Anapsos y Citocinas: Estudio In Vitro

Efecto de anapsos ·(Polypodium leucotomos)
sobre la producción in vitro
de citocinas en células mononucleares
de sangre periférica humana
l . Introducción
11. Material y� métodos
ug/ml. Como control de la proliferación; se
utilizaron células conteniendo sólo medio
Anapsos (Calaguala; Polypodium Leu-
-
de cultivo. Las células se incubaron a conti­
Preparación del extracto
nuación en estufa de cultivo, durante 3 días
cotamos) es un helecho típico de determina­
das zonas de Centroamérica, siendo utiliza­
dos sus rizomas en el tratamiento de enfer­
medades cutáneas como el psoriasis y la der­
matitis atópica. Sus efectos clínicos han sido
confirmados y documentados en ensayos clí­
nicos abiertos y doble-ciego controlados con
Los rizomas del polipodium leucotomos
a 37°C y 5% de C02; 1 8-20 horas antes de
fueron recolectados en las Plantaciones
finalizar el cultivo, se incorporó al medio 1
Experimentales y de Recuperación Ecoló­
uCi de 3 [H] -Timidina (AMERSHAM).
de altitud (propiedad de ASAC Pharma-ceu­
tical International). Una vez examinados
un contador beta y expresada en c. p.m . .
do oralmente a los pacientes, y hasta el
por la · Universidad de San Carlos de
Guatemala, los rizomas ·fueron deshidrata­
momento sólo han sido observados efectos
dos a 50° e durante 48 horas, sumergidos y
secúndarios menores como gastralgias ( 1 -3).
macerados con disolventes polares durante
un grupo placebo. El extracto. es administra­
Finalmente las células fueron recolectadas
en el Harvester y la proliferación, medida en
gica de Guatemala, situada a 2000 metros
Determinación de ci�oninas
Las células se sembraron a l x l 06/ml en pla­
Los primeros estudios del producto
8 horas. El extracto obtenido, fue filtrado,
cas (COSTAR) de 12 pocillos, a razón de 1
demostraron un efecto antitumoral (4).
liofilizado y cedido por ASAC para el pre-
mllpocillo. La estimulación se realizó con LPS
Otros autores confirmaron su efecto antine­
sente trabajo.
con �eceptores citoplasmáticos similar a la
Muestra del estudio
(20 ug/ml) y/o PHA (4 ug/ml) y/o Anapsos
( 1 50 ug/ml). Se utilizó esta dosis de Anapsos
oplásico, atribuyénrlolo a una interacción
ejercida por los glucocorticoides (5).
Estudios "irí vivo" e "in vitro" en sujetos
porque resultó ser la dosis óptima. Las células
se incubaron en estufa (37°C, 5% de C02) y se
realizó una cinética completa de cada una de
Las células mononucleares se obtuvieron
sanos demuestran que Anapsos posee, ade­
por centrifugación en gradiente de densidad
las citocinas (a las O, 1 2, 24, 48, 72 y 96 horas),
más, efectos inmunomoduladores. Así, la
(Ficoll Hypaque) de un grupo de donantes
para cada una de las condiciones de estimula­
administración de Anapsos por vía oral
sanos de ambos sexos, con edades compren­
aumenta el índice de supresión, la respues�
didas entre los 21 y 35 años.
ción. Tras centrifugar los medios, se recolecta­
ron los sobrenadantes en viales de congela­
ción ( 1 ml/viq.l) y se guardaron en congelador
ta linfoblástica a mitógenos, los niveles ·
séricos de inmunoglobulinas y la propor­
ción de_ células T OKT 8+ (supresoras cito­
a �70°C, hasta su ulterior procesamiento. Las
Condiciones de cultivo
Citocinas medidas fueron la lnterleuquina- 1 Las células separ�adas fueron ajustadas a
Beta oi- 1 b) , Factor de necrosis tumoral-alfa
(6). Otros estudios refieren éste efect?
I X 106/ml con medio de cultivo RPMI 1 640
inmunomodulador del producto ·en diferen­
(WHITAKER), suplementado con 10% de
Gamma (INF-g), lnterleuquina- 4 (IL-4) e
tóxicas), de un modo tiempo-dependiente
tes patologías (7 ,8).
Otros autores han comprobado que este
(GIBCO).
dulando la producción de IL- 1 b, IL-2 y
Respuesta proliferativa frente a mitógenos
TNF-a en el sistema nervioso central (SNC)
de ratas y mejorando la coordinación psi ca­
motora (9, 1 0).
lnterleuquina- 1 O (IL- 10) y su dete�rninación se
suero de ternera fetal (FLOW), 1 % de anti-
realizó mediante ELISA (RD Diagnostics).
. biótico (GIBCO) y 1 % de Glutamina
compuesto actúa como potencial agente
neurotrófico y neuroinmunoregulador, mo­
(TNF-a), lnterleuquina-2 (IL-2), Interferón­
Estadística
·
En el análisis estadístico se emplearon los
Las células se sembraron por triplicado en
coeficientes de correlación lineal y la t­
placas de 96 pocillos (NUNC) de fondo
Student para datos pareados.
del producto d�sde un punto de vista in­
ullpocillo) y estimuladas con 0,5 ug/ml de
111. Resultados
munológico que nos permitiera hallar un
Fitohemaglutinina (PHA) o 4 ug/ml de
nexo coni.ún capaz de jústificar la mayor
Pokeweed (PWM), con y sin Anapsos
En un intento de ahondar en la actuación
parte de sus efectos, decidimos testar la
_capacidad inmunomoduladora de dicha
sustancia "in vitro': .
38
plano, a razón de 2X l 05/pocillo (200
(ANP), así como con Anapsos solo. Las
dosis de Anapsos utilizadas en todos los
casos fueron d� 75, 1 50, 500, 1 500 y 4500
NATURA MEDICATRIX n.• 49 Invierno 1 998
Cuando las células se estimularon con
Anapsos solo, se observó un aumento esta­
dísticamente significativo en la prolife­
ración, con las concentraciones de . 75
(p=O.O 1 3 ) y 1 5 0 ug/ml (p=0.0 1 7) vs . control
(Figura l ); dichas concentraciones coinci­
den respectivamente con las dosis terapéuti­
cas del producto. Dicho incremento quedó
enmascarado cua·ndo las células · fueron
simultáneamente estimuladas con los mitó­
genos PHA o PWM (datos no mostrados).
La viabilidad celular fue buena en todos los
casos (>90%), salvo con la concentración
más alta de Anapsos (4500 ug/ml).
Los niveles de lL- l b de células estimula­
das con LPS+PHA, fueron siempre inferio­
res a los producidos p or células estimuladas
solo con LPS, aunque sólo-a las 1 2 horas de
cultivo las diferencias fueron estadística-
. mente significativas (798+6'Z_ pg/ml vs.
l 04 1 +98) (p<0.05). También se aprecia en
estas primeras 12 horas, una reducción esta­
nas para las distintas condiciones de estimu­
dísticamente significativa en los niveles de
lación, quedan reflejadas en la Tabla I.
IL- 1 b en el grupo de células estimuladas
con LPS+ANP versus LPS (p<0.025). Del
mismo modo, pudimos observar un retraso
IV· Discusión
munes se han asociado con· producción
excesiva "in vitro" de citocinas inflamato­
rias como la IL- 1 b y el TNF-a; y otras enfer­
medades como el SIDA o el lupus eritema­
toso sistémico, se han asociado con una pro­
de 1 2 horas en la síntesis y/o libyración de
Las citocinas son glicoproteínas general­
IL- 1 b cuando las células fueron estimuladas
mente secretadas por los leucocitos, que
median respue.stas del huesped frente a estí­
con Anapsos, con un máximo de producción
a las 24 horas de cultivo. Las células estimu­
mulos inflamatorios y/o infecciosos. Su
ladas sólo con LPS y/o LPS+PHA alcanza­
papel en la respuesta inmunitaria se conoce
ron este máximo a las 1 2 horas (Figura 2.A).
Cuando las células fueron estimuladas
desde hace tiempo ( 1 1 ). Así, citocinas como
producción de IL-2 fue practicamente idén- ·
papel en la regulación de las funciones celu­
con LPS+PHA, la cinética de la curva de
la IL- l b o el TNF-a, j uegan un importante
tica a la obtenida con LPS solo. Sin embar­
lares ( 1 2), compartiendo multitud de efectos
go, la adición de Anapsos a LPS+PHA, pro­
dujo siempre un incremento significativo en
( 1 3- 1 5 ) .
Se ha propuesto una subdivisión de los
los niveles de dicha citocina (Figura 2.B) . .
La estimulación con LPS+PHA se tradu­
linfocitos T CD4+ de ratón, basada en dife­
rencias en sus · patrones de producción de
niveles de INF-g, si se comparaban con los
TH l , sintetizan y secretan entre otras citoci­
citocinas. Hoy sé acepta que los clones
jo en un incremento significativo ·en · los
ducción disminuída de citocinas TH l -like
· como la IL-2 y el INF-g ( 1 9-22).
"In vitro", PBMNc de controles sanos
estimuladas con ConA demostraron que
dosis altas de Anapsos_añadidas al cultivo,
producían una supresión de la proliferación,
una_ inhibición en la secreción de IL-2 y un
incremento en la secreción de diversas
monocinas, todo ello de forma dosis-depen­
diente (23) .
Nosotros demostramos que Anapsos "in
vitro" a dosis terapéuticas, es capaz de esti­
mular la proliferación de PBMNc, de dismi­
nuir la secreción de IL- 1 b y, por el contra­
rio, de aumentar la de IL-2. Estos resulta­
obtenidos al estimular las células con LPS
nas IL-2 e INF-g, pero no IL-4 ni IL-5,
dos, en principio contradictorios con los del
solo. Cu.ando a LPS+PHA también se aña.óió
Anapsos, dichas diferencias aumentaron,
otras IL-4, IL�5, IL-6 e IL- 1 O pero no IL-2
básicamente a diferencias metodológicas.
mientras que los clones TH2 producen entre
estudio previo, creemos pueden ser debidos
De hecho, cuando nosotros utilizamos dosis
alcanzando una mayor significación (Figura
2.C} a partir de las 24 horas de cultivo.
ni INF-g; una tercera subpoblación de linfo­
citos T (THO), sintetiza un patrón mixto de
siempre un incremento significativo en los
aislado clones de linfoc-itos T humanos,
similares a los THO, TH l y TH2 del ratón.
aunque en ningún caso llega a ser significa­
añadir Anapsos a LPS y/o LPS+PHA, se
Algunos de estos autores han comprobado
efecto incrementador sobre la proliferación
además que dichos patrones pueden acumu­
se hizo evidente cuando las células fueron
de pacientes con distintas enfermedades. La
subpoblación TH l represe nta a las células
lación eón otros mitógenos. La cinética de
dichas citocinas ( 1 6) . Diversos autores han
La estimulación con LPS+PHA produjo
niveles de la IL- 1 0 versus LPS solo. Tras
produjo igualmente un incremento en los
larse en los tejidos o en la sangre periférica
niveles de dicha citocina, que en el caso del
LPS+PHA se tradujo a partir de las 24 horas
de cultivo, en un nivel de significación
·
s up eriore s también observamos una tenden­
cia a a la disminución en la proliferación,
tiva (datos no mostrados). Por otro lado, el
estimuladas sólo con Anapsos, quedando
dicho efecto enmascarado por la coestimu­
efectoras más importantes en reacciones
producción de citocirias del presente estu­
Los niveles ..obtenidos de IL-4 y TNF-a
para las distintas condiciones de estimula­
hipersensibilidad retardada, pero con baja
Anapsos -retrasa la máxima secreción de IL-
ción, fueron practicamer¡te idénticas, no
cional de la mayor parte de los clones TH2,
nos solos, lo que concuerda con estudios
· mayor (vs. LPS) que el obtenido al añadir la
PHA al LPS (Figura 2.D).
existiendo en ningún caso diferencias signi­
ficativas entre ellas (datos no mostrados)
Las principales correlaciones entre citoci-
inflamatorias asociadas a respuestás de
producción de anticuerpos. El fenotipo fun­
dio, demuestra que la coestimulación con
1 b, respecto de la estimulación con mitóge­
se asocia a producción persistente de an­
ticuerpos (incluyendo IgE) y eosinotllia
realizados "in vivo" con el producto (9, 1 0) .
E l hecho d e que Anapsos pueda ser capaz
( 1 7, 1 8) . Numerosas enfermedades autoin�
de bloquear la producción o la liberación dé
NATURA MEDICATRIX n.' 49 Invierno 1 998
39
·citocinas inflamatorias como la IL- l b,
F.J. "Comunicación . sobre un nuevo tratamiento
efectuado con 130 niñ.os
puede resultar de interés para explicar los
efectos
observados
empíricamente
en
- pacientes con psoriasis (24). Se ha demos�
trado el papel que niveles aumentados de
IL- 1 b y/o TNF-a, juegan en la patogenia de
afectados
de dermatitis
así como él papel terapéutico de agentes
anti-nflamatorios no esteroideos en estas
enfermedades (28). Del mismo modo, los
efectos observados con Anapsos sobre la IL1 b pueden j ustificar la act.ividad colageno­
poyética del producto (29,30), pues es sabi­
do que citocinas como la IL-1 a, la IL- 1 b y el
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se compara con LPS solo, y aumenta la pro­
ducción de INF-g si se compara con PHA
sola (32). AnapsQs es capaz de potenciar el
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IL- 1 0 apoyan respectivamente los resulta­
9.-
dos obtenidos in vivo de su actividad antiví­
rica y estimulante cÍe la respuesta humoral
(6,33-35). Estos efectos se verían· reforzados
por su acción incrementadora de la IL-2.
Basándonos en los resultados de las dis­
tintas cmrelaciones del presente estudio,
concluímos que Anapsos ejerce un efecto
opuesto e independiente sobre la IL- 1 b y la
IL-2, así como entre la IL- 1 b y· el INF-g y l a
IL- 1 b e IL- 1 O . S i n embargo ejerce u n efecto
en
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