amplificación
Detección de la señal
Procesado de los datos
Interpretación / Aplicación
SISTEMA INTEGRADO de DIAGNÓSTICO MOLECULAR
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Características y ventajas
4. SISTEMA DE DIV POC – LOC
 Diseño
de un micro-sistema
diagnóstico “Lab on a Chip”
de
 Concentración y aislamiento
 Identificación de secuencias especificas
de oligonucleótidos (ADN-ARN)
 Técnica de PCR en tiempo real
 El proceso en una única cámara
 Menor cantidad de muestra
 Simplificación de la preparativa
de la muestra.
 Menor cantidad de reactivos
 Reducción del tiempo total del
análisis (e.j. 24min vs 48 hr)
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El dispositivo LOC
4. SISTEMA DE DIV POC – LOC






Chip de polímero desechable de bajo costo
Preparación de la muestra
Dos opciones de lisis
Concentración de la muestra en el chip
Cámara PCR de 2.6 µL PCR que integra el sistema de calentamiento y sensor de temperatura
Detección óptica a través de un sistema de lectura externo
Heaters
T sensor
Outlet
Spring loaded
contact
Heater
contacts
Reaction
chamber
Heater
contacts
Inlet
O-rings
Sensor contacts
Disposable chip
Capsule
Optical/Thermal Reader
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Opciones de lisis y resultados
4. SISTEMA DE DIV POC – LOC
Lisis térmica On Chip
Lisis química
Pyrex
N
S
PCR
reagents
Pyrex
N
S
PCR
reagents
PCR mixture
loading
S
N
S
N
Bacteria
Bacteria or virus
Lysis
Magnetic bead
PCR mixture
loading
Pyrex
Chamber closed
Magnetic bead
Lysis buffer
qPCR
Pyrex
Sensibilidad del test: 20 CFU
Validación con 80 muestras reales
Tiempo total / Analisis : 24 min vs 48 hr
Preparación de la muestra: 2 min
Aislamiento ADN: 2 min
Resultado final qPCR: 20 min
Coste del análisis 2€ vs 15€
EN ISO 1614:2003 standard
 El sistema cumple con los requerimientos de detección
de la Salmonella spp.
hospitales y granjas
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y Campylobacter spp.
en
Validación de datos - Bacterias
4. SISTEMA DE DIV POC – LOC
 Muestras suministradas por una
granja danesa y un hospital español
 81 muestras reales testeadas
 Concentración de la muestra,
purificación, PCR y detección en un
único chip
fgrams of DNA in 24 minutes (sample prep and qPCR)
End point PCR product from reference vs Salmonella spp.
End point PCR product from reference vs Campylobacter
microdevice
microdevice
spp.
Relative accuracy
95.6 %
Relative accuracy
95.8 %
Relative sensitivity
95.6 %
Relative sensitivity
94.7 %
Relative specificity
100 %
Relative specificity
100 %
D. Verdoy et al. Proceeding of µTAS 09, Jeju, Korea 2009
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D. Bang et al. , µTAS 09, Jeju, Korea 2009
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Validación de datos - Virus
4. SISTEMA DE DIV POC – LOC
 Cultivos virales cuantificados y muestras nasofaringeas de pacientes preparadas y suministradas por
el Hospital Donostia
 Los valores Ct se compararon con los obtenidos por el departamento de Microbiología del Hospital
Donostia
 Los resultados confirmaron las prestaciones del protocolo de la extracción y captura del ARN en un
chip
 Este análisis no es una prevalidación con docenas de muestras. En este caso se muestran los
resultados obtenidos con duplicados y repeticiones realizadas 4 veces
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Situación actual
4. SISTEMA DE DIV POC – LOC
 IKERLAN-IK4 dispone de una plataforma prototipo que incorpora la
“preparación de la muestra”, procesos “PCR” y “válvulas integradas” para el
diagnóstico basado en ADN.
Verificada para Salmonenella spp. y Campilobacter spp. con 80 ensayos reales.
 IKERLAN-IK4 dispone de la tecnología para desarrollar sistemas de
multidetección (ej. Hasta 6 biomarcadores). Orientada al diagnóstico de
enfermedades infecciosas.
 IKERLAN-IK4 cuenta con la protección de la IP de las tecnologías básicas.
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Infraestructura y personal
5. IKERLAN MICROSISTEMAS
 IKERLAN
MICROSISTEMAS: Nuevo edificio de
laboratorios de I+D+i instalado en el POLO GARAIA de
Mondragón. Inaugurado en Noviembre de 2009.
 Laboratorios con una superficie de 2.754 m2.
 Sala blanca de 300 m2.
 Equipos de fotolitografía
 Equipos de procesos químicos
 Zonas de caracterización y tests
 Zonas de integración de chips y dispositivos
(Prototipos y pre-industrialización)
 Herramientas y equipos de diseño y simulación
 Investigadores y personal auxiliar.
 16 doctores e ingenieros
 6 doctorandos
 1 técnicos de laboratorio
 2 técnicos de servicios
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Capacidades tecnológicas
5. IKERLAN MICROSISTEMAS
 Microfluídica.
 Litografía SU8
 Fabricación de dispositivos con polímeros COC
 Fabricación de dispositivos con sustratos rígidos:
Silicio, Pyrex y PMMA
 Fabricación de dispositivos sin sustrato
 Integración de “Aveguides” y electrodos
 Biodetección
 Microóptica (ej. Fluorescencia, OLED, etc.)
 Magnética
 Electroquímica (ej. Amperimétrica)
 Biosensores.
 LOC (Lab-on-a-Chip)
 LOF (Lab-on-a-Foil)
 Bandas de detección
 Integración mecánica, electrónica, comunicaciones y
microelectrónica
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Soluciones Sanitarias
5. IKERLAN MICROSISTEMAS
 Ámbitos
 Micro sondas – microdetección - microdosificación
 Diagnóstico molecular (ej. ADN, proteínas, etc.)
 Inmunoensayos
 Patologías de interés
 Enfermedades infecciosas
 Enfermedades metabólicas
 Cáncer
 Aplicaciones
 Electroforesis para manipulación
de partículas y células




Control de fluidos
Biodetección – Multidetección
microPCR: qPCR, RT PCR,
Dispositivos de diagnóstico POC
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Capacidades de transferencia
5. IKERLAN MICROSISTEMAS
 Chips
 Diseño personalizado
 Fabricación de dispositivos con polímeros SU8 o
COC
 Fabricación de prototipos y preseries
 Dispositivos
 Desarrollo de dispositivos para evaluar procesos
y sistemas microfluídicos
 Desarrollo de biodetectores
 Desarrollo de dispositivos
de
detección
personalizados
 Desarrollo de sistemas de diagnóstico POC
 Fabricación de prototipos y preseries
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6. IKERLAN MONDRAGÓN
 Personal investigador
 Más de 150 doctores e Ingenieros
 50 técnicos de laboratorio y servicios
 50 doctorandos y becarios
 Áreas de conocimiento
 Ingeniería Mecánica
 Diseño mecánico
 Automática y Electrónica de Potencia
 Electrónica
 Comunicaciones
 Sensores
 Tecnologías del software y de la información
 Tecnologías de diseño y producción
 Innovación estratégica
 Laboratorios
 Ensayos electromágnéticos y acústicos
 Ensayos térmicos
 Etc.
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7. INFORMACIÓN Y CONTACTO
IKERLAN-IK4
CENTRO DE INVESTIGACIONES TECNOLÓGICAS
TECHNOLOGICAL RESEARCH CENTRE
Pº J.M. Arizmendiarrieta, 2
E-20500 Arrasate – Mondragón
(Gipuzkoa) - SPAIN
Dr. Raúl REYERO
e-mail: [email protected]
Tel.: +34 943 71 24 00
Fax: +34 943 79 69 44
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