UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD CARRERA DE LABORATORIO CLÍNICO PERÍODO ACADÉMICO ASIGNATURA NOMBRE DEL DOCENTE NÚMERO DE PRÁCTICA GUÍA DE PRÁCTICA DE LABORATORIO Noviembre 2020 – abril 2021 MICRORIBOLOGIA Ing. Félix Falconí O., Mgs. 1 FECHA: SEMESTRE: 23/11/2020 TERCERO HORA: PARALELO: 07H00 - 10H00 DURACIÓN: A 3 horas NOMBRE DE LOS ESTUDIANTES. GRUPO 1 GRUPO 2 ALAVA ALEMAN JEAN CARLOS ALBUJA DAQUILEMA KEVIN DANIEL ALLAICA AGUALSACA ROCIO MARGARITA ALLAUCA PAGUAY YESENIA LISSETH AMORES GARZON JONATHAN ISRAEL ANDAGANA TORRES JUAN CARLOS CACOANGO SANTIAGO CHRISTIAN LIZANDRO CALDERON BONILLA LUIS ALEJANDRO CAPUSAY YANTALEMA HECTOR RODRIGO CASTELO NARANJO JOHAN SEBASTIAN CEVALLOS ARROBA ERICK LIVERMAN CHICAIZA SALAZAR ESTHELA VALERIA CHIMBORAZO PUNINA FREDDY MICHAEL CURI YANCHALUIZA JEFFERSON MEDARDO DELGADO MOREIRA JHON JAIRO EUGENIO EUGENIO KATHHERIN DANIELA FREIRE ALDAS MARIA FERNANDA GUAMAN CORO JULIETH MISHEL GUASHPA CAIZAGUANO EDWIN JOEL GUILCAPI PILCO DANIELA MONSERRATH 21. HURTADO RAMIREZ SILVIA ALEXANDRA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. LUGAR DE LA PRÁCTICA TÍTULO DE LA UNIDAD TEMA DE LA PRÁCTICA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. INCA ESCOBAR ANDREA DE LOS ANGELES JAYA ABARCA TATIANA ELIZABETH LAICA TULMO ERIKA TATIANA LEMA GIMENES LESLY LUDWUTKA NUÑEZ RAMIREZ CARLOS DANIEL ÑAMIÑA RODRIGUEZ JERY DAVID OÑA MOLINA FERNANDA MISHELL PEÑAFIEL GILCES MANUEL GUILLERMO ROBALINO BAZURTO BELEN SALOME SALGUERO ABARCA JOSELYN KARINA SANMARTIN CEPEDA JEAN CARLO SILVA MOROCHO GENARO ISRAEL TAPIA ALARCON JACQUELIN FERNANDA TAPIA VARGAS JHOANA LISBETT TENE GUALLI DAYANA MISHEL TIBALOMBO CHELA LUIS PATRICIO TISALEMA TISALEMA MARIO SANTIAGO TITUAÑA CUJANO FRANKLIN DANILO VILLA PRADO JUAN CARLOS ZUÑIGA ECHEVERRIA LIZBETH TATIANA LAB. E302 laboratorio de Microbiología INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA Reconocimiento del laboratorio de microbiología. Normas, manejo y bioseguridad: Encuadre Pedagógico de la práctica. Reconocimiento e Identificación de Equipos, materiales, reactivos, utilizados en microbiología. Normas y Niveles de bioseguridad. SubTema: Métodos de esterilización. Uso del autoclave. RESULTADO DE APRENDIZAJE. Aplica los fundamentos de la microbiología, mediante la aplicación de los conocimientos teóricos adquiridos en las actividades prácticas que en ella se realizan, para su desempeño en el rol del día. OBJETIVO GENERAL Adquirir destrezas mediante la observación, revisión del área de microbiología y uso del esterilizador, para fortalecer el conocimiento relacionado a la bioseguridad en el uso de un laboratorio de microbiología Objetivos específicos Exponer la importancia de las normas de bioseguridad Reconocer la importancia de la esterilización en trabajos microbiológicos FUNDAMENTO TEÓRICO: A partir del año 1913, se incluyen por primera vez prácticas de seguridad para el laboratorio de microbiología. Estas pautas, se ampliaron en el siglo XXI, hasta incluir no sólo la manipulación adecuada de los materiales biológicos peligrosos hallados al procesar las muestras o manipular microorganismos infecciosos, sino también seguridad en caso de incendio o problemas eléctricos, la manipulación, el almacenamiento y la eliminación de compuestos químicos y sustancias radiactivas. Por lo que ya desde 1983 se cuenta con manuales de seguridad de laboratorio para aplicar estos conceptos de protección integral para la manipulación sin riesgo de microorganismos patógenos en los laboratorios (Organización Mundial de la Salud, OMS 1983), Este espacio de orientación tiene como propósito asegurar que los conocimientos en bioseguridad se apliquen en las prácticas de microbiología. Bioseguridad: Se define como una conducta que aplica un conjunto de medidas preventivas, destinadas a mantener el control de factores de riesgo laborales procedentes de agentes biológicos, físicos o químicos, logrando la prevención de impactos nocivos, asegurando que el desarrollo o producto final de dichos procedimientos no atenten contra la salud y seguridad de trabajadores de la salud, estudiantes, pacientes, visitantes y el medio ambiente. En cambio, la «protección biológica» se refiere a las medidas de protección de la institución y del personal destinadas a reducir el riesgo de pérdida, robo, uso incorrecto, desviaciones o liberación intencional de patógenos o toxinas. PRINCIPIOS BÁSICOS DE BIOSEGURIDAD: La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de manipulación a la que es sometido. La seguridad se considera una parte tan integral de los servicios generales, normas están destinadas a mantener el control de los factores de riesgo, tanto químicos, físicos, orgánicos, psicológicos, ambientales, biológicos, ergonómicos y de seguridad, los cuales atentan contra la salud de las personas que trabajan en el laboratorio. a).- USO DE BARRERAS O EQUIPO DE PROTECCIÓN Las barreras físicas paras las infecciones en el laboratorio pueden clasificarse en personales o institucionales. Las barreras personales son: la higiene personal y el equipo de protección con guantes, protección ocular y mascarilla, protección corporal con mandil, mandilón, gorras y zapatos. Mientras que las barreras institucionales comprenden al equipamiento que mitigue el contacto directo con los patógenos Ej: cámara de flujo laminar, cabina de bioseguridad. b).- ELIMINACIÓN DE DESECHOS Elementos, sustancias, compuestos, residuos o mezclas de ellos que, independientemente de su estado físico, representen un riesgo para el ambiente, la salud o los recursos naturales, por sus características corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas, inflamables y biológico infecciosas (CRETIB). Se conciben los residuos como: Residuos No Peligrosos, Residuos Peligrosos, y éstos a su vez tienen un impacto ambiental: Calidad del agua, Calidad del suelo y Calidad del aire. Residuos no peligrosos: Son aquellos producidos por el generador en cualquier lugar y en desarrollo de su actividad, que no presenta ningún riesgo para la salud humana y/o el medio ambiente; se consideran en este grupo los residuos biodegradables, reciclables, inertes y ordinarios o comunes. Residuos peligrosos: Son aquellos residuos producidos por el generador con algunas de las siguientes características: infecciosas, combustibles, inflamables, explosivas, reactivas, radioactivas, volátiles, corrosivas y/o tóxicas, que pueden causar daño a la salud humana y/o al medio ambiente. Así mismo se consideran peligrosos los envases, empaques y embalajes que hayan estado en contacto con ellos. Para el manejo, tratamiento y eliminación de residuos generados en los laboratorios y talleres, son utilizados varios métodos, entre los cuales se pueden observar: Enterrarlos (Terraplenes de seguridad), Incineración, Reciclaje, Almacenajes de larga duración, Tratamientos Físicos, Tratamientos Químicos y/o Biológicos. c).- AGENTES BIOLÓGICOS Los agentes biológicos constituyen un factor de riesgo laboral por su capacidad de desencadenar enfermedades, tanto profesionales como del trabajo, los AGENTES BIOLÓGICOS se definen como: "microorganismos, con inclusión de los genéticamente modificados, cultivos celulares y endoparásitos humanos, susceptibles de originar cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad". A su vez, se entiende como microorganismo, toda entidad microbiológica, celular o no, capaz de reproducirse o de transferir material genético. Por su parte, cultivo celular es el resultado del crecimiento in vitro de células obtenidas de organismos multicelulares. INDICACIONES PARA PROTECCIÓN POR NIVELES DE LABORATORIO. En este sentido, el diseño y medios de contención biológica de los laboratorios se orientarán en función de los cuatro grupos de riesgo citados en el punto anterior, es decir: NIVEL DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA 1, para microorganismos del grupo de riesgo 1. NIVEL DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA 2, para microorganismos del grupo de riesgo 2. NIVEL DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA 3, para microorganismos del grupo de riesgo 3. NIVEL DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA 4, para microorganismos del grupo de riesgo 4. 1. Básico Enseñanza básica, mesa de laboratorio al descubierto y lavabo superior. 2. Básico Servicios de nivel de seguridad, ropa Trabajo en mesa al Nivel 2 atención primaria; protectora; descubierto y CSB* diagnóstico, señal de riesgo para posibles investigaciones biológico aerosoles. *CSB: Cabinas de seguridad 3. Contención Diagnóstico Prácticas de nivel 2 CSB I o II además de otros Nivel 3 especial, más ropa especial, medios de contención investigación acceso controlado primaria para todas y flujo direccional las actividades del aire 4. Contención Unidades de Prácticas de nivel 3 CSB de clase III o trajes máxima patógenos más cámara de presurizados junto Nivel 4 peligrosos entrada con cierre con CSB de clase II, hermético, salida con autoclave de doble ducha y eliminación puerta (a través de la especial de residuos. En el laboratorio de Microbiología disponemos de varios implementos, que son detallados a continuación: • Frascos tapa rosca, que contienen los medios de cultivo en polvo para preparar • Cajas petri estériles, tienen la capacidad para 15 ml de medio de cultivo aproximadamente, en el cual al ser sembrado crecen los microorganismos, se incuba en posición invertida. • Asas de inoculación, compuestas de mango y filamento de platino o nicromo que terminan en aguja o aro calibrado para tomar volúmenes de 0,01 y 0,001 ml. • Aplicadores de algodón estériles, que sirven para tomar la muestra. • Mechero Bunsen, encargado de suministrar la fuente de calor durante las siembras, además de esterilizar las asas para transferir cultivos vivos de un recipiente a otro. • Placas portaobjetos y laminillas cubreobjetos, para llevar a cabo los frotis y su observación microscópica. Por todo lo descrito los agentes biológicos se clasifican en: Grupo 1: poco probable de causar enfermedad en el hombre. Grupo 2: puede causar enfermedad en el hombre supone un peligro para los estudiantes, trabajadores e instructores, poca probabilidad que se propague a la comunidad. Existe profilaxis y tratamiento eficaz. Grupo 2: Puede causar enfermedad grave en el hombre y presentar un serio riesgo para los estudiantes, trabajadores e instructores, con riesgo de propagación a la colectividad. Existe profilaxis y tratamiento eficaz. Grupo 4: El que causa enfermedad grave en el hombre supone un serio riesgo para los estudiantes, trabajadores e instructores con mucha probabilidad que se propague a la comunidad. No hay profilaxis ni tratamiento eficaz. MEDIDAS DE PREVENCIÓN Y BIOSEGURIDAD EN LAS PRÁCTICAS. La bioseguridad es una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y conductas que disminuyen el riesgo de los estudiantes, trabajadores e instructores en cuanto a su salud, de adquirir infecciones en el laboratorio. El conocimiento y la aplicación adecuada de estas normas como la utilización de bata, guantes, tapabocas, entre otros; Así como la importancia de estas normas antes, durante y después de cada práctica es un deber de cada estudiante en el laboratorio donde se esté desenvolviendo. Lavado de manos Existen dos tipos de lavado de manos, el clínico y el quirúrgico. Esta vez nos enfocaremos en el clínico que será el que se realice en el Laboratorio Docente con más frecuencia Es la medida más económica sencilla y eficaz, para prevenir infecciones intrahospitalarias, ya que en las manos se transportan todo tipo de bacterias, tanto flora residente como transitoria. La técnica para el lavado de manos es: Abrir el chorro de agua y humedecer las manos hasta las muñecas, Tomar el jabón líquido o en barra y frotarlo hasta generar espuma primero en las palmas de distal a proximal, luego en los espacios interdigitales de arriba abajo la palma derecha con dorso izquierdo y vísceras, después espacio interdigital palma con palma y frotar pulgar. Luego las yemas de los dedos de mano izquierda en palma derecha y viceversa, por último, frotar las muñecas. Secarse con papel desechable y luego con el mismo cerrar la llave y eliminar en el tacho correspondiente Todo esto en aproximadamente 60 segundos Uso de guantes: Reduce el riesgo de contaminación de microorganismos en estudiantes, trabajadores e instructores. El uso de guantes nunca debe sustituir el lavado de manos Uso de mascarilla y lentes de protección: Es importante colocar la máscara antes de calzar los guantes. Asegurar bien la máscara colocando las tiras elásticas alrededor de las orejas, atando las tiras elásticas alrededor de la cabeza o atándola firmemente a la cara utilizando los cabos que pasan alrededor de la cabeza y el cuello. Doblar el accesorio metálico de la nariz sobre el puente de la misma para que exista una unión más firme y minimizar el espacio entre la máscara y la nariz. Manejo de material corto punzante: Se debe contar con contenedores de material irrompible e imperforable, donde se deberán desechar todas las agujas, hojas de bisturí, restos de ampolletas de cristal, baja lenguas, etc. Un punto primordial al inicio del trabajo experimental es conocer y aplicar las reglas generales de seguridad e higiene que deben cumplirse con la finalidad de salvaguardar la integridad y seguridad del personal que ahí labora. En el caso del área microbiológica el objeto de estudio son seres vivos que no se puede percibir a través de nuestros sentidos y muchos de ellos pueden ser agentes causantes de enfermedades. EL MECHERO DE BUNSEN La llama más utilizada en el laboratorio es la producida por la combustión de un gas (propano, butano o gas ciudad), con el oxígeno del aire. La combustión completa (con exceso de oxígeno) produce agua y dióxido de carbono, una llama poco luminosa y de gran poder calorífico. La combustión incompleta produce, además de dióxido de carbono y agua, carbono, monóxido de carbono y otros productos intermedios, da origen a llamas de bajo poder calorífico y altamente luminoso (debido a la incandescencia de las partículas de carbono que se producen). Para controlar las llamas se utiliza el mechero de laboratorio que, a pesar de existir diversos tipos, el mecanismo de funcionamiento es similar en todos ellos. Esencialmente constan de un tubo, llamado cañón, a cuya base llega la entrada de gas a través de un pequeño orificio (chiclé). En esta zona existen unas aberturas, regulables mediante una anilla (virola), que permiten la entrada del aire al cañón. La expansión del gas a través del pequeño orificio succiona el aire exterior produciéndose, de este modo, una mezcla gas-oxígeno que asciende por el cañón hasta la boca del mismo que es donde se produce la llama. 1 Cañon, 2 pie, 3 Virola, 4 Chiclé, 5 Entrada de gas, 6 llave. Sosteniendo con unas pinzas una cápsula de porcelana en la parte superior de la llama producida con la entrada de aire cerrada, se observa un ennegrecimiento producido por el depósito de carbón, lo que indica que la combustión es incompleta. Sosteniendo con unas pinzas una cápsula de porcelana en la parte superior de la llama producida con la entrada de aire abierta, se observa el depósito de pequeñas gotitas de agua, lo que indica la combustión completa del gas a dióxido de carbono y agua. Si el mechero arde con la entrada de aire cerrada, la combustión es incompleta y la llama presenta un color anaranjado debido a la presencia de partículas incandescentes de carbono. Al abrir el paso de aire, la combustión es completa y en la llama se aprecian dos zonas claramente separadas por un cono azul pálido. En el exterior del cono la combustión es completa, existe un exceso de oxígeno y se producen altas temperaturas (zona oxidante). En el interior del cono los gases todavía no se han inflamado y en el cono mismo hay zonas donde la combustión no es todavía completa y existen gases no oxidados a dióxido de carbono y agua por lo que se tiene una zona reductora de la llama. Para obtener mayor temperatura, abrir más el flujo de gas y la entrada de aire. Para la limpieza del material microbiológico ya usado hay que precautelarse de que primero debe esterilizarse por autoclave, así podremos posteriormente desechar material inocuo y además evitamos posibles contagios con los microrganismos que se haya estado trabajando. De igual modo si la indumentaria se ha contaminado se debe esterilizar primero antes de proceder a lavarLos microorganismos pueden producir enfermedades cuando infectan personas, animales y plantas y cuya gravedad oscila entre una infección débil, intoxicación e incluso la muerte. Pueden contaminar los alimentos y producir cambios físicos y químicos en ellos, haciéndolos en algunos casos incomibles e incluso venenosos. Los microorganismos son responsables también de la alteración de muchos otros materiales, generando graves pérdidas económicas. Por ello es indispensable disponer de procedimientos para controlar la contaminación y el crecimiento microbiano. Las principales razones para controlar la contaminación y el crecimiento microbiano. Las principales razones para controlar a los microorganismos pueden resumirse de la siguiente forma: • Para evitar la transmisión de las enfermedades y las infecciones. • Para eliminar los microorganismos de un hospedador que está infectado. • Para eliminar microorganismos de los diferentes materiales y así evitar alteración de los resultados Por lo tanto, el propósito de esta práctica es proveer los conocimientos necesarios para comprender el uso de la esterilización. Los microorganismos pueden ser eliminados, inhibidos o muertos por agentes físicos, agentes químicos, o por procesos físicos y agentes quimioterapéticos. Se dispone de una gran variedad de técnicas y agentes que actúan de maneras diferentes y cada uno tiene su aplicación y límite de uso. Un agente físico es una propiedad o condición que causa un cambio, por ejemplo, la tempera-tura, la presión, radiación y los filtros. Un agente químico es una sustancia que causa una reacción específica y que se caracterizan por una estructura molecular típica, por ejemplo, tenemos los compuestos fenólicos, los alcoholes, alógenos (cloro y yodo), aldehídos, oxido de etilo, fenoles. Se utilizan varios términos específicos para escribir a estos agentes y procesos: Esterilización: El proceso que destruye todas las formas de vida se llama esterilización. Un objeto estéril, en sentido microbiológico está libre de microorganismos vivos. Un objeto ó una sustancia son estéril ó no; no puede estar nunca semiestéril o casi estéril. Desinfectante: Un agente, usualmente un producto químico que mata las células vegetativas, pero no necesariamente las formas esporuladas de los microorganismos productores de enfermedades, se denomina un desinfectante. El término se aplica comúnmente a sustancias usadas sobre objetos inanimados. La desinfección es el proceso mediante el cual se destruyen las células vegetativas, pero no necesariamente las esporas de los agentes infecciosos. Antiséptico: Una sustancia que se opone a la infección (sepsis) o previene crecimiento o acción de los microorganismos, bien sea destruyendo o bien inhibiendo su crecimiento ó actividad, se denomina un antiséptico. El término está usualmente asociado a sustancias aplicadas al cuerpo. Higienización: Un agente que reduce la población microbiana hasta niveles que se juzgan seguros para las exigencias de la salud pública se denomina un higienizante. Usualmente es un agente químico que mata el 99.9% de las bacterias en crecimiento. Los higienizantes suelen aplicarse a objetos inanimados y generalmente se emplean en el cuidado diario de equipos y utensilios en las plantas lecheras y de preparación de alimentos, así como para los vasos, platos y utensilios en los restaurantes. El proceso de desinfección producirá higienización. Sin embargo, en el sentido estricto, higienización implica una condición sanitaria ó de limpieza cosa que la infección no implica necesariamente las formas esporuladas de los gérmenes se llaman germicida (microbicida). En la práctica, germicida es casi sinónimo de desinfectante. Pero un germicida se usa generalmente para toda clase de gérmenes microbios y para cualquier aplicación. Bactericida: Un agente que mata las formas vegetativas de las bacterias. Del mismo modo, los términos fungicida, viricida y esporocida se refieren a agentes que matan a los hongos, virus y esporas respectivamente. Bacteriostasis: Una condición en la que se previene (se inhibe) el crecimiento de las bacterias se denomina bacteriostasis (adjetivo: bacteriostático. Del mismo modo, fungistático describe la acción de un agente que detiene el crecimiento de los hongos. Los agentes que tienen en común la capacidad de inhibir los crecimientos de los microorganismos se designan colectivamente, como agentes microbiostáticos. Agente Antimicrobiano: El término de agente antimicrobiano se refiere a un agente que interfiere con el crecimiento y metabolismo de los microbios. En el uso común, el término denota inhibición de crecimiento y cuando se refiere a grupos específicos de organismos, suelen usarse con frecuencia los términos tales como antibacteriano ó antifúngico. Algunos agentes antimicrobianos se utilizan específicamente para el tratamiento de infecciones, estos se denominan agentes terapéuticos. Control de Microorganismos por Agentes Físicos y/o Procesos Físicos. Son una condición o propiedad física que causa un cambio. La temperatura, la presión, la radiación, la desecación, así como la filtración son ejemplos de agentes físicos. Temperatura. - influye mucho en las velocidades de reacción de todos los procesos químicos metabólicos ligados al crecimiento de todo organismo. El aumento o la disminución de la temperatura pueden retardar en algunos casos el crecimiento, e incluso pueden destruir al microorganismo contaminante. La temperatura es una magnitud que expresa el nivel de calor que sufre un cuerpo, entonces, el control de microorganismos por aumento de la temperatura es igual que por el aumento de calor del medio donde se encuentra. Es bien sabido que todos los organismos dependen del agua, la mayoría de su masa total es agua y todas las actividades metabólicas se realizan en medios acuosos (por ejemplo, el cito-plasma). Al mismo tiempo uno de los factores externos que influye en el crecimiento y reproducción de los microorganismos es la temperatura. Existen muchos microorganismos que crecen bien a temperaturas medias de 35ºC pero otros crecen mejor a temperaturas más altas o más bajas. En todo caso todos los microorganismos presentan una temperatura óptima, una temperatura máxima y otra temperatura mínima. En el primer caso es la temperatura a la cual el desarrollo de un microorganismo es mayor, las otras temperaturas son puntos a los cuales tiene lugar el desarrollo, pero de una manera más reducida, es decir disminuye la velocidad de crecimiento, pero sin afectarlo. Las temperaturas por encima de la máxima conllevan a una letalidad para la célula, es decir, inhibe su crecimiento produciendo la muerte de la misma, las temperaturas inferiores a la mínima no matan al microorganismo paro si detiene su metabolismo, es decir, detiene su crecimiento. Así pues, la utilización de calor es un método bueno para lograr la esterilidad de los medios de cultivo, materiales y otros elementos, pero la combinación de la temperatura (calor) y agua (humedad) puede ser aplicado para la esterilización más efectiva de diferentes elementos y materiales. Los métodos más usados en el control de microorganismos con la temperatura incluyen el calor húmedo, el calor seco, la refrigeración y la congelación. Calor húmedo: mata al microorganismo por la coagulación de sus proteínas cuando se encuentran en una zona de atmósfera húmeda y sometidas a altas temperaturas, además, es mucho más rápido y efectivo en su acción. La acción letal del vapor proviene del calor latente liberado cuando se condensa en una superficie fría aumentando de esta manera la temperatura de la zona enfriada. La destrucción de las esporas bacterianas sigue un comportamiento de forma similar en tanto que el vapor se condensa en la pared de la espora y aumenta su contenido en agua que finalmente hidroliza y degrada el contenido proteico. Este calor se aplica en forma de vapor de agua y a temperaturas mayores o menores de 100ºC combinadas con un aumento de la presión en algunos casos. • El uso de temperaturas por debajo de 100ºC son recomendadas para tratar medios que con-tienen compuestos sensibles a las altas temperaturas (evitando la desnaturalización de los mismos). Esta práctica no asegura una esterilización, pero sí una desinfección. Para una completa esterilización de estos medios se recomienda el medio de tyndalización o esterilización fraccionada. • El uso de temperatura de 100ºC se logra exponiendo el medio a tratamiento con agua hirviendo, la tyndalización o esterilización fraccionada también aplica a estas temperaturas. El uso de las temperaturas anteriores usualmente destruye todos los microorganismos no esporulados y la mayoría de los esporulados en 10 minutos. Esta práctica no asegura una esterilización, pero si una desinfección, por lo que no se debe confiar mucho en los métodos anteriores. Si se aplica presión con el uso de equipos especiales (Autoclave) que combinan el efecto con la temperatura, así, a una presión de 760 mm de Hg el agua hierve a 100ºC, pero si la presión es superior la temperatura del agua sube (Vapor de agua), por encima de los 100ºC, por ejem-plo, a 10 lb/pulg de presión la temperatura del vapor de agua e de 105ºC y a 15 lb/pulg es de 121ºC. El uso de vapor de agua a temperaturas de 121ºC por 15 minutos mata todos los microorganismos incluyendo las esporas bacterianas. Este proceso es el principio que aplica el autoclave y la olla a presión en los laboratorios de control microbiológico. Pasteurización: tratamiento por calor controlado que mata a los microorganismos de ciertos tipos, pero no a otros. La temperatura seleccionada para la pasteurización depende del tiempo de muerte por calor del patógeno más resistente que se debe destruir. Por lo tanto, la sustancia pasteurizada no es una sustancia estéril. Calor seco: En una atmósfera seca, totalmente exenta de humedad, las bacterias como muchas proteínas son más resistentes y no mueren hasta que tiene lugar la oxidación de sus componentes, lo cual ocurre a temperaturas mucho más elevados que la que se requiere para coagular las proteínas. Se recomienda el calor seco siempre que el vapor de agua que se emplea no sea deseable o no sea posible que entre en contacto directo con el material que se va a esterilizar. Este tipo de calor comprende: esterilización al rojo vivo, el flameado, aparatos que usan aire caliente y las radiaciones infrarrojas. • Incineración y esterilización al rojo: Métodos usados para esterilizar asas metálicas, espátulas, destrucción de carcasas, animales de laboratorio y cualquier otro material de laboratorio infectado que es preciso eliminar o material que sólo se usa por el momento y constantemente. Estos métodos consisten en la exposición directa del material a la acción de la llama hasta alcanzar una coloración roja. • Flameado: Método utilizado para esterilizar bisturíes, agujas hipodérmicas, boca de tubos de ensayo, porta y Cubreobjetos, etc. Consiste en pasar varias veces el objeto (de 3 a 4 veces) a través de la llama sin permitir que este alcance el rojo. • Aire caliente: Método usado para esterilizar material de vidrio y objetos metálicos. Se debe envolver todo el material de laboratorio en papel, además, los tubos, matraces, pipetas y todo material en forma cilíndrica deben ser cubiertos por un tapón de algodón en su boca. Se usan temperaturas de 160ºC por 2 horas y es suficiente para esterilizar el material. Bajas temperaturas: Las temperaturas por debajo del óptimo de crecimiento microbiano disminuyen la tasa de metabolismo y si la temperatura es suficientemente baja, cesan el crecimiento y el metabolismo. Refrigeración: Este método es muy utilizado en los laboratorios de microbiología para mantener y conservar cepas de microorganismos a temperaturas de 4ºC a 7ºC durante algunos meses. Temperaturas bajo cero: Las bacterias y los virus pueden conservarse a temperaturas de -20ºC (congeladores normales), a -70ºC (Hielo seco, gas carbónico) e incluso a -195ºC (Nitrógeno líquido). En todos estos procedimientos, el congelamiento inicial mata a algunas de las células, pero la mayor parte de las supervivientes generalmente permanecen viables durante largos periodos de tiempo. Por esto, las bajas temperaturas, aun las extremas no sirven para desinfectar ni esterilizar. Los microorganismos mantenidos a estas temperaturas pueden considerarse cómo durmientes, no tiene ninguna actividad metabólica detectable. Esta es la base de la conservación de los alimentos usando bajas temperaturas. Presión Osmótica. -Es la fuerza o tensión ejercida por el agua que difunde a través de una membrana. A medida que una solución se carga con un soluto aumenta la presión osmótica del mismo por la aparente desecación del agua y por ello el agua contenida en una membrana tiende a difundirse (salir) en el medio que rodea a dicha membrana. Este principio es usado para destruir microorganismos, los cuales se colocan en una solución concentrada de sal o azúcar para inducir la deshidratación del microorganismo (plasmólisis) al perder agua que se difunde en el medio. Generalmente las concentraciones altas de sal (10 al 15%) y azúcar (50 al 70%) son suficientes para inhibir el crecimiento de microorganismos. Esta inhibición es la base de la conservación de los alimentos por "salazón" o "almibarados". Radiación Las radiaciones son letales para las células microbianas, así como para otros organismos. De los varios tipos de radiaciones las empleadas con fines de esterilización se encuadran en dos grupos que se diferencian entre sí por su naturaleza y energía. En un grupo se incluyen los rayos infrarrojos y ultravioletas que son de baja energía o de tipo no ionizante y en el otro grupo se encuentran las radiaciones gamma y los electrones de alta energía que constituye el tipo ionizante de elevada energía. Estas radiaciones comprenden porciones del espectro electromagnético. Radiaciones no ionizantes: Los tipos de radiaciones no ionizantes son rayos electromagnéticos (es decir, no partículas) de longitud de onda mayor que la luz visible y que en una gran proporción se absorben como calor. • Radiaciones infrarrojas: Método usado en los centros de salud para esterilizar material e instrumentos de vidrio y metálicos por tiempos no mayores de 30 minutos desde el inicio hasta que se enfría el material, esta radiación alcanza temperaturas de 190ºC. Los microorganismos mueren por la oxidación como consecuencia del calor generado. • Radiaciones U.V.: Son germicidas en una longitud de onda de 260 a 270nm. Son efectivas contra bacterias no esporuladas pero algunas esporas pueden sobrevivir si el tratamiento no se aplica con un tiempo efectivo. Este método de esterilización es usado en el laboratorio de microbiología para desinfectar superficies, aire, aguas, áreas de cirugía y cuartos estériles, no se trata de un agente esterilizante muy adecuado pues tiene bajo poder de penetración especialmente en atmósferas con excesiva cantidad de polvo o en aguas sucias. El efecto letal de estas radiaciones sobre los microorganismos es debido a la absorción de las mismas por las proteínas y ácidos nucleicos y la muerte se produce por las reacciones químicas que tienen lugar en el núcleo y en otros componentes de la célula. Radiaciones ionizantes: Este tipo de radiaciones pueden ser electromagnéticas o de partículas. Las primeras son radiaciones de longitud de onda corta tales como los rayos X o los rayos Gamma y los rayos cósmicos, y las segundas están constituidas por electrones de alta energía producidos por generadores de alto voltaje, los rayos catódicos son ejemplo del segundo tipo. • Los rayos X: Son poco usados debido a su alto poder de penetración que no ha permitido usar protectores eficaces para los operarios, ya que son altamente letales para microorganismos, así como para formas de vida superiores, actúan ionizando las moléculas a su paso especialmente el DNA nuclear y sobre los componentes vitales de la célula. Su aplicación máxima en microbiología es para producir mutantes microbianos. • Los rayos gamma: Es aún más enérgica que los rayos X y más eficaces, aunque actúen de igual manera, tienen menor longitud de onda (10-10 a 10-12nm), atractivos para esterilizar material de alto grosor o volumen, el material de vidrio tiende a presentar un color pardusco. Se emplean dos fuentes para generar estos rayos: el Cobalto-60 y el Cesio-137 producidos por reacciones atómicas. La desventaja de este método es la acción continua de los isótopos por lo cual no se puede suspender cuando se quiera. Los rayos catódicos: Son usados para esterilizar material quirúrgico, drogas, y otras cosas en países avanzados. La ventaja es que el material se puede esterilizar a temperatura ambiente después de haber sido empaquetado. La ventaja es que esta radiación se genera con aparatos que se pueden conectar o desconectar cuando se requiera. La desventaja es que tiene bajo poder de penetración por lo que se aplica en artículos de pequeño tamaño. El tiempo de esterilización es de unos pocos segundos. Filtración. Es un proceso de remoción de bacterias de un fluido al pasarlos a través de un filtro con tamaño de poro tan pequeño que las bacterias no puedan pasar, este tamaño se mide en micrones. Los filtros modernos están diseñados para retener incluso algunos virus, estos filtros son aplicados especialmente para esterilizar antibióticos en solución, líquidos termolábiles como los sueros, soluciones de carbohidratos usados en medios de cultivo, recuperación de toxinas, etc. Hay varios tipos de filtros: • Filtros de tipo bujía (Berkefeld, Mandler). Constituidos por tierras de diatomea, después de usarse deben cepillarse y hervirse con agua estéril, pueden ser de 3 tipos de acuerdo al tamaño del poro: ordinario, fino e intermedio. • Filtros de porcelana (Chamberland, Doulton): Hechos en porcelana, sin vidrios y con varios tamaños de poros, por el más fino pasan únicamente ciertos virus pequeños. • Filtros Seitz o discos filtrantes de asbesto: Constituidos por asbesto de tipo crisólito (químicamente de silicato magnésico) insertados en un recipiente metálico conectado a un Erlemeyer y conectados a una bomba de vacío, el disco tiene varios grados de porosidad: clarificación, normal y especial. • Filtros de vidrio sintetizado: Similar al anterior pero el disco está hecho de vidrio finamente molido y fundido para conseguir la adherencia de las partículas. • Filtros de membrana: Compuestos por celulosa o de sus ésteres (nitrato de celulosa, acetato de celulosa) y politetrafluoretileno. Las membranas tienen varios diámetros y porosidad varía entre 8 y 0.01 micras, sin embargo, los más usados en medios de cultivo son los de 0,22 – 0,4um Desecación. La desecación o secado de la célula microbiana y su ambiente disminuyen en gran parte la actividad metabólica o la detiene totalmente, y además se produce la muerte de algunas células. En general, el tiempo de supervivencia de los microorganismos después de la desecación varía dependiendo de los siguientes factores: la clase de microorganismos, el material en o sobre el que los microorganismos se desecan, la perfección del proceso de desecación, las condiciones físicas a las que se exponen los organismos desecados, por ejemplo, luz, tempera-tura y humedad. Control de Microorganismos por Agentes Químicos Muchas sustancias químicas son capaces de inhibir o matar microorganismos. Comprenden desde elementos metálicos pesados como la plata y el cobre, hasta moléculas orgánicas complejas como los compuestos de amonio cuaternario. los principales grupos de agentes químicos antimicrobianos son: Fenol y compuestos fénolicos: Estos compuestos actúan primordialmente desnaturalizando probablemente las proteínas de la célula y dañando las membranas celulares. Los cresoles son varias veces más germicidas que el fenol y otros compuestos fenólicos. Los compuestos fenólicos pueden ser bactericidas o bacteriostáticos dependiendo de la concentración que se utilicen. Las esporas y los virus son más resistentes a ellos que las células vegetativas bacterianas. Algunos compuestos fenólicos son altamente fungicidas y su actividad antimicrobiana se ve reducida por el pH alcalino o por materia orgánica, así mismo las bajas temperaturas y los residuos de jabón. Alcoholes: El alcohol etílico a concentraciones de 50 a 70% es efectivo contra microorganismos vegetativos o no esporulados. El alcohol etílico tiene bajo poder esporocida. El alcohol metílico es menos bactericida que el etanol. El metanol no se emplea como desinfectante ya que es venenoso y sus vapores tóxicos pueden dañar los ojos. Los alcoholes con mayor peso molecular son más germicidas, pero al mismo tiempo son menos inmiscibles con el agua y por ello se usan poco. El alcohol es efectivo para reducir la flora microbiana de la piel y para desinfectar termómetros. Los alcoholes desnaturalizan las proteínas, propiedad que en gran medida explica su actividad antimicrobiana, son también disolventes de los lípidos y por eso dañan la membrana celular. Halógenos y sus compuestos: La familia de los halógenos consta de elementos como el flúor, cloro, bromo y yodo. El yodo y el cloro son los más usados como agentes antimicrobianos. • El yodo es uno de los germicidas más antiguos y eficaz que se conoce, es altamente efectivo contra toda clase de bacterias, esporas, hongos y virus. Usado ampliamente para desinfectar la piel sobre todo en centros de salud como una sustancia postoperatoria. • El cloro, tanto como gas como en combinación (compuestos clorados) son usados preferentemente en abastecimientos de aguas. Los hipocloritos son usados tanto en la industria como en el hogar, los productos que poseen concentraciones de 5 a 12% se usan para higienizar las instalaciones donde se procesan leches y en restaurantes. Soluciones del 1% se usan como desinfectantes caseros y en la higiene personal. Detergentes: Estos rebajan la tensión superficial y son empleados primordialmente para limpiar superficies. Su acción se basa en el arrastre de los microorganismos al englobarlos en la espuma. A algunos detergentes se les incorporan algunas sustancias químicas para aumentar su poder germicida MATERIALES Y MÉTODOS Equipos Los existentes en el laboratorio solo para observación Autoclave Estufa esterilizadora Sistema de filtración Luz Ultravioleta Materiales Reglamentos y Manual de Bioseguridad del Laboratorio Envases de plástico Papel de empaque Papel aluminio Cinta adhesiva Marcador rotulador Reactivos Agua del lavabo Cloro liquido PROCEDIMIENTO / TÉCNICA: En grupos de trabajo, realizar la lectura y análisis del material asignado y exponerlo en un período máximo de cinco minutos, para ello: a. Discutir las normas generales de seguridad e higiene para cualquier laboratorio y aquellas que se aplican especialmente en el área microbiológica. Hacer especial hincapié en su importancia. b. Revisar las normas de bioseguridad del laboratorio en el que se realizaran las prácticas microbiológicas. c. Ubicar las zonas de seguridad y controles maestros de suministro de servicios. d. Establecer la utilidad de los desinfectantes, antisépticos y sanitizantes en el laboratorio de Microbiología. e. Simular los procedimientos a seguir en caso de accidentes, derrames y sobre la disposición de desechos en el laboratorio. f. Proponer otras guías de observación para verificar el cumplimiento de los reglamentos vigentes en los laboratorios. Para todas las sesiones de laboratorio llenar la siguiente guía de observación. g. Hacer uso del equipo autoclave para el desecho de material infeccioso o para el trabajo con material estéril RESULTADO (Gráficos, cálculos, etc.) Colocar fotos que demuestren su actividad durante la práctica. Mostrar los equipos materiales y reactivos de uso en microbiología Verificar los resultados basados en cuadros que resumen lo esencial a tomar en cuenta respecto a las normas y manejo de bioseguridad en un laboratorio microbiológico. Presentar cuadros respecto a material esterilizado OBSERVACIONES Colocar las observaciones que se hayan presentado respecto al procedimiento y resultados que se ejecutó durante la práctica. CONCLUSIONES Los laboratorios microbiológicos, tienen áreas preanalíticas, analíticas y post-analíticas característicos que poseen un equipos, materiales y reactivos útiles para el cultivo e identificación de microorganismos La esterilización es uno de los aspectos muy importantes durante los trabajos microbiológios. RECOMENDACIONES Se recomienda respetar los tiempos de espera de cada prueba, con la finalidad de obtener los mejores resultados en la práctica. Se recomienda siempre aplicar las normas de bioseguridad, incluso cuando no se trabaje con organismos de alto riesgo de contaminación Los informes deben realizarse en función de lo realizado en la práctica. No debe copiarse las explicaciones usando el internet. Las imágenes deben ser colocadas en la parte del Desarrollo. Se recomienda utilizar las normas de bioseguridad sobre todo en el laboratorio de microbiología para protegerse de los agentes patógenos. Para ingresar al laboratorio se recomienda hacerlo con todos los materiales para la práctica incluyendo los materiales de bioseguridad como: guantes, mascarilla, gorro y en caso de ser necesario gafas. Se recomienda tener conocimientos previos acerca del tema a tratarse en la práctica, en este caso sobre las técnicas de tinción diferencial para observación de microorganismo. Utilizar correctamente el microscopio, evitando que las placas obtenidas para la observación se dañen y se pueda tener una visión clara de cada uno de los microrganismos. Al finalizar la práctica los materiales utilizados deben ser dejados en su forma inicial. BIBLIOGRAFÍA Reglamento de Higiene y Seguridad de la Facultad de Química.2006. http://www.fquim.unam.mx/sitio/ Reglamento para el Manejo, Tratamiento y Minimización de Residuos Generados en la Facultad de Química de la UNAM. 2007. Anexo de la Gaceta de la Facultad de Química. http://www.quimica.unam.mx NOM-026 STPS-1998. Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos por fluidos conducidos en tuberías. NOM-003 SEGOB-2002. Señales y avisos para protección civil. Colores, formas y símbolos a utilizar. NOM-052-SEMARNAT-2005. Que establece las características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados de los residuos peligrosos. NOM-087-ECOL-SSA1- 2002. Protección ambiental- Salud ambiental- Residuos Peligrosos Biológico InfecciososClasificación y especificaciones de manejo. INS. 2005. MAN-INS-001 Manual de Bioseguridad en Laboratorios de Ensayos Biomédicos y Clínicos. http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/normatividad/norref/MAN-INS001%20Ed03%20BIOSEGURIDAD_%20IJL%2016_08_05.pdf Collins C.H. y Lyne Patricia M. 1989. Métodos Microbiológicos. ACRIBIA. 524 pp Gavilán Irma, Vélez Guadalupe y Santos Elvira. Manual de hojas de seguridad de agentes infecciosos. FQ, UNAM, 2003. Vignoli, R. Esterilización y desinfección.21p. http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap% 2027.pdf Laboratorio de Microbiología. Métodos de Esterilización. http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/faculta d_farmacia/catedraMicro/10_M%C3%A9todos_ de_esterilizaci%C3%B3n.pdf The Pharmacopeia of the United States of America. Cap 1211 Sterilization and Sterility Assurance of Compendial Articles. 31 Edition. Rockville: USP; 2008. Tortora G. J., B. R. Funke and Ch. L. Case 2007. Introducción a la Microbiología 9na Edición. Editorial Médica Panamericana. http://www.cdc.gov/od/ohs/pdffiles/bmbl4_spanish Mgs. Ximena Robalino. DIRECTORA DE CARRERA Ing. Félix Falconí O. Mgs DOCENTE
