Cultivo de Anaerobios

Microbiología General
Facultad de Ciencias Exactas
ANEXO: AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE BACTERIAS
ANAEROBIAS
Funciones del oxígeno en la nutrición
Como elemento constituyente del agua y componentes orgánicos, el oxígeno es un
componente universal de las células y se proporciona en grandes cantidades en el
agua.
Sin embargo, muchos organismos requieren además oxígeno molecular.
Se trata de organismos que dependen de la respiración aeróbica para cubrir sus
necesidades energéticas y en los que el oxígeno molecular funciona como agente
oxidante terminal. Tales microorganismos se denominan aerobios obligados.
En el otro extremo fisiológico están aquellos microorganismos que obtienen su energía
mediante reacciones que no implican la utilización de oxígeno molecular y para los
cuales esta forma química del elemento no actúa como nutriente. Para muchos de estos
grupos fisiológicos el oxígeno molecular actúa como tóxico celular o como inhibidor del
crecimiento. Tales microorganismos son anaerobios obligados.
Han sido usados varios términos, entre ellos aerobio obligado, anaerobio obligado,
anaerobio aerotolerante, anaerobio facultativo y microaerófilo con el fin de subdividir las
bacterias en base a su relación con el oxígeno.
Estos términos reflejan un espectro continuo de bacterias que no pueden tolerar el
oxígeno hasta aquellas que lo necesitan para su crecimiento.
Los microorganismos anaerobios pueden ser clasificados en dos grupos principales:
l- Anaerobios obligados
ll-Anaerobios aerotolerantes
Con fines prácticos consideremos las bacterias anaerobias obligadas como aquellas
que no se multiplican en la superficie de un medio sólido nutricionalmente adecuado,
incubado en aire ambiental o en una incubadora de CO 2 (que contenga 5-10% de CO2
en el aire).
Dentro de este grupo se establecen dos categorías:
l.a- Anaerobios obligados estrictos
Estos microorganismos desarrollan en superficies de agar expuestas a niveles de
O2 de 0.03% como máximo.
l.b- Anaerobios obligados moderadamente
Son bacterias que desarrollan cuando se exponen a niveles de O2 de 2-8%.
El término anaerobio aerotolerante (grupo ll), es usado por algunos microbiólogos para
describir bacterias anaerobias que tendrán un crecimiento limitado o escaso en agar
expuesto al aire ambiente o en incubación con 5-10% de CO2, pero muestran buen
crecimiento bajo condiciones anaerobias.
Los anaerobios facultativos crecen bajo condiciones anaerobias o aerobias
determinadas.
Los microaerófilos requieren oxígeno como aceptor terminal, pero no desarrollan en la
superficie de medios sólidos con aire (21% de O2) y crecen con escaso desarrollo, si lo
hacen, en condiciones anaerobias.
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En el desarrollo de medios y sistemas para el cultivo de anaerobios deben ser
considerados dos factores fundamentales que pueden afectar el crecimiento de los
anaerobios en el laboratorio.
El más importante es el efecto inhibidor del oxígeno atmosférico y sus derivados tóxicos.
El segundo factor limitante es el potencial de oxidorreducción (Eh) del medio de cultivo.
Resumiendo:
 Aerobios obligados
 Microaerófilo
 Anaerobios facultativo
Estricto
Obligado
Moderadamen
te
Anaerobio
Aerotolera
nte
Tolerancia al oxígeno
Probablemente sean múltiples las razones por las cuales los anaerobios varían
en su tolerancia al oxígeno.
Una de las razones es que la tolerancia al O2 de muchos anaerobios obligados
moderados depende de su producción de enzimas superóxido dismutasa,
catalasas y peroxidasas, que son protectoras contra la toxicidad de los productos
de oxidorreducción.
Una teoría muy difundida es que la exposición al O2 produce una serie de
reacciones, mediada por flavoproteínas, que llevan a la producción del radical
superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno (H2O2) y otros productos de
oxidorreducción tóxicos:
Sustrato + O2
O2- +
 O2- + H2O2 + productos tóxicos
H2O2  OH- radical hidroxilo, potente oxidante biológico
OH- + O2
 1O2 singlete
Ciertos microorganismos producen enzimas capaces de contrarrestar estos
productos tóxicos, como la SUPERÓXIDO DISMUTASA y las CATALASAS.
Mediante la superóxido dismutasa (SOD) se transforman los radicales
superóxido en oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno.
O2- + O2- +2H+ SOD
H2O2 + O2
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El peróxido de hidrógeno se convierte inmediatamente en oxígeno y agua,
mediante las catalasas.
2H2O2
Catalasa
2 H2O + O2
Otra enzima que destruye el peróxido de hidrógeno es la PEROXIDASA, se
diferencia de la catalasa en que no libera oxígeno en la reacción.
H2O2 + 2H+
Peroxidasa
2 H2O
Potencial de oxidorreducción (Eh)
En la naturaleza el límite superior de Eh es + 820 mv, que podría encontrarse
en algunos ambientes con oxigenación considerable.
En los tejidos humanos sanos con suministro sanguíneo intacto prevalecen
condiciones de oxigenación y el potencial redox es de alrededor de + 150 mv.
En contraste, el límite inferior de Eh en la naturaleza varía alrededor de –420
mv.
Un ambiente anaerobio o un medio de cultivo rico en hidrógeno podría tener
ese Eh bajo. El intestino grueso de los humanos, que contiene enormes
cantidades de anaerobios estrictos obligados, posee un Eh de alrededor de 250
mv.
Por lo tanto, para el cultivo de microorganismos anaerobios es esencial el
mantenimiento de un bajo potencial redox.
Para tal objetivo se incorporan agentes reductores tales como tioglicolato y Lcisteína.
Con el fin de analizar la relación que existe entre Eh y el O 2 sobre la
supervivencia y crecimiento de las bacterias anaerobias fueron realizados
numerosos estudios de los cuales pudieron extraerse importantes
conclusiones.
Ha sido ampliamente demostrado que la extracción del O2 de los medios de
cultivo, para evitar su toxicidad, es más importante que establecer un bajo Eh.
Por lo tanto, el rápido logro y mantenimiento de una baja tensión de O 2 o la
ausencia es un requerimiento
esencial para el cultivo de anaerobios en
sistemas anaerobios moderados, como la jarra de anaerobios o la cámara de
guantes.
Medios de cultivos para bacterias anaerobias
El metabolismo anaeróbico es menos eficiente que el aeróbico para la
obtención de energía, por lo tanto los medios de cultivo deben ser más ricos
que los de uso común para aerobios o anaerobios facultativos, además
requieren una incubación más prolongada.
Los medios empleados para la recuperación de anaerobios deben incluir tipos
no selectivos y enriquecidos.
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Medios de cultivo no selectivos
Por lo general los anaerobios son bacterias muy exigentes. Se emplean medios
complejos que llevan: hidrolizados de carne, peptonas, extracto de levadura,
hemina, vitaminas, etc.
El medio requiere sustancias reductoras como tioglicolato, glucosa, ácido
ascórbico, cisteína, hierro, etc.
Como ejemplos:
Medio de Schaedler
Caldo de soja triptona 10 gr
Peptona
5 gr
Extracto de levadura
5 gr
Dextrosa
5 gr
Cisteína
0.4 gr
Hemina
0.1 gr
Tris Buffer
0.7 gr
Agar
15.5 gr
Agua destilada c.s.p.
1000 ml
Ph
7.6
Luego se suplementa con sangre desfibrinada al 5% y vitamina K 10 g/ml.
Medio Tioglicolato enriquecido (MTE)
Triptona
17 gr
Peptona de soja
3 gr
Dextrosa
6 gr
ClNa
0.5 gr
Tioglicolato de Na
0.5 gr
Agar
0.7 gr
L-cisteína
0.25 gr
Sulfito de Na
0,1 gr
Hemina
5 gr
Solución
de 4 ml
resarzurina (0.01%)
Agua c.s.p
1000ml
PH
7.0
Luego de esterilizardo y enfriado se suplementa con 0.1 g/ml de vitamina K y
10 mg/ml de NaHCO3.
Medios de cultivo selectivos
Por lo general las muestras a procesar para el aislamiento de microorganismos
anaerobios contienen mezclas de anaerobios obligados, facultativos y/o
aerobios.
Las especies presentes en pequeñas cantidades pueden pasar inadvertidas si
se usan medios no selectivos.
Incorporando distintas sustancias a los medios mencionados anteriormente se
obtienen diferentes medios selectivos. Agentes selectivos:
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Violeta de genciana: elimina bacilos esporulados aeróbicos.
Azida sódica: inhibe el crecimiento de bacilos Gram positivos esporulados
aeróbicos.
Fenil etil alcohol: inhibe bacilos Gram negativos aerobios y anaerobios
facultativos.
Neomicina: inhibe Gram negativas facultativas.
Vancomicina+Kanamicina: selecciona bacilos Gram negativos anaerobios.
Sistemas anaerobios para el cultivo de bacterias anaerobias
Estudios comparativos han demostrado que los siguientes sistemas son
satisfactorios para el cultivo e incubación de bacterias anaerobias.
1- Técnica en jarra anaerobia
Con catalizador:
a-Evacuación-reemplazo
b-Método del sobre generador de gas descartable
Sin catalizador:
Fijación del O2 por limaduras de Fe
2- Técnica de la cámara anaerobia de guante
3- Tubos con película de agar con siembra por estrías en medios PRAS.
1- Técnica en jarra anaerobia
Existen diferentes marcas en el mercado por ejemplo: Brewer, GasPak, Oxoid,
Mclntosh, entre otras.
La jarra Oxoid, utilizada en el TP, es de policarbonato, tiene una capacidad de 3.5
lt, cerrada con una tapa de metal pesado y una abrazadera de metal.
El centro de la tapa tiene dos válvulas Schrader y un manómetro.
Las válvulas se utilizan en la técnica de evacuación-reemplzo (E/R).
En la parte interna de la tapa se ubica el catalizador.
La remoción del oxígeno ocurre por reacción con el
hidrógeno agregado al sistema en presencia del
catalizador.
H2 + O2
catalizador
H2
El uso de un catalizador activo en cada sistema es
importante.
La jarra de Brewer, más antigua, utilizaba un
catalizador de paladio en la tapa que tenía que ser
calentado con una corriente eléctrica para ser activo.
La jarra GasPak usa un catalizador en frío compuesto
de bolitas de alúmina cubiertas de paladio, que no
requieren calentamiento.
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El catalizador en frío es más conveniente para usar y no tiene riesgo de
explosión.
El catalizador en frío de paladio puede ser inactivado en la jarra por la
producción de SH2 u otros productos volátiles de las bacterias.
Se recomienda reemplazarlo por uno nuevo o uno reactivado cada vez que se
utiliza la jarra.
Puede reactivarse mediante el calentamiento en estufa a 160-170°C durante 2
horas. Luego se guarda en un secador.
En estos sistemas las condiciones anaeróbicas se producen o bien utilizando un
sobre generador de gases o mediante la técnica de evacuación-reemplazo.
En la técnica de anaerobiosis por evacuación-reeplazo se extrae el aire de la jarra
hasta 51-61 mm Hg, luego se lava con corriente de N2. Este procedimiento se
repite dos veces.
Por último se llena la jarra con una mezcla anaeróbica de N2:85%, CO2:5% e
H2:10%.
En la técnica del sobre generador de gases se emplean sobres conteniendo, por
ejemplo, ácido cítrico o tartárico, bicarbonato de sodio y borohidruro de sodio.
En el momento de utilizarse se corta el extremo del sobre y se hidrata con un
volumen de agua, luego se cierra inmediatamente la jarra.
En el sistema se producen las siguientes reacciones:
C6H8O7 + NaHCO3
Na3(C6H5O7) + 3 H2O + 3 CO2
NaH4 B + 2 H2O
NaBO2
+ 4 H2
El H2 generado reacciona con el O2 del aire, en presencia del catalizador produciendo
H2O.
Dentro de la jarra se colocará un indicador de Eh, independientemente de la técnica
empleada. Para lo cual se encuentra en el comercio tiras de azul de metileno que en
condiciones de anaerobiosis vira del azul al blanco.
Una alternativa consiste en colocar dentro de la jarra un tubo de ensayo con unos
mililitros de una mezcla de azul de metileno + NaCO3 + glucosa.
El indicador es azul cuando está oxidado e incoloro cuando está reducido. El cambio
de color ocurre alrededor de los +11 mv.
Conjuntamente con el viraje del indicador de Eh ocurre un calentamiento de la tapa
de la jarra luego de los 40 minutos y se observa condensación en la superficie
interna dentro de los 25minutos.
La técnica E/R resulta más económica que el generador de gas y permite que las
condiciones de anaerobiosis se establezcan más rápidamente.
En los sistemas sin catalizador la anaerobiosis se logra mediante Fe finamente
dividido, ácido cítrico, CO3Na2 y tierra silícea como soporte (Kit comercial Merck). En
el momento de usar se humedece con un volumen de agua, el O 2 del aire es fijado
con avidez por el Fe dando los siguientes productos:
Fe(OH)2 + Fe(OH)3 + Fe2O3 + FeO + H2 + CO2
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En breve tiempo se registra el descenso del O2, creando una atmósfera anaeróbica
rica en CO2.
La técnica empleada en el TP es una adaptación del Kit comercial.
Se utiliza lana de Fe embebida con una solución cúprica (CuSO 4.5H2O al 0.5%,
tween 80 0.25%, pH 2).
Como generador de CO2 se coloca un tubo conteniendo una solución acuosa de
KHCO3 y ácido cítrico.
2-Cámara anaerobia de guante
Una cámara anaerobia de guante es un sistema anaerobio autoabastecido que
permite procesar muestras y realizar la mayor parte de las técnicas bacteriológicas
para aislamiento e identificación de bacterias anaerobias sin exposición al aire.
Pueden construirse de diferentes materiales, incluyendo acero, acrílico o fibra de
vidrio. La más ampliamente usada es la de plástico vinílico flexible.
Una vez adquiridas el funcionamiento de estas cámaras es económico porque
permiten el uso de medios convencionales y el costo de los gases es mínimo.
Los materiales se colocan y se retiran de una pre-cámara flexible. Las condiciones
anaerobias se mantienen por una constante recirculación de la atmósfera dentro
de la cámara plástica (85%de N2. 10% de H2 y 5% de CO2) a través de un
catalizador de paladio en frío.
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3-Medios PRAS en tubos arrollados
Esta técnica utiliza medios PRAS: medios previamente reducidos y
anaeróbicamente esterilizados.
El medio se envasa en tubos con tapón de caucho butílico bajo gas libre de O 2 y
se esterilizan y mantienen en ambiente anaeróbico.
Luego de esterilizados se enfrían en una máquina giratoria lo que resulta en una
capa fina de agar en la superficie interna de los tubos.
El sistema requiere el agregado de un agente reductor, como L-cisteína en la
fórmula del medio de cultivo.
Todas las inoculaciones de estos medios sean líquidos o sólidos se realizan bajo
corriente de CO2.
Cada tubo con PRAS se convierte así en su propia cámara de cultivo anaeróbico y
puede ser colocado en un incubador de aire ambiental para su incubación.
Permiten la inspección de las colonias en cualquier momento sin la exposición al
O2.
Distribución en la naturaleza de las bacterias anaeróbicas.
Las bacterias anaeróbias están ampliamente distribuidas en la tierra, pantanos,
sedimentos de lagos y ríos, océanos, aguas residuales, alimentos y animales.
La mayor parte de estas hábitat tienen una tensión de oxígeno baja y un Eh
reducido, resultantes de la actividad metabólica de los microorganismos que
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consumen oxígeno a través de la respiración. Si el oxígeno no es reemplazado, se
mantienen las condiciones anaerobias en el ambiente.
Importancia de las bacterias anaerobias
a-
En bacteriología clínica: los microorganismos anaerobios pueden dar
cualquier tipo de infección, muchas de alta gravedad. Estos microorganismos
pueden pasar inadvertidos, ya que lo más común es encontrarlos en cultivos
mixtos.
bEn el control sanitario de alimentos: como ejemplos Clostridium
perfringens y Clostridium Botulinun causan el deterioro de alimentos e
intoxicaciones graves. En estos casos es necesario demostrar la presencia
de la toxina, el aislamiento y la tipificación del germen.
cEn la industria:
 Fermentación de hidratos de carbono, distintas especies del género
Clostridium producen acetona, butanol e isopropanol. Actualmente, la
síntesis química ha desplazado en parte al proceso microbiológico.
 Procesos fermentativos en los que se utilizan bacterias fermentativas y
bacterias anaerobias estrictas.
B. metanogénicas
An. estrictos
Hidratos de carbonos
An. facultativas
Ac. Grasos + alcoholes + CO2 + H2
CH4
Procesamiento y examen de una muestra para el aislamiento de bacterias
anaerobias
El procesamiento mínimo debe incluir:
1-
La observación directa-Características microscópicas. Los frotis
de las muestras deben ser examinadas previamente coloreados por la
técnica de Gram. Este paso es muy importante porque puede sugerir la
presencia de bacterias anaerobias que se caracterizan por su coloración
irregular y pleomorfismo. Además orientará sobre los medios selectivos a
utilizar y servirá como control de calidad, debiendo recuperarse todos los
tipos morfológicos en proporción aproximada a la que se observó.
2Siembra en medios sólidos-Relación con el O2.Se siembra: una
placa de agar sangre en aerobiosis, otra en anaerobiosis una tercera
placa en microaerofilia. La microaerofilia se logra colocando en un
recipiente hermético una vela encendida que al extinguirse dará una
atmósfera con 4% de O2 y 5-10% de CO2 aproximadamente.
3Siembra en medios líquidos. Los medios líquidos, como el
tioglicolato, deben ser purgados antes de la siembra y suplementarse con
vitamina K y CO3HNa.
Se inoculan con pipeta Pasteur llegando al fondo y sin introducir aire. Los
medios de cultivo líquidos son considerados “el respaldo” de los medios
sólidos.
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Los cultivos de bacterias anaerobias son de desarrollo lento, por lo tanto
deben incubarse 48 hs. antes de la primera observación.
Los cultivos negativos se mantienen en incubación durante dos semanas
con observaciones periódicas.
4Aislamiento de las colonias desarrolladas. Deben verificarse la
anaerobiosis y observar las características macroscópicas.
Realizar la observación microscópica previa coloración de Gram. Siembra
en medios selectivos
5Pruebas bioquímicas destinadas a la identificación del
microorganismo. Se recurre en primer lugar a un conjunto de pruebas
bioquímicas que permiten la identificación en grupos preliminares. Luego,
dentro de cada grupo se procede a la identificación definitiva. Existen en
el comercio microsistemas completos para la identificación de los
anaerobios por ejemplo: API-20ª y Minitek.
La identificación de los anaerobios también puede llevarse a cabo
mediante el análisis de los productos metabólicos de la fermentación,
ácidos volátiles y no volátiles, por cromatografía líquido-gas.