FSN TP transmision sinaptica.pdf

Fisiología del Sistema Nervioso
Guía de Trabajos Prácticos
Transmisión sináptica en la placa neuromuscular de vertebrados
Autor: Eleonora Katz
1) Liberación espontánea y evocada por potasio extracelular.
2) Relación entre el calcio extracelular y el contenido cuántico de la
liberación evocada por estimulación del nervio.
3) Relación entre el calcio extracelular y la frecuencia de potenciales
miniatura espontáneos.
4) Efectos de drogas que modulan el proceso de liberación del
neurotransmisor.
Introducción
El esquema general de la liberación
del neurotransmisor y la
subsiguiente respuesta post-sináptica en la placa neuromuscular de
vertebrados pueden resumirse como: llegada de la señal (PA) al terminal
presináptico, despolarización transitoria de la membrana, entrada de calcio a
través de canales de calcio voltaje dependientes, evento/s dependientes de
calcio que promueven la exocitosis de las vesículas sinápticas, liberación del
Acetilcolina (Ach) a la brecha sináptica, apertura de los canales post-sinápticos
sensibles a Ach, potencial de placa (EPP), potencial de acción del músculo y
subsiguientes eventos post-sinápticos que culminan en la contracción del
músculo.
Liberación cuántica: Fatt y Katz (1954) demostraron que en la placa
neuromuscular la Ach se liberaba en forma de paquetes o cuantos. La primera
evidencia de que esto era así fue la observación por estos autores de la
ocurrencia, en el músculo en reposo, de pequeñas fluctuaciones en el potencial
de membrana que presentaban una forma similar a los (potenciales postsinápticos evocados) EPPs, pero que tenían una amplitud de solo 0.5mV.
Estos potenciales espontáneos miniatura (MEPPs) solo se encontraban en la
región de la placa, su tamaño se reducía con curare y se incrementaba en
presencia de inhibidores de acetilcolinesterasa. Haciendo un análisis
estadístico de los intervalos de tiempo entre MEPPs sucesivos se vio que estos
ocurrían con una distribución al azar en el tiempo. Estas observaciones llevaron
a la hipótesis de que los MEPPs eran causados por Ach liberada
espontáneamente del terminal. Estudios posteriores (Kuffler y Yoshikami, 1975)
proveyeron una estimación del número de moléculas de Ach responsables de
producir una despolarización del tamaño de un MEPP (~ 6000 moléculas).
Una propiedad de los MEPPs es que su frecuencia puede ser alterada por
procedimientos que alteren el potencial de membrana de la membrana
presináptica. Liley (1956), observó que pasando corriente despolarizante a
través de un electrodo cercano a los terminales la frecuencia de MEPPs
aumentaba y que si la corriente era hiperpolarizante la frecuencia disminuía.
Asimismo, la despolarización presináptica inducida por un aumento en la
concentración extracelular de K+, produce un aumento en la frecuencia de los
MEPPs. El hecho de que las manipulaciones que alteran la post-sinapsis
(curare, anticolinesterásicos), alteren la amplitud de los MEPPs sin alterar su
frecuencia, y que las manipulaciones en la presinapsis (depolarización,
variación del calcio extra o intracelular) tengan efecto sobre la frecuencia y no
afecten la amplitud de los mismos llevó a Bernard Katz a postular que “la
frecuencia de MEPPs está enteramente controlada por las condiciones de la
membrana presináptica mientras que su amplitud está controlada por las
propiedades de la membrana post-sináptica” (este punto se discutirá en el TP
porque las manipulaciones descriptas pueden afectar tanto a la membrana pre
como a la post-sináptica).
Además, Fatt y Katz (1952), observaron que las amplitudes de los
potenciales de placa evocados en condiciones en las cuales la transmisión
sináptica había sido disminuida por reducción del calcio extracelular o por
incremento del magnesio, fluctuaban en forma escalonada: algunos estímulos
no producían respuesta alguna, otros, una respuesta de amplitud similar al
MEPP o múltiplos de dicha amplitud.
Naturaleza probabilística: Del Castillo y Katz (1954) estudiaron la naturaleza
de las fluctuaciones en la liberación con más detalle. Los experimentos
consistían en reducir la liberación por medio de aumentar la relación Mg2+/Ca2+
en el medio extracelular y luego registrar un gran número de EPPs y de
MEPPs. Hicieron histogramas de distribución de amplitudes y vieron que los
MEPPs tenían una varianza respecto de la media de alrededor de 10%. A
causa de esta varianza los EPPs no ocurrían en escalones directos, sino que
se producían picos en su distribución de amplitudes, estos picos ocurrían
precisamente en 1x o múltiplos (2x, 3x,...nx) de la amplitud de la media de los
MEPPs y la varianza de cada pico eran múltiplos (2x, 3x,...nx) de la varianza de
la amplitud media de los MEPPs (ver Figura 19, pág. 224, del capítulo
“Principles of Synaptic Transmisión” en From Neuron to Brain). En base a estos
experimentos formularon la hipótesis cuántica: en la que propusieron que la
liberación de las vesículas sinápticas podía ser predicha por una distribución
binomial. En N ensayos (estímulos) el número total esperado de cuantos
liberados estará dado por: Nm, siendo m el número promedio de cuantos
liberados por estímulo. En esta distribución m = np, donde n = número de
vesículas disponibles y p = probabilidad que tiene cada vesícula de ser
liberada.
En condiciones fisiológicas p es grande pero en la condición en la cual
se incrementa la relación [Mg2+]/[Ca2+], p puede ser lo suficientemente pequeño
como para que se pueda aplicar la distribución de Poisson. En estas
condiciones Del Castillo y Katz contrastaron la hipótesis de que en el terminal
existiría una enorme población de cuantos, cada uno de los cuales presentaría
una pequeña probabilidad de ser liberado. Realizaron el análisis estadístico de
un gran número de respuestas a impulsos nerviosos en presencia de una
elevada relación [Mg2+]/[Ca2+] para reducir el contenido cuántico de cada
respuesta.
Considerando nx evento en el cual x cuantos son liberados; N él número
total de eventos; p la probabilidad de liberar un único cuanto y q la probabilidad
de que un cuanto no sea liberado, o sea, q = 1-p cuando p es pequeña (es el
caso en que la relación Mg2+/Ca2+ es muy alta), el modelo que mejor se
ajustaba era el de la distribución de Poisson:
f(x) = nx/N = e-m mx/x!
donde m = np = número promedio de cuantos liberados por estímulo. Este
valor de m resultó igual al evaluado por el método directo (Amplitud media del
EPP/Amplitud media del MEPP).
En fisiología sináptica m es llamado contenido cuántico, este parámetro
fisiológico puede calcularse por el método directo o por métodos estadísticos
(Fallas, Varianza) según cuales sean las condiciones del medio extracelular en
el que se desea trabajar (se discutirán los distintos métodos durante el TP).
Relación entre el [Ca2+]ext y la liberación del neurotransmisor: La liberación
del neurotransmisor es un proceso altamente dependiente de la entrada de
calcio al terminal presináptico. Se ha encontrado que la relación entre la
liberación del neurotransmisor y la [Ca2+]ext sigue una relación del tipo:
liberación α [Ca2+]extn, donde n ~3-4. La entrada de calcio ocurre vía canales
de calcio voltaje dependientes (VDCC) presentes en la membrana del terminal
(ver Dodge y Rahamimoff, 1967; Augustine y Charlton, 1986). Dada la elevada
sensibilidad del sistema de liberación a la entrada de calcio al terminal,
cualquier agente que afecte este proceso tendrá un efecto modulatorio muy
importante sobre la liberación del neurotransmisor.
La despolarización del terminal es seguida por la rápida repolarización
del mismo. En esta repolarización están involucrados los canales de potasio
(tanto los voltaje dependientes gKv como los calcio y voltaje dependientes
gKCa,v) por lo tanto los mismos juegan un papel muy importante en la regulación
de la entrada de calcio al terminal sináptico y por ende en la regulación del
número de vesículas que se liberan por impulso nervioso (ver Charlton y
Robitaille, 1992).
Nota: Para este TP se deben leer el capítulo “Principles of Synaptic
Transmission” de From Neuron to Brain por Nicholls J.G., Martin A.R y Wallace
B.G. Editorial Sinauer y “The release of neural transmitter substances” por
Bernard Katz (1969) Sherrington Lectures, N°. 10. Liverpool University Press,
Liverpool.
Bibliografía
- Austine, G.J. & Charlton, M.P. (1986). J. Physiol. 381, 619-640
- Del Castillo y Katz (1954) J. Physiol. 124, 560-573.
- Dodge, F.A. & Rahamimoff, R. (1967). J. Physiol. 193, 419-432.
- Fatt, P. y Katz, B. (1952) J. Physiol 117, 109-128.
- Kuffler y Yoshikami (1975). J. Physiol 251, 465-482.
- Liley, A.W. (1956). J. Physiol 132, 650-666.
- Robitaille, R. & Charlton M.P. (1992). J. Neurosci. 12 (21), 297-305.
Desarrollo del TP
Objetivos
Familiarizar al alumno con las técnicas convencionales de
electrofisiología: registro del potencial de membrana con electrodos
intracelulares, reconocimiento de las zonas de placa neuromuscular, registro
intracelular de potenciales de placa espontáneos y evocados por estimulación
del nervio motor.
Evaluación de la liberación espontánea y evocada de Ach en diferentes
medios extracelulares por medio del registro de potenciales de placa en la
célula post-sináptica.
Materiales y Métodos
Se utilizarán ratones macho adultos de la cepa Suiza de 30-40g de peso
corporal. Hasta el momento de su utilización, se los mantiene en el bioterio bajo
régimen de 12 horas de luz-oscuridad, con agua y alimento balanceado ad
limitum.
Se sacrifica a los animales por medio de una sobredosis de anestesia
(Avertina al 2% en H2O bidestilada, 0.3 ml/10g de peso corporal, i.p.) y
posterior desangrado. Se remueve músculo diafragma con el nervio motor que
lo inerva (frénico). Se cuida de extraer el nervio en forma intacta y dejando un
cabo de extensión suficiente para facilitar la succión y estimulación del mismo.
Para la disección fina, el músculo se transfiere a una caja de Petri con base de
Sylgard que contiene una solución de Ringer normal para ratón de la siguiente
composición (mM) NaCl, 137; KCl, 5; CaCl2, 2; MgSO4, 1; NaHCO3, 12;
NaH2PO4, 1; D-glucosa, 11, saturada con carbógeno (95% O2, 5% CO2), a
temperatura ambiente (19-22°C). La preparación se transfiere luego a una
cámara de acrílico, con base de vidrio cubierta con Sylgard, para registros
electrofisiológicos. El músculo se monta sobre el Sylgard y sujetándolo con
alfileres de disección, se lo estira al máximo de su extensión.
La preparación se mantiene durante todo el experimento bajo burbujeo
constante con carbógeno.
Registros electrofisiológicos
La cámara de registros, sobre la cual se monta la preparación a estudiar,
se coloca sobre la platina del microscopio del sistema de registros
eletrofisiológicos. Para los registros de potenciales de placa evocados y
espontáneos se utilizan técnicas convencionales con microelectrodos
intracelulares. Los microelectrodos se preparan a partir de capilares de
borosilicato de aluminio con microfilamento en un estirador de pipetas y luego
son llenados con solución de KCl 3M. Se ajustan las condiciones del estirador
de pipetas de manera de obtener electrodos de resistencia de entre 5 y 20 MΩ.
El microelectrodo de registro se conecta al cabezal de un amplificador
Axoclamp 2A. El cabezal del amplificador se halla montado sobre un
micromanipulador que permite realizar movimientos finos del microelectrodo en
los tres ejes del espacio. La salida del Axoclamp 2A (Vm = 10x) es amplificada
100x.
Para los registros de potenciales de placa evocados, se estimula el
nervio directamente. El nervio es colocado sobre dos bornes que contactan con
una unidad aisladora (fuente de potencial). Para la generación de pulsos de
estimulación se utiliza un conversor analógico-digital, controlado por una
computadora, para disparar el estímulo en la unidad aisladora.
Parte A: Liberación espontánea y liberación evocada por alto potasio.
Una vez disecada la preparación y montada en la cámara de registros
electrofisiológicos, se procede a registrar los potenciales miniatura (MEPPs). El
microelectrodo de registro se inserta en la fibra muscular en las regiones de las
placas, identificadas mediante el seguimiento visual de las ramificaciones finas
del nervio motor. La correcta ubicación del microelectrodo respecto de la placa
neuromuscular, se evaluará por el tiempo que tarda el MEPP en alcanzar su
amplitud máxima (tsubida), el cual si se lo mide entre el 10 y el 90% de la
excursión temporal total (del pie a pico del MEPP) no debe ser > 1ms. Una vez
impalada la fibra muscular en la zona de la placa, se registran los potenciales
miniatura durante períodos adecuados para obtener entre 50 y 100 eventos por
fibra (~1-2 min).
En todos los casos se registra el potencial de reposo (Vm) de entrada a
la fibra muscular (no debe ser <-55 mV) y el Vm antes de retirar el electrodo de
registro de la misma.
1) Se computa la frecuencia de aparición de MEPPs en 10-15 fibras
musculares (frecuencia basal de MEPPs o espontánea).
2) Luego se cambia la solución por una solución de Ringer conteniendo 10 mM
de K+, se esperan 30 minutos y se repite el proceso explicado en 1.
3) Se repite 2 con una solución de Ringer conteniendo 15 mM de K+.
4) Se repite 3 en presencia de una droga X.
Se grafica luego la relación entre la frecuencia de MEPPs estimulada por
potasio versus la [K+]ext.
Se construye un diagrama de barras con la frecuencia basal, la
estimulada por [K+]ext = 15 mM con y sin la droga X.
A partir del efecto observado de la droga X, proponer cuál/es podría ser
el mecanismo de acción de la misma y plantear los experimentos que realizaría
para validar su hipótesis.
Parte B: Liberación evocada y espontánea de neurotransmisor. Relación
entre la [Ca2+]ext y el contenido cuántico de la liberación (m). Relación
entre [Ca2+]ext y la frecuencia basal de MEPPs.
Se coloca la cámara de registros con la preparación a estudiar sobre la
platina de la lupa. Se succiona el nervio con el electrodo de succión. Se verifica
que el músculo se contraiga bien ante un estímulo de 10 volts aplicado durante
0.01 ms a través del electrodo de succión. Se disminuye la amplitud del
estímulo hasta encontrar el umbral para la contracción. En este punto, se
cambia dos o tres veces la solución de Ringer para verificar que el nervio no se
mueva de su lugar con los cambios de solución.
La preparación se incuba durante 30 min en una solución de bajo Ca2+
(0.4–0.5 mM) y elevado Mg2+ (6–7 mM), el resto de los componentes y su
concentración en la solución del baño serán los mismos que los utilizados para
preparar la solución de Ringer normal. Luego de 15 o 20 min en esta solución,
debe verificarse que no haya contracción muscular.
1) Se procede a impalar las fibras musculares en las zonas de la placa. Una
vez impalada:
a) se contabiliza la frecuencia de aparición de MEPPs durante 1-2 min.
b) Luego se dan 100 estímulos sucesivos a una frecuencia de 0.5 Hz,
contabilizándose el número de estímulos para los cuales no haya respuesta
postsináptica (falla). Se realiza este procedimiento en 10-12 fibras.
Recordar que siempre se deben registrar el Vm de entrada y el Vm de salida de
la fibra muscular.
2) Se cambia la solución por otra que contenga 0.6 mM Ca2+ (el Mg2+ sigue
siendo 7 mM) y se repite 1 en otras 10 fibras musculares.
3) Se repite 2 con una solución que contenga 0.8 mM Ca2+
4) Se repite 2 con una solución que contenga 0.9 (o 1 mM) Ca2+
5) Se repite 2 (pero solo se evalúan EPPs) con una solución que contenga 0.9
o 1 mM Ca2+ y 9 mM Mg2+.
6) Se incuba la preparación durante 30 min en una solución 0.9 (o 1 mM) Ca2+
y 9 mM Mg2+ que contenga además la droga Y. Se repite el procedimiento
descripto en 2 (pero solo se evalúan EPPs).
Se calcula el contenido cuántico promedio obtenido en cada condición.
Se construyen los gráficos de m versus log[Ca2+]ext y de frecuencia de MEPPs
versus log[Ca2+]ext.
Se realiza un diagrama de barras con los valores de contenido cuántico
obtenidos en los items 4, 5 y 6.
Proponer cual podría ser el mecanismo/s de acción de la droga Y. Plantear los
experimentos que realizaría para validar su hipótesis.
Evaluación del contenido cuántico (m) de la liberación:
El método de las fallas es un método estadístico que se basa en la
distribución de Poisson. En N ensayos consecutivos, la proporción esperada de
veces en las cuales la variable toma el valor x está dada por: nx/N = e-m mx/x!.
En el caso particular en que este valor sea 0, es decir que no hay potencial de
placa o que ocurre una “falla” en la liberación del transmisor ante un estímulo,
esto se convierte en: n0/N = e-m. Por lo tanto el contenido cuántico (m) puede
estimarse a partir de:
m = ln(N/ n0)
donde N y n0 representan el número total de estímulos sucesivos por ensayo y
el número de veces en el cual no se observa potencial post-sináptico (falla)
ante un estímulo, respectivamente.