Manual de toma de frotis de sangre periférica y aspirado de médula ósea

MANUAL OPERATIVO PARA EL
PROCEDIMIENTO DE LA TOMA
DE FROTIS SANGUÍNEO Y
ASPIRADO DE MÉDULA ÓSEA
JULIO DEL 2022
Azucena Cruz Balbuena
R1 PATOLOGÍA CLÍNICA
// ROTACIÓN DE HEMATOLOGÍA
EXAMEN DEL FROTIS DE
SANGRE PERIFÉRICA
Un frotis de sangre preparado en forma adecuda es esencial para asegurar la evaluación
correcta de la morfología celular. Se encuentra disponible una variedad de métodos para la
preparación y la tinción de un frotis de sangre.
PREPARACIÓN DE UN FROTIS CON LA TÉCNICA DEL
PORTAOBJETOS EN CUÑA
Materiales a necesitar:
• 2 portaobjetos de vidrio, limpios, 75x75 mm. Se recomienda el empleo de portaobjetos
para microscopía de calidad alta, con bordes biselados.
• Uno de los portaobjetos se usa como soporte del extendido sanguíneo y el otro como
portaobjetos extensor, los que luego pueden invertirse para preparar un segundo
extendido.
• Guantes estériles.
• Tinción de Wright
• Microscópio electrónico
Procedimiento:
1. Al preparar el frotis, el portaobjetos
extensor debe ser sostenido de
manera segura por delante de la
gota de sangre en un ángulo de 3545º respecto al otro portaobjetos.
2. Se coloca una gota de sangre
anticoagulada con EDTA de 3 mm
de diámetro en un extremo del
portaobjetos. El tamaño de la gota
es importante porque las gotas
grandes forman extendidos muy largos o gruesos, mientras que las gotas muy pequeñas
forman extendidos cortos o delgados.
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FIGURA 1. Técnica del portaobjetos en cuña para la preparación de un frotis de sangre periférica.
A. Ángulo correcto para sujetar el portaobjetos extensor.
B. Distribución de la sangre a lo ancho del portaobjetos.
C. Terminación del frotis con la técnica del portaobjeto en cuña.
3. El porta objetos extensor se desliza hacia atrás hasta que toma contacto con la gota de
sangre y se sostiene en esa posición hasta que la sangre se esparce por todo el ancho
del portaobjetos.
4. A continuación el extensor se desliza con rapidez y suavidd hacia el otro extremo del
portaobjetos que sirve de soporte del extendido, con lo que se crea un frotis en cuña.
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Recomendaciones:
a) Es importante que se tome y se extienda toda la gota de sangre.
b) El movimiento demasiado lento hacia delante del protaobjetos extensor acentúa la distribución
incorrecta de los leucocitos debido a que empuja células mas grandes como monocitos y
granulocitos, hacia el final y los bordes del frotis.
c) Es esencial mantener un ángulo constante entre los portaobjetos y una presión suave y uniforme.
Un frotis de sangre periférica realizado de forma correcta tiene las siguientes características:
•
•
•
•
•
•
Alrededor de 2/3 a ¾ de la longitud total del portaobjetos está cubierta por extendido.
Es ligeramente redondeado en su borde en pluma (porción mas delgada), no en forma
de bala.
Los bordes laterales del frotis deben ser visibles. La utilización de portaobjetos con
esquinas biseladas puede facilitar esta apariencia.
Es liso, sin irregularidad, agujeros o rayas.
Cuando el portaobjetos se observa a la luz, el borde en pluma del frotis debe tener una
apariencia en “arcoiris”
Se toma y se extiende la gota completa.
Zona de neutrófilos y
monocitos
Zona de linfocitos
FIGURA 2. Frotis de sangre periférica bien realizado.
R1 PC ACB
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Borde astillado
o rugoso del
portaobjetos
extensor.
No se permitió que la
sangre se distribuyera
a lo ancho del
portaobjeto antes de
que el extendido se
realice.
Vacilación en el
movimiento hacia
adelante del
portaobjetos extensor
Suciedad o grasa
sobre el
portaobjetos.
El portaobjetos
extensor es
empujado con
demasiada rapidez.
Presión despareja
sobre los lados del
portaobjetos
extensor.
La gota de sangre
es demasiado
pequeña.
Demora en la
realización del
frotis, la sangre
comenzó a secarse.
FIGURA 3. Frotis de sangre periférica inaceptables y causas.
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TINTICIÓN DEL FROTIS DE SANGRE PERIFÉRICA.
El propósito de teñir los frotis sanguíneos es identificar las células y reconocer con facilidad la
morfología a través del microscópio.
TINCIONES:
•
•
Tinción de Wright
Tinción de Wright-Giemsa
Son las más utilizadas con mayor frecuencia para el
frotis de sangre periférica o de médula ósea. Ambas
contienen eosina y azul de metileno, por lo tanto se
llaman “tinciones policrómicas”.
FIGURAS 4 Y 5. El teñido real de las células o de los componentes celulares no tiene lugar hasta que
se agrega el buffer. El azul de metileno oxidado y la eosina forman un complejo tíazina-easinato, que
tiñe las componentes neutros. El buffer que se agrega a la tinción debe ser fosfato de sodio 0,03 M
(pH 6.4) o agua destilada vieja (agua destila da guardada en una botella de vidrio durante por lo menos
24 horas; pH 6,4-6,8). Lis reacciones de tinción dependen del pH.
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RECOMENDACIONES:
A. Los frotis deben dejarse secar antes de teñirse, de lo contrario, la parte gruesa del extendido
de sangre puede desprenderse del portaobjetos durante el proceso de tinción.
B. Las células se fijan sobre el portaobjetos de vidrio con el metanol de la tinción. Las
reacciones de tinción dependen del pH. La tinción real de los componentes celulares sucede
cuando se agrega una solución amortiguadora (pH 6.4) a la tinción.
• El azul de metileno libre es básico y tiñe de azul los componentes celulares
ácidos, como el RNA.
• La eosina libre es básico y tiñe de rojo los componentes básicos, como la
hemoglobina o los gránulos eosinófilos.
• Los neutrófilos tienen gránulos citoplasmáticos que tienen pH neutro y adminen
algunas características de ambas tinciones.
CARACTERÍSTICAS DE UN FROTIS TEÑIDO DE FORMA
ADECUADA:
Los mejores resultados de la tinción se obtienen a partir de los frotis recientemente preparados
en un período de 2-3 horas de recolectada la sangre.
1.
2.
3.
4.
Los eritrocitos deben ser de color rosa a salmón.
Los núcleos son de color azul oscuro a violeta.
Los gránulos citoplasmáticos de los neutrófilos son de color lila
Los gránulos citoplasmáticos de los basófilos son de color azul oscuro a negro.
FIGURA 6. Frotis de sangre periférica teñido
de modo óptimo que demuestra el área
apropiada en la cual realizar la determinación
del recuento diferencial, la morfología de los
leucocitos y la estimación del número de
plaquetas. Se muestra solo el centro del
campo; un campo completo contendría entre
200 y 250 eritrocitos.
R1 PC ACB
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SOLUCIÓN DE PROBLEMAS PARA LOS FROTIS DE SANGRE
TEÑIDOS DE FORMA DEFECTUOSA
PRIMERA
SITUACIÓN
SEGUNDA
SITUACIÓN
PROBLEMAS
CAUSAS
• Los eritrocitos aparecen de
• El colorante o la sustancia
color gris.
amortiguadora están
demasiado alcalinos.
• Los leucocitos están
demasiado oscuros.
• Lavado inadecuado
• Los gránulos de los
• Tinción prolongada.
eosinófilos son de color gris,
• Muestra de sangre
no anaranjados.
heparinizada.
• Los eritrocitos están
• El colorante, la sustancia
demasiado pálidos o de
amortiguadora o ambos
color rojo.
están demasiado ácidos.
• Los leucocitos son apenas
• Pérdida de capacidad
visibles.
amortiguadora (tiempo
demasiado breve)
• Exceso de lavado.
EXÁMEN DEL FROTIS DE SANGRE PERIFÉRICA.
EXAMEN CON EL OBJETIVO DE 10X
•
•
•
R1 PC ACB
El examen del FS es un proceso de
varios pasos. Se comienza con el
análisis del frotis con un barrido del
portaobjetos con el objetivo de 10x.
Este paso es necesario para
determinar la calidad general del frotis,
incluida la distribución anormal de los
eritrocitos que sugiere la presencia de
rouleaux o autoaglutinación con la
presencia o no de un número
desproporcionado de grandes células
nucleadas.
Tambien se permite la rápida
detección de células anormales como
blastos, linfocitos reactivos y parásitos.
7
•
EXAMEN CON OBJETIVO DE 40X, 50X
•
•
•
Patrón en guarda griega, serpentina o “almena”
para realizar el recuento diferencial de
leucocitos.
•
•
EXAMEN CON OBJETIVO 100X
•
•
Estirpes distintas de glóbulos blancos en FSP
•
R1 PC ACB
Objetivo 40x: gran aumento seco, seco
fuerte.
Objetivo 50x: objetivo de inmersión en
aceite, es decir aumento total de 500x.
Se busca un área del frotis en la cual
los
eritrocitos
se
encuentren
uniformemente distribuidos y donde
apens se toquen unos con otros.
Se examinan de 8-10 campos en esta
área del frotis y se determina el
número promeio de leucocitos por
campo.
El recuento de leucocitos por milímetro
cúbico
puede
determinarse
al
multiplicar el número promedio de
leucocitos por campo de gran aumento
por 2000 (si se utiliza 40x) o 2500 (si
se utiliza 50x). Este estimado es una
herramienta de control de calidad útil
para validar los recuentos de
leucocitos
realizados
por
los
analizadores hematológicos.
Lo que sigue en la evaluación es
realizar el recuento diferencial de
leucocitos. Esto se efectúa en la
misma área del frotis en la que se hizo
el estimado del recuento de leucocitos,
pero utilizando el objetivo de inmersión
en aceite 100x (aumento total 1000x).
Cuando se analiza el área correcta de
un frotis de un px con recuento normal
de eritrocitos, se observan alrededor
de 200-250 eritros por campo.
El recuento diferencial incluye el
conteo y la clasificación de 100
leucocitos consecutivos y el informe
como porcentajes.
Para el recuento diferencial se utiliza
un recorrido en patrón de guarda
8
•
griega, el cual minimiza los errores de
distribución de los leucocitos.
También
se
informa
cualquier
alteración de los leucocitos que se
observe.
FIGURA 7. Morfología normal de las células sanguíneas en el frotis de sangre periférica.
Eritrocitos
Neutrófilos
Neutrófilo en banda
Eosinófilo
Plaquetas
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TOMA DE ASPIRADO Y
BIOPSIA DE MÉDULA ÓSEA
El examen de la médula ósea (MO) como “fábrica” de la hemopoyesis es una de las
herramientas diagnósticas más antiguas y útiles en el estudio de las enfermedades
hematológicas. Su objetivo es el diagnóstico, la confirmación y el estadiaje de las enfermedades
hematológicas, informar sobre el estado de la celularidad, morfología y maduración de las
células hematopoyéticas.
UTILIDAD DE LA BIOPSIA DE MÉDULA ÓSEA (MO)
Proporciona
información
cualitativa
y
semicuantitativa de los precursores de las
células sanguíneas, y permite estudios cada vez
más complejos de análisis genético y molecular.
Se puede realizar la valoración inmunocitológica
e histológica de la MO y hacer un análisis de
citometría, citogenética y molecular; que aportan
una valiosa información complementaria con
implicaciones diagnósticas y pronósticas de las enfermedades hematológicas.
El material medular aspirado extendido en portaobjetos de cristal proporciona células medulares
individuales aisladas que no han sido sujetas a un procesamiento previo ni han sido
seccionadas en cortes. Por tanto, la muestra se puede examinar con un objetivo de inmersión
en aceite para obtener una excelente valoración de los detalles citológicos. Así, el aspirado
medular es de especial valor cuando es fundamental reconocer determinadas células o unas
características citológicas anómalas o cuando es necesario reconocer, clasificar y contar células
individuales.
R1 PC ACB
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INDICACIONES DE TOMA DE ASPIRADO Y BIOPSIA.
La decisión de realizar un aspirado o biopsia de médula debe hacerse después de una
valoración completa de la historia clínica, exploración física y pruebas complementarias que
incluya un citometría hemática con extensión de sangre periférica.
Es útil en los procesos hematológicos malignos (leucemias, linfomas, síndromes
mieloproliferativos o mielodisplásicos); es obligado el estudio citológico de la MO para confirmar
la sospecha, así como el estudio con técnicas de inmunohistoquímica, inmunofenotipo,
citogenética y biología molecular para una correcta clasificación.
El aspirado es ideal para:
•
•
•
•
•
Reconocimiento celular detallado
Tipificación de blastos
Estudio del hierro medular
Parásitos unicelulares
Citoquímica, citogenética, citometría
de flujo, cultivo microbiológico.
La biopsia es ideal para:
•
•
•
•
•
•
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Reconocimiento de la estructura
general normal y sus alteraciones
Evaluación de la celularidad global y
de la grasa.
Detección e identificación de lesiones
focales (linfoma, granulomas,
metástasis de cáncer epitelial,
patrones infiltrativos en síndromes
linfoproliferativos).
Fibrosis medular (única técnica útil)
Patrones histopatológicos de
infiltración de neoplasias.
Valoración de hueso, vasos y estroma
Identificación de células mediante
inmunohistoquímica.
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INDICACIONES DE ASPIRADO Y TOMA DE BIOPSIA DE MÉDULA ÓSEA EN
DISTINTAS ENTIDADES PATOLÓGICAS:
CONTRAINDICACIONES ABSOLUTAS
•
•
•
Hemofilia
Coagulación intravascular diseminada severa
Otros trastornos de sangrado severos
** La trombocitopenia severa no es una contraindicación.
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PROCEDIMIENTO
MATERIALES:
1. Aguja de punción y de biopsia: Trocar de Jamshidi.
Las agujas deben ser gruesas y estar fabricadas de acero
inoxidable resistente; su longitud será de 7-8 cm e irán provistas de un fiador que se ajuste
perfectamente y un dispositivo de seguridad ajustable. En las agujas reutilizables la punta de la
aguja y el extremo del bisel han de mantenerse bien afilados.
En niños el calibre medio de la aguja de aspirado es de 16- 17 G y de 11 G para la biopsia.
2. Portaobjetos: varios dependiendo de la cantidad de extensiones que se quiera realizar,
por lo general alrededor de 8-10 portaobjetos.
3. Formol al 10%, para el transporte de la biopsia.
4. Lidocaina al 2%.
5. Jeringas de 10 ml y de 20 ml (dos o tres de cada una).
6. Agujas (2-3 piezas)
7. Guantes estériles (2 pares), bata y gorro desechables.
8. Varias gasas y campo ésteril.
9. Yodopovidona, torundas con alcohol.
10. Lápicero y tela adhesiva para rotular las muestras con el nombre del paciente.
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TÉCNICA:
1. Posición del paciente.
•
•
En decúbito supino en los aspirados en cresta anterior o tibia.
Decúbito lateral o prono en cresta posterior.
Colocación del paciente en decúbito prono, dejando al descubierto la zona lumbar y sacra,
delimitada con los campos estériles.
2. Colocación de bata y guantes con técnica cerrada.
3. Asepsia y antisepsia de la zona a puncionar.
Se procederá a la desinfección de la zona de la piel que se va a tocar y puncionar con una gasa
empapada en povidona yodada o clorhexidina, aplicada a la altura de ambas espinas iliacas
posterosuperiores.
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Asepsia y antisepsia.
Aplicación de 10 ml de
lidocaína intramuscular.
4. Localización de la zona a puncionar.
5. Colocación del campo ésteril alrededor del sitio de la punción.
6. Aplicación de anestésico (lidocaina al 2%) 10 ml en el sitio de la punción.
Esperar 5 minutos a que actúe.
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7. Puncionar la cresta iliaca.
Con un movimiento perforante, introducir la aguja perpendicularmente en la cavidad del ilion en
el centro de la espina ilíaca oval posterosuperior o 2 cm posterior y 2 cm inferior a la espina
ilíaca anterosuperior.
Cuando se haya penetrado en el hueso retirar el fiador, conectar una jeringa de 10 ml y aspirar
el contenido medular (0.5 a 1 ml de sangre) para realizar las extensiones.
Punción de la cresta iliaca anterosuperior.
Punción de la cresta iliaca posteriosuperior.
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Sacar la aguja y presionar sobre la zona hasta que deje de sangrar.
8. Colocación de la sangre del aspirado en las laminillas (portaobjetos).
Como la médula ósea se coagula más rápidamente que la sangre periférica, hay que realizar
las extensiones del material aspirado sin demora a la cabecera del paciente. El resto del material
se puede dejar en un tubo que contenga una cantidad apropiada de anticoagulante a base de
ácido etilen- diaminotetraacético (EDTA) y utilizarlo más tarde para hacer más extensiones.
Si hay que hacer estudios citogenéticos o de inmunofenotipado, se puede utilizar heparina sin
conservante en lugar del EDTA. Parte del material puede conservarse con fijador en vez de
anticoagulante para la preparación de cortes histológicos.
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Si nos hemos encontrado sin material por aspiración («aspirado seco»), insertar el fiador en la
aguja y empujar cualquier partícula de material en la luz de esta sobre un portaobjetos y realizar
la extensión; en los linfomas, y en los carcinomas sobre todo, este método permite obtener
material suficiente para hacer un diagnóstico.
Las preparaciones por aplastamiento de grumos medulares contra el portaobjetos pueden ser
útiles como complemento de las extensiones de médula ósea; este tipo de preparación debe
hacerse con cada aspirado medular.
9. Toma de biopsia de médula ósea.
•
•
•
•
•
Para la biopsia el procedimiento inicial es el mismo. Una vez extraído el fiador, se introduce
la aguja unos 2 cm más para obtener el cilindro óseo.
A continuación hay que separar el cilindro mediante movimientos giratorios completos hasta
notar que queda suelto y avanzar 2-3 mm más, para empujar el cilindro hacia dentro.
Luego se retira igual que se introdujo, con movimientos giratorios pequeños sujetando la piel.
Una vez fuera, se coloca el protector y empuja el cilindro con el extractor desde la punta
hasta el mango.
Presionar sobre la zona de punción igual que en el aspirado.
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•
•
•
Antes de introducir el cilindro en el líquido de fijación, hacer 2- 3 improntas rodando el cilindro
sobre un portaobjetos. Esto es útil en el aspirado seco o la infiltración metastásica por tumor
sólido.
Para una adecuada interpretación histológica, el cilindro debe incluir al menos 5 mm de
cavidad medular.
Coloque la muestra del hueso en la solución conservante (formol).
Para una adecuada interpretación histológica, el cilindro debe incluir al menos 5 mm de cavidad
medular.
Son inapropiadas las muestras que contienen hueso cortical, músculo o cartílago con poca o
nula MO.
Con un cilindro de 20 mm se podría obviar la biopsia contralateral en la evaluación de pacientes
con metástasis en MO.
10.
Fin del procedimiento.
Al paciente se le aplicará un apósito estéril, que deberá tapar la
zona puncionada durante 72 horas, permaneciendo seco y
cambiándoselo por otro apósito estéril cuando se duche en este
tiempo.
Asimismo, debe guardar reposo en las 12-24 horas siguientes,
para evitar sangrados diferidos, y tomar algún analgésico de
tipo paracetamol.
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COMPLICACIONES DEL PROCEDIMIENTO:
No tiene prácticamente contra- indicaciones, a excepción de pacientes con trombopatías o
coagulopatías graves.
En caso de pacientes que estén tomando antiagregantes (ácido acetilsalicílico, clopidogrel,
etc.), estos deben suspenderse un tiempo prudencial antes de la realización de la BMO,
generalmente 4-5 días; si el paciente toma anticoagulantes orales clásicos (acenocumarol,
warfarina) o nuevos anticoagulantes orales de acción directa, bastará con que los suspenda
desde el día antes.
En la mayor parte de las ocasiones las molestias son muy leves y mayormente relacionadas
con la “quemazón” que provoca el anestésico local, el sangrado en el punto de punción.
El dolor puede persistir uno o varios días, sobre todo dependiendo de lo “limpia” y poco
dificultosa que haya sido la prueba.
La complicación más frecuente y generalmente más seria es la hemorragia. Entre los factores
de riesgo asociados a una mayor probabilidad de sangrar de forma grave se encuentran el
diagnóstico de una enfermedad mieloproliferativa crónica, el tratamiento con ácido
acetilsalicílico y la existencia de una trombopatía o de trombopenia de otra naturaleza.
La infección en el lugar de punción es una complicación rara y generalmente se relaciona con
neutropenia o disfunción de los neutrófilos.
BIBLIOGRAFÍA.
1. Bain, B. J., Bates, I., Laffan, M. A., & Edicion, S. D. L. (2018). Dacie y Lewis. Hematología práctica (12.a
ed.). Elsevier.
2. Delgado, J. G. R. (2021). Fundamentos De Hematología (6.a ed.). Editorial Médica Panamericana S.A. de
C.V.
3. Gómez, J. J. D., Salamanca, J. R. G., & Hernández, G. A. (2018). ABC de los procedimientos médicos
básicos: Una guía de aprendizaje y enseñanza para profesionales de medicina. Universidad Nacional de
Colombia.
4. Rodak, B. F., & Carr, J. H. (2017). Atlas De Hematología Clínica (5.a ed.). Editorial Médica Panamericana.
5. Rodak, B., Fritsma, G. A., & Keohane, E. M. (2014). Hematología: Fundamentos y aplicaciones clínicas
(4.a ed.). Editorial Médica Panamericana
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