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Canales Iónicos
FSN 2016
Eleonora Katz
Mecanismos involucrados en el movimiento de iones y moléculas a través de
la membrana
a) Difusión (simple) pasiva
b) Transporte pasivo (difusión facilitada)
c) Transporte activo (primario o secundario)
Canales involucrados en la generación y propagación de señales eléctricas
en células excitables
Canales Iónicos
Sensibles a estímulos
específicos:
Eléctricos (voltaje)
Canales voltaje-dependientes
Na+, K+, Ca2+, Cl-
Químicos (neurotransmisores,
hormonas, iones y metabolitos
i.e., Ca2+, ATP, GTP)
Canales ligando-dependientes
ACh,GABA, Glutamato,
Glicina, Serotonina, ATP, GTP,
cAMP, KCa, entre otros
Mecánicos (estiramiento, presión)
Canales mecanoreceptores
Receptores de estiramiento en el huso muscular, de presión en la
piel: Corpúsculo de Paccini,
Canales en los cilios de las células del oído
Características de los canales iónicos:
Permeabilidad selectiva: el poro abierto permite el flujo de una clase restringida de
iones a favor de su gradiente electroquímico.
Conductancia medida eléctrica de la facilidad con la que un medio conduce iones o
electrones. Flujo a través de los canales es de alta velocidad > 106 iones/s. Es la
inversa de la resistencia. 1/ohms = Siemens (ley de Ohm V = IR)
cerrado
abierto
Gating respuesta del canal para pasar de un estado a otro
Conductancia (g)
Cinética de apertura (ta)
Cinética de cierre (tc)
Probabilidad de Apertura (Po)
Algunos diagramas cinéticos
Los eventos de apertura de los
canales ocurren al azar , son
independientes y tienen una
determinada probabilidad de ocurrir,
dependiendo de las condiciones del
entorno.
Estímulos (entorno): Vm,
concentración del ligando, magnitud del
estiramiento o presión, luz, etc.
Selectividad
Radio iónico
Hidratación
Radio del poro
Carga
Propiedades químicas
La habilidad de los canales iónicos de
distinguir entre las distintas especies
iónicas es un aspecto fundamental de su
función biológica.
Por qué un canal de Ca2+ es más selectivo para el Ca2+ que para los otros cationes?
1)
2)
3)
Número, tipo químico y carga de los ligandos que tapizan el poro
La rigidez del poro, tamaño, simetría, accesibilidad del solvente
El grado de hidratación del Ca2+ (y de los otros cationes) fuera del filtro de selectividad
Para poder entender la selectividad de un dado
canal para un dado ion es además necesario
conocer las energías de interacción entre los iones,
el agua, el poro y los movimientos de estos
componentes.
Para esto se necesita conocer la estructura completa
del poro (cristalizar la proteina)
Filtro selectivo del canal de K+: Región del canal que le da
selectividad para el K+
Patch‐clamp measurements of the ion selectivity of wild‐type and E178 mutant NavMs
channels
Claire E Naylor et al. EMBO J.
doi:10.15252/embj.201593285
©2016 by European Molecular Biology Organization
Técnicas que se utilizan para estudiar las
propiedades biofísicas y funcionales de los
canales iónicos
Registro de canales unitarios: técnica de “Patch-clamp”
Erwin Neher & Bert Sakmann (años 70-80)
Neher & Sackman 1976
El empleo de herramientas matemáticas -ensambles de registros de
corrientes unitarias- da estimaciones precisas de las propiedades
de las corrientes macroscópicas.
Corrientes de Na y de K (Trabajo de H&H 1952)
Configuraciones de “Patch-clamp”
Configuraciones de “Patch-clamp”
I positiva = I entrante al patch
Corrimiento positivo en Vcmd = hiperpolarizante
Vm = RMP - Vcmd
Vm = -Vcmd
Vm = Vcmd
Vm = Vcmd I positiva = corriente saliente
Corrimiento Positivo en Vcmd = despol
Vm = Vcmd
PERMEACIÓN A TRAVÉS DE LOS CANALES


c
58 mV
Vr =
log o 
 c
z
 i 
[K]o =5 mM, [K]i=150 mM


58 mV
5
mM
VK =
log
  86 mV
150 mM 
+1
Ion
z
co (mM)
ci (mM)
Vr (mV)
K
+1
5
150
-86
Na
150
15
Cl
120
10
Ca
2
0.0001
Relación corriente-voltaje unitaria
Conductancia unitaria
Probabilidad de apertura (de encontrar al canal abierto)
Po=  to /  Ttotal
Tiempos de abierto y cerrado
Registros de canal único (Umemiya & Berger, 1995)
Modulación de la Probabilidad de apertura (Po)
Patch-clamp
configuración
“Whole-cell”
Se miden corrientes
Macroscópicas
Cuál es la relación entre la
corriente unitaria y la
macroscópica?
i = g(Em –Eion)
Imacroscópica = gNPo (Em –Eion)
a)
Conductancia macroscópica independiente del voltaje:
I = (V-Vr) G
G = N gpo
1000
1.0
500
Current (pA)
Open Probability
0.8
0.6
0.4
-500
0.2
0.0
-100
0
-50
0
50
Voltage (mV)
100
-1000
-100
-50
0
Voltage (mV)
N=200, g = 50 pS, Vr=0
50
100
b) Conductancia macroscópica dependiente del voltaje
G = N gpo(V)
I = (V-Vr) G(V)
1000
1.0
500
Current (pA)
Open Probability
0.8
0.6
0.4
-500
0.2
0.0
-100
0
-50
0
50
100
-1000
-100
-50
Voltage (mV)
N=200, g = 50 pS, Vr=+50 mV
0
Voltage (mV)
50
100
Técnica de fijación de voltaje “voltage-clamp”
Voltage Clamp con dos microelectrodos
Imembrana = CdV/dt + I iónica
A2 =
mganancia del amplificador
Oocitos de Xenopus laevis
Técnica de fijación de voltaje con dos microelectrodos (corrientes macroscópicas)
Ejemplo de corrientes iónicas a través de un canal ligando-dependiente
medidas con la técnica de fijación de voltaje con dos microelectrodos en
oocitos de Xenopus laevis
Vsostén = -70 mV
Una vez que se fijó el Vm de la célula al valor deseado, se aplica el ligando
que se quiere estudiar y se miden las corrientes iónicas
Canales dependientes de voltaje
Canales activados por voltaje
Estructura de los canales de Na dependientes de voltaje
Estructura de los canales de K+
Estructura de los canales de Ca2+
Los Canales de Calcio y la transducción de señales
2011
Modelo de inactivación que se postula para los canales de Na+ y para
algunos canales de K+
Modelo “Ball and Chain”
A potenciales despolarizados la pelota es más estable
en la conformación que bloquea el pasaje de iones
Corrientes iónicas (macroscópicas) medidas en oocitos de Xenopus laevis
(KCNQ)
Figure 1. Ionic currents from neuronal KV7 channels expressed in Xenopus oocytes recorded at 18°C (A) and
at 28°C (B). Currents were elicited in response to test pulses from -100 to +40 mV in 10 mV increments from and
returning to an holdingpotential of -90 mV.
For ionic current recordings, the external and internal solutions contained (in mM): 101 NMethy-D-Glucamine (NMG), 12 KOH, 4 Ca(OH)2 and 20 Hepes, pH 7.4 with methane
sulfonic acid (MES acid), and 120 KOH, 2 EGTA and 20 Hepes, pH 7.4 with MES acid,
respectively.
Corrientes de “gating”
Charge movement in Kv channels. a | Gating currents
recorded from a cell expressing the Shaker Kv channel.
Canales ligando-dependientes
Ionotrópicos de ACh, Glutamato, GABA, Glicina, Serotonina
ATP, cGMP, KATP, Kca, ClCa, entre otros.
La ACh actúa sobre dos tipos de receptores
nicotínicos
ionotrópicos
canales iónicos
muscarínicos
metabotrópicos
acoplados a proteínas G
Los receptores nicotínicos son proteínas oligoméricas compuestas
por 5 subunidades glicosiladas que atraviesan la membrana y
conforman un canal catiónico
290 KDa
Mapa de densidad de
proteínas
Pertencen a la superfamilia de receptores activados por ligando formada
por los receptores nicotínicos, GABAA, glicina y 5HT3
Estructura cuaternaria de los receptores nicotínicos
Esquema basado en el
receptor del órgano
eléctrico de Torpedo
Californica
TM2 poro del canal
40-65 KDa
El nAChR tiene tres estados posibles
ACh
10-100 ms
100 ms-1 min
C
A
CERRADO
no conduce
ABIERTO
conduce
D
DESENSIBILIZADO
no conduce y no es
sensible a ser abierto por
el agonista
Selectividad iónica
Na+, K+ y Ca2+
PNa/PK  1
PCa/PNa 0.2-20
TM2
3 anillos de aa cargados
negativamente orientados hacia el
poro del canal, determinantes de la
selectividad iónica
K+ K+
+
+
K
K
Permeabilidades relativas PK/PNa y
PCa/PNa
Corriente neta y potencial de membrana
Entrada masiva de Na+
Despolarización
Entrada de Ca2+
Segundo Mensajero
Activación de otras corrientes
Hiperpolarización
Ca2+Ca2+ Ca2+
+ Na+
2+
Na
Na+ + + Ca2+ Ca2+ Ca
Na Na
Subunidades Colinérgicas Nicotínicas
nAChR Musculares
Alpha1 (a1)
Beta1 (b1)
Gamma (g)
Delta (d)
Epsilon (e)
nAChR Neuronales
Alpha2 (a2) Beta2 (b2)
Alpha3 (a3) Beta3 (b3)
Alpha4 (a4) Beta4 (b4)
Alpha5 (a5)
Alpha6 (a6)
Alpha9 (a9)
Alpha10 (a10)
Alpha7 (a7)
Alpha8 (a8)
Los receptores que difieren en la composición de sus
subunidades presentan propiedades biofísicas, funcionales y
farmacológicas diferentes
Los tipos de subunidades ensambladas determinan las propiedades
biofísicas, farmacológicas y fisiológicas del canal.
fetal
δ
adulto
ε
Músculo fetal vs adulto (canales
nativos)
Oocitos abgd vs. abge(canales
recombinantes)
La Placa Neuromuscular de vertebrados
Eventos pre y post-sinápticos a nivel de la placa neuromuscular
ACHE
Aidley and Stanfield
Hille
Sakmann & Neher
Cambridge University
Press
Sinauer
Plenumm Press
Physiol Rev. 2009 Jan; 89(1): 73–120.
doi: 10.1152/physrev.00015.2008
PMCID: PMC2713585
NIHMSID: NIHMS106860
Mammalian Nicotinic Acetylcholine Receptors: From Structure to Function
Edson X. Albuquerque, Edna F. R. Pereira, Manickavasagom Alkondon, and Scott W. Rogers