IA-RECAT-PT-004 Determinación de Clembuterol por Kit

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06-08-10
DETERMINACIÓN DE CLEMBUTEROL POR KIT ELISA
Versión: 03
Elaborado por: Analista de Laboratorio
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1. OBJETIVO
Determinar Clembuterol cualitativamente en muestras de orina bovina y porcina.
2. ALCANCE
El ámbito de aplicación es en orina de bovino y porcino. Este ensayo se realiza por kit ELISA. La sensibilidad
del método es de 0,40 µg/kg.
3. RESPONSABILIDAD Y AUTORIDAD
3.1. Jefe de Sección: Supervisar la ejecución y los resultados de la prueba de determinación de Clembuterol
por kit de Elisa.
3.2. Analista(s): Ejecutar la prueba de determinación de Clembuterol por kit de Elisa, según lo indique el
Registro de Distribución de Técnicas IA-RECAT-PE-004-RE-001.
4. DEFINICIONES
ELISA: Inmunoensayo para la determinación de analitos específicos que es posible adquirirlos en forma de
“kits”. Operan con base en la competencia entre el analito o su metabolito en la muestra y conjugado analitoenzima para un número limitado de sitios de unión específicos recubiertos en la microplaca.
5. ABREVIATURAS Y/O SIGLAS
IA: Inocuidad de Alimentos
RECAT: Residuos y Contaminantes en Alimentos de Origen Terrestre
PT: Procedimiento Técnico
PE: Procedimiento Específico
RE: Registro
ELISA: Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay
6. REFERENCIAS Y/O BIBLIOGRAFÍA

IA-RECAT-PT-004-RE-001 Resultados de Análisis de Clembuterol por Kit de ELISA Competitivo

IA-RECAT-PE-004-RE-001 Distribución de Técnicas

IA-RECAT-PE-002-RE-001 Resultados de Análisis

NEOGEN Corporation`s Drug Detection ELISA Kit Manual Bentley Continental (procedimiento de
referencia del método)
7. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO
7.1. Fundamento Teórico
El Clembuterol (Clenbuterol en inglés) es un fármaco comúnmente empleado en enfermedades respiratorias
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como descongestionante y broncodilatador. Es un fenilaminoetanol con propiedades adrenérgicas (figura 1).
En los años 1980, se demostró que animales alimentados con clembuterol, aumentaban la masa muscular,
disminuían el tejido graso, aunado a una disminución de la ingesta oral.
El clembuterol es empleado mundialmente en el tratamiento de alergias de caballos como broncodilatador.
Puede ser administrado por vía oral o intravenosa. Su propiedad de ganar peso, hace que su empleo sea ilegal
en la ganadería. Su efecto es anabolizante debido a que hace engordar en forma artificial el ganado. Los
residuos de Clembuterol pueden afectar las funciones de pulmón y corazón en seres humanos, que ingieren
carne o hígado de animales, a los que les ha sido administrado clembuterol. Esto se debe a que la ingesta de
carne contaminada puede fácilmente exceder las dosis médicas habituales para seres humanos, que rondan
los 40 o 60 µg/d, y que nunca deben exceder de 150 µg/d. Por lo tanto, se hace necesario el análisis de
residuos de Clembuterol, con el fin de asegurar la inocuidad de los alimentos destinados al consumo humano.
Los ensayos ELISA se basan en la competencia entre el analito o su metabolito en la muestra y conjugado
analito-enzima para un número limitado de sitios de unión específicos recubiertos en la microplaca. El
procedimiento incluye la adición de las muestras y los controles a los microplatos (pozos) recubiertos con
anticuerpo, a los cuales se les agrega posteriormente la enzima conjugada y se incuban a temperatura
ambiente y en la oscuridad. Durante la incubación el analito de la muestra y la enzima conjugada compiten por
los sitios de unión sobre el pozo recubierto de anticuerpo.
Finalizada la incubación se lavan los pozos con el buffer de lavado; una vez que el lavado ha finalizado se
agrega el Sustrato K-Blue se mezcla y se deja incubar antes de medir cada uno de los pozos por medio de un
lector. El desarrollo del color es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra o controles.
La ausencia de la droga en la muestra se traducirá en un color azul, mientras que la presencia de la droga se
traducirá en disminución de color o en la no aparición del mismo.
Figura 1. Estructura molecular del Clembuterol
7.2. Materiales, Reactivos y Equipos
7.2.1 Materiales
-
Micropipeta de (100 a 1000) µL
Micropipeta de (10 a 100) µL
Beaker de 100 mL
Pipeta multicanal
7.2.2 Reactivos
-
Buffer EIA: 40 mL
Buffer de lavado concentrado (10X):20 mL.
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Sustrato K-Blue: 20 mL. Mantener refrigerado y en la oscuridad (sensible a la luz).
Enzima conjugada 180 X
7.2.3 Equipo
- Lector óptico para ELISA con filtro de 650 nm
7.3. Equipo de Protección




Gabacha
Anteojos
Mascarilla
Guantes de nitrilo
7.4. Condiciones de Almacenamiento de Muestras
La orina debe mantenerse en refrigeración (de 0 a 5 °C) después de haber sido tomada directamente del
animal.
7.5. Técnica de Análisis
7.5.1 Determinar el número de pozos a usar de acuerdo al número de muestras, controles y blanco. Por cada
set de muestras, preparar 2 contoles del kit (positivo y negativo), 1 blanco y 2 controles fortificados.
7.5.2 Preparar la disolución de Enzima Conjugada (diluir 1 µL de la Enzima Conjugada 180 X en 180 µL de
Buffer EIA y mezclar).
Ejemplo: para 16 pozos agregar 20 µL de la Enzima Conjugada 180X en 3580 µL de Buffer EIA
(siempre se prepara calculando 2 ó 3 pozos de más).
7.5.3 Agregar 20 µL de muestra o control en los respectivos pozos.
7.5.4 Agregar 180 µL de la Enzima Conjugada diluida en cada pozo. Use una pipeta multicanales para mayor
rapidez.
7.5.5. Agitar manualmente y sobre una superficie plana el plato que contiene las muestras con cuidado.
7.5.6 Incubar el plato con las muestras a temperatura ambiente y protegido de la luz, durante 1 hora.
7.5.7 Diluir el Buffer de lavado 10 veces, Ejemplo: 20 mL de Buffer en 180 mL de agua destilada.
7.5.8 Vaciar el líquido de los pozos, una vez completada la incubación. Golpear suavemente el plato contra
una superficie cubierta con papel absorbente, con el fin de secar completamente los pozos.
7.5.9 Lavar cada pozo con 300 µL del Buffer de Lavado, repita esta acción 2 veces más, secando cada vez
por completo los pozos, tal como se detalla en el punto 7.5.8.
7.5.10 Agregar 150 µL del Sustrato K-Blue a cada pozo. Mezclar con cuidado el contenido de los pozos.
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7.5.11 Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. Mezclar el contenido de los pozos periódicamente,
sobre todo antes de llevar a cabo la lectura de la absorbancia.
7.5.12 Leer los resultados en el lector de ELISA a una longitud de onda de 650 nm (Método 22
CLEMB).
7.6. Resultados
La sensibilidad del método es 0,40 µg/kg.
Mediciones menores a 0,40 µg/kg = muestras negativas (coloración azul).
Mediciones mayores a 0,40 µg/kg = muestras positivas (Incoloras).
7.7. Reporte de Resultados
El analista anota los datos en el formulario IA-RECAT-PT-004-RE-001 Resultados de Análsis de Clembuterol
por kit de Elisa competitivo y lo guarda en el ampo respectivo. Los resultados obtenidos los presenta en el
formulario IA-RECAT-PE-002-RE-001 Resultados de Análisis, el cual es firmado y revisado por el jefe de
sección y él o el analista se le entrega a la oficinista de la sección.
8.0 ANEXOS
No Aplica.
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