INMUNOLOGiA APLICADA UTEG.1

Centro Universitario Uteg
Manual de Prácticas
de Laboratorio
de
Inmunología
Aplicada
Dra. Jessay Luna Vásquez
Dr. En C. Luis Daniel Hernández Ortega
Lic. en Químico Farmacobiólogo
Centro Universitario Uteg
Extracto del Reglamento de Laboratorios de Química (D-CL-20) del Centro
Universitario UTEG
Artículo 1.- El presente reglamento es obligatorio y de observancia general, tanto para el
personal como para los alumnos que conforman la comunidad universitaria UTEG, y tiene
por objeto regular el uso y conservación de los laboratorios y equipos especializados en
química, incluyendo a sus ramas disciplinarias, así como los derechos y obligaciones de los
usuarios y encargados de los mismos.
Artículo 3.- Para los efectos de este reglamento se entiende por:
a. Agente Infeccioso: microorganismo capaz de causar una enfermedad si se reúnen las
condiciones para ello y cuya presencia en un residuo lo hace peligroso.
b. Laboratorio de Química: lugar habilitado con material e instrumentos especializados
para realizar investigaciones y experimentos de tipo científico, en la materia de
química incluyendo sus ramas disciplinarias.
c. Residuos Peligrosos: son aquellos que posean alguna de las características de
corrosividad, reactividad, explosividad, toxicidad, inflamabilidad, o que contengan
agentes infecciosos que les confieran peligrosidad, así como envases, recipientes,
embalajes y suelos que hayan sido contaminados cuando se transfieran a otro sitio.
d. Residuos Peligroso Biológico-Infecciosos: aquellos clasificados como tales en las
Normas Oficiales Mexicanas, como la sangre, sus componentes y derivados; cultivos y
cepas almacenadas de agentes infecciosos; desechos patológicos como tejidos,
órganos, cadáveres y partes de animales; muestras biológicas para análisis químico,
microbiológico, citológico e histológico, excluyendo orina y excremento; residuos
no anatómicos como materiales de curación que contengan algún tipo de líquido
corporal y derivados de los laboratorios; y objetos punzocortantes contaminados y
no contaminados (lancetas, jeringas, porta y cubreobjetos, navajas de bisturí).
e. Usuario: toda persona miembro de la comunidad universitaria UTEG, sea personal
académico, alumnos y trabajadores administrativos, que utilice o haga uso de los
laboratorios de química.
Artículo 6.- Toda persona que haga uso de los laboratorios deberá registrar su ingreso en las
bitácoras correspondientes que, para el efecto de registro, posea el centro universitario,
anotando su nombre, matricula o número de empleado y firma.
Artículo 7.- Todas las prácticas y/o experimentos que se realicen en los laboratorios deberán
estar supervisados por el docente de la asignatura correspondiente.
Artículo 8.- Los usuarios deberán portar, al ingresar a los laboratorios, el siguiente atuendo:
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a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.
k.
Bata blanca de manga larga abotonada, con el logo de la institución.
Lentes de seguridad.
Paño o franela para limpiar su área de trabajo.
No usar lentes de contacto, quienes necesiten lentes correctivos deberán portar
anteojos.
Calzado cerrado, de piso, no de tela y suela antiderrapante (el zapato deberá cubrir
completamente el empeine; no se permitirá la entrada con zapato abierto o
semicerrado, con o sin calcetines).
Pantalón largo de mezclilla o gabardina de algodón. No se permite la entrada con
pantalón corto, faldas, blusas escotadas o de tirantes.
Cabello recogido (en el laboratorio que se requiera portar cofia).
Uñas cortas y limpias, sin esmalte.
No accesorios como aretes, anillos, cadenas, pulseras, esclavas y/o relojes.
Portar guantes de látex y cubre bocas (bajo indicación del docente, de acuerdo al tipo
de práctica y de laboratorio).
Mujeres sin maquillaje, de acuerdo al tipo de práctica y de laboratorio, bajo la
indicación del docente.
Asimismo, es obligatorio llevar a cabo la técnica de lavado de manos indicada por los
docentes al iniciar y al terminar la práctica.
Artículo 9.- El docente deberá identificar los riesgos específicos de cada práctica e indicar las
medidas y procedimientos de seguridad adecuados para su realización, en especial si el
alumno pudiera estar expuesto a situaciones de peligro o riesgo, con sustancias peligrosas
por el tipo de sus características explosivas, volátiles, corrosivas, reactivas, tóxicas,
inflamables o infeccionas.
Artículo 11.- Durante el desarrollo de las prácticas en los laboratorios, los docentes a cargo
son responsables directos del correcto uso de las instalaciones, material, equipo, reactivos y
sustancias, siendo su obligación reportar cualquier irregularidad descubierta en los mismo,
notificando por escrito de inmediato al personal a cargo de los laboratorios, así como de los
eventuales infractores en su caso.
Artículo 12.- El docente que utilice los laboratorios deberá permanecer en los mismos hasta
que concluya la práctica, siendo responsable de proporcionar una asesoría adecuada y de
calidad a los alumnos durante su desarrollo, así como del comportamiento de los alumnos.
Artículo 13.- Los alumnos son responsables del material y equipo de los laboratorios que
empleen durante las prácticas. En caso de falla o desperfecto en los equipos, deberán
reportarlo de inmediato al docente a cargo de la práctica y/o al Técnico Laboratorista y/o
Coordinador de Laboratorios. Para el caso de que algún alumno rompa de manera accidental
o intencionada el material o instrumentos del laboratorio, deberá reponerlo en la misma
calidad, cantidad y de la misma marca que el que le fue entregado.
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Artículo 14.- Son obligaciones de los usuarios de los Laboratorios de Química, las siguientes:
a. Asistir con puntualidad a las prácticas.
b. Permanecer en orden y guardar silencio.
c. Abstenerse de jugar, correr, hacer bromas y emplear lenguaje inadecuado dentro de
las instalaciones.
d. Realizar el lavado de manos indicado por el docente antes de iniciar la práctica.
e. Atender a las indicaciones de vestimenta y atuendo indispensable para asistir a las
prácticas.
f. Acatar a la brevedad las indicaciones del docente o encargado del laboratorio y/o
técnico auxiliar de laboratorio.
g. Hacer un uso adecuado de las instalaciones, equipo, materiales, sustancias y/o
reactivos.
h. Respetar los horarios y condiciones de uso de los laboratorios y sus equipos
especializados.
i. Revisar con antelación al desarrollo de la práctica, en el manual correspondiente, el
material necesario para su realización, solicitado por el docente y/o técnico y/o
encargado de laboratorio, ya que sin él no podrán realizarla, ni ingresar al
laboratorio, sin excepción.
j. Atender a las indicaciones del docente y/o técnico y/o encargado de laboratorio,
para la disposición final de las sustancias y reactivos empleados durante las prácticas.
k. Localizar el equipo de seguridad para que, en cualquier contingencia, puedan
operarlo.
l. Usar solamente equipo que se encuentre en buenas condiciones y reportar cualquier
desperfecto de inmediato a su docente y/o encargado de laboratorio.
m. Guardar su material limpio, seco y completo en la gaveta asignada para tal efecto.
n. Una vez concluida la actividad dentro del laboratorio, dejar en perfecto orden el
entorno en el cual estuvo trabajando; apagar y entregar equipos y materiales, limpiar
las mesas de trabajo, acomodar las bancas o sillas; retirar y limpiar los papeles y
elementos utilizados, y reportar cualquier falla del equipo.
Artículo 15.- Los alumnos tienen la posibilidad de alquilar en la dirección administrativa del
plantel, un lócker al inicio de cada ciclo escolar, para el efecto de que guarden sus objetos
personales durante las prácticas de laboratorio; en caso contrario, los alumnos no podrán
dejar sus pertenencias en los pasillos, aulas o dentro del laboratorio, y la institución no se
hace responsable de los daños que puedan sufrir.
Artículo 16.-El alumno deberá leer cuidadosamente las etiquetas de los reactivos; en caso de
accidente, deberá actuar con calma y reportar inmediatamente lo sucedido al docente y/o
técnico y/o encargado de laboratorio.
Artículo 17.- Los alumnos deberán observar los cuidados necesarios para el manejo de los
equipos utilizados en la práctica y leer previamente el instructivo de trabajo, el cual se
encontrará al lado del equipo. Cualquier duda al respecto deberá consultarla con el
encargado y/o técnico del laboratorio y/o docente.
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Artículo 25.- Para poder ingresar a los laboratorios, el alumno deberá portar el atuendo
establecido en el presente reglamento, en caso contrario, será facultad del Docente y/o
encargado y/o técnico de laboratorio, restringirle el acceso al mismo; de igual manera,
deberá asistir con puntualidad en las horas programadas para la práctica.
Se nombrará lista de asistencia 10 diez minutos después de la hora señalada para la práctica,
después de lo cual no se permitirá el acceso o salida a ningún alumno; sin excepción.
Artículo 26.- Se dará una tolerancia de sólo 5 cinco minutos para desocupar las instalaciones,
una vez concluido el horario designado. La ausencia de un docente o grupo de alumnos en el
horario posterior al que le corresponde, no da derecho a seguir ocupando los laboratorios.
Ante la omisión reiterada en el cumplimiento de este artículo (dos o más veces), se podrá
negar una nueva reservación, a criterio del Director Académico.
Artículo 28.- El docente deberá respetar las fechas y número de prácticas establecidas por él
mismo en el programa de prácticas del laboratorio. Si el docente planea realizar una práctica
diferente a la programada, deberá notificar con preferencia 3 tres días de anticipación para
evitar el gasto innecesario de reactivos y/o uso de equipos. Ante la omisión reiterada en el
cumplimiento de este artículo (dos o más veces), se podrá negar una nueva reservación, a
criterio del Director Académico.
Artículo 29.- El usuario conservará y mantendrá el orden y limpieza de las instalaciones y
equipos de los laboratorios de química. Si el laboratorio se encuentra sucio antes de
empezar la sesión, el usuario deberá reportarlo al encargado y/o técnico en turno; en caso
de no recibir respuesta favorable, se deberá reportar a la Dirección Académica.
Artículo 30.- Al inicio de cada semestre los alumnos deberán agruparse por equipos o mesas
de laboratorio para realizar las prácticas que les corresponda durante todo el ciclo escolar,
nombrando un representante. El docente y/o encargado y/o técnico de laboratorio les
entregará por equipo o mesa el material que requerirán a lo largo del semestre, firmando el
responsable del equipo, mismo que deberán guardar en la gaveta que les corresponda. Al
final del semestre, el material deberá ser devuelto íntegro, de lo contrario le será
condicionada la reinscripción al equipo completo.
Existe material que no debe reusarse por la naturaleza de las muestras que se manejan
(como portaobjetos, cubreobjetos), este material deberá desecharse en su contenedor
correspondiente y el alumno deberá reponerlo en la práctica inmediata posterior en que fue
desechado.
Artículo 31.- Al inicio de cada práctica el alumno deberá solicitar al docente y/o encargado
y/o técnico de laboratorio la llave de la gaveta donde se encuentra su material, para poder
emplear el requerido durante la práctica; al final de la misma el material deberá ser devuelto
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completamente limpio y seco. En caso de que éste sufra algún desperfecto, deberá
reportarlo al docente y/o encargado del laboratorio, de lo contrario, asumirá la
responsabilidad correspondiente.
Artículo 32.- Por ningún motivo el alumno deberá tratar de abrir o reparar el material o
equipo del laboratorio por sí mismo. Cualquier falla en el equipo o material deberá ser
reportada al docente o técnico y/o encargado del laboratorio.
Artículo 33.- El material y/o equipo utilizado debe ser devuelto en las condiciones que fue
prestado. Por tal motivo, en caso de que el usuario dañe el equipo y/o material a su cargo de
manera accidental o intencional, deberá reponerlo en la práctica inmediata posterior por
uno igual en marca y características. En caso contrario, se le negará el servicio por tiempo
indefinido y se levantará el acta correspondiente, ajeno a la sanción que le corresponda de
acuerdo al Reglamento de Alumnos.
En el caso de docentes y/o técnicos laboratoristas que dañen algún equipo o material, se
valorará el por parte de Coordinación de Laboratorios y la Dirección Académica; en caso de
que tengan que pagar o reponer el material esto se puede hacer mediante un descuento vía
nómina previo Vo. Bo. del departamento de Recursos Humanos.
Artículo 34.- Para el caso de que el laboratorio no cuente con las muestras necesarias para el
desarrollo de la práctica, el docente deberá solicitarlas a sus alumnos con anticipación.
Artículo 38.- Se debe conservar siempre limpia la mesa de trabajo al inicio, durante y al
finalizar cada práctica; depositar toda la basura en los cestos correspondientes.
Los vertederos deberán estar siempre libres de residuos, no se deberán arrojar cuerpos
sólidos ni papeles.
Artículo 44.- Queda estrictamente prohibido a los usuarios lo siguiente:
a. Mascar chicle, introducir y consumir bebidas, alimentos, cigarrillos o cualquier tipo
de golosina dentro del área de laboratorios.
b. El uso de lentes oscuros, gorras, audífonos, teléfonos celulares, reproductor de
música o video; videojuegos o cualquier equipo electrónico de entretenimiento o
comunicación no permitido durante el uso de los laboratorios.
c. El uso de sandalias, bermudas, pantalones cortos, cabello largo suelto, accesorios
prominentes y corbata.
d. Ingresar al laboratorio, tanto alumnos como docentes, sin bata de marga larga o con
una bata diferente a la reglamentaria.
e. El desorden y ruidos fuera de lo normal, dentro y fuera de los laboratorios; en todo
caso los usuarios deberán esperar para su ingreso en el perímetro de acceso a que
llegue su docente.
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f. La entrada a personas ajenas a la comunidad Universitaria UTEG.
g. Correr, jugar, hacer bromas o acciones que pongan el peligro su seguridad y la de sus
compañeros.
h. Ingresar a los laboratorios si no está presente el docente o encargado de laboratorio.
i. Utilizar computadora durante la clase, excepto si se requiere para exponer algún
tema.
j. Introducirse objetos en la boca.
k. Hacer uso del equipo de seguridad y/o salida de emergencia cuando no sea
necesario.
l. Mezclar sustancias y reactivos sin la debida autorización del docente o encargado de
laboratorio.
m. Hacer un uso incorrecto del mobiliario, equipos, instalaciones, sustancias o reactivos
de los laboratorios.
n. Proferir palabras altisonantes u ofensivas entre los alumnos, docentes, técnicos y/o
encargados de laboratorio.
o. Las demás que sean establecidas por el docente, encargado y/o técnico o Director
Académico, para garantizar el buen funcionamiento y conservación de los equipos y
laboratorios de química.
Artículo 45.- Ningún alumno podrá permanecer en el recinto de los laboratorios en ausencia
de sus docentes o del responsable de laboratorio, ni portando una bata ajena a la
reglamentaria.
Ningún docente podrá permanecer en los laboratorios fuera de su programa de prácticas sin
la autorización del encargado de laboratorio y/o Director Académico de la carrera y/o
portando bata ajena a la reglamentaria.
Artículo 46.- En caso de incumplimiento a los lineamientos establecidos en el presente
reglamento, podrán ser aplicadas por el encargado o personal responsable del laboratorio, el
docente, el Director Académico y/o Administrativo, según sea el caso, sin perjuicio de ser
exigida la reparación de los daños ocasionados, las siguientes sanciones:
a.
b.
c.
d.
Amonestación verbal o escrita.
Retención de credenciales.
Suspensión del servicio.
Las sanciones establecidas en el reglamento que por su relación con el Centro
Universitario le correspondan.
Artículo 47.- El alumno debe comportarse adecuadamente dentro de las instalaciones del
laboratorio, hacer uso apropiado del lenguaje oral y escrito, respetar a sus profesores y
compañeros de clase técnicos y/o encargados de laboratorio; en caso contrario se le
suspenderá el servicio temporalmente o en casos graves indefinidamente, a criterio del
docente o del encargado y/o técnico del laboratorio, previo el aval de Dirección Académica.
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Artículo 48.- Los alumnos que incumplan con las disposiciones contenidas en el presente
reglamento, deberán ser reportados por el docente y/o encargado y/o técnico de
laboratorio al Director Académico que corresponda, para que con base en el Procedimiento
de Determinación de Responsabilidad y Aplicación de Sanciones establecido en el
Reglamento de Alumnos, se determine la sanción que le corresponda de acuerdo a la
gravedad de la infracción y se glose copia del acta respectiva al expediente del alumno.
Artículo 49.- Los docentes y técnicos y/o encargados de laboratorios que incumplan las
obligaciones que este reglamento les confiere, podrán ser sancionados con base en la
gravedad de la infracción, de acuerdo al Reglamento de Docentes o Interior de Trabajo,
según corresponda.
Artículo 50.- Los casos no previstos en este Reglamento serán solucionados por el encargado
o técnico del laboratorio, o por el Director Académico en su caso, atendiendo a los intereses
de la comunidad y teniendo a la vista el cumplimiento de las finalidades que son propias del
servicio de los laboratorios de Química del Centro Universitario.
El presente reglamento fue modificado a petición del Director Académico de la Licenciatura
en Químico Farmacobiólogo durante revisión oficiosa R03/0114 en el mes de enero de 2014;
en virtud de lo anterior se deberá entender que subsiste el contenido en todas sus partes del
presente reglamento, en lo que ve a aquellas disposiciones que no fueron modificadas. Estas
reformas entrarán en vigor a partir del mes de enero de 2014, previa autorización del
Director del Macroproceso correspondiente.
TABLA DE MODIFICACIONES
REVISIÓN
MODIFICACIONES
FECHA DE
APROBACIÓN
R02
Enero de 2013
Artículo 4, 8 inciso e) y f) y 18.
R03
Enero de 2014
Art. 13, 21 y 23.
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Índice
Practica 1. Inflamación
Practica 2. Identificación de linfocitos T, determinación de rosetas T
Practica 3. Identificación de linfocitos B
Practica 4. Hipersensibilidad inmediata, pruebas intradérmicas
Practica 5. Degranulación de basófilos
Practica 6. Cuantificación de eosinófilos en secreción nasal
Practica 7. Determinación de la actividad hemolítica del complemento
por IDR
Practica 8. Identificación de células LE (lupus eritematoso)
Practica 9. Inmunología del cáncer
Practica 10. Hipersensibilidad tardía e inmunodeficiencia
Practica 11. Inmunología de los trasplantes
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Introducción
La inmunología abarca un amplio campo del conocimiento, dentro de los últimos
años los ensayos de inmunología celular y molecular han cobrado una importancia
significativa ya que nos pueden brindar una gran cantidad de información de un
gran número de patologías. A la par de esto se han desarrollado un sin número de
técnicas automatizadas con gran exactitud y precisión, este tipo de técnicas son
desarrolladas en laboratorios de alta especialización; sin embargo como en todas
las técnicas novedosas, existe siempre un fundamento o una técnica que
podemos llevar a cabo en laboratorio pequeño o de bajo presupuesto, no por ello
el resultado carecerá de validez.
Este manual fue diseñado para que el alumno aplique los conocimientos
adquiridos en clase, mismos que forman el fundamento de las técnicas empleadas
en el laboratorio o sirven a su vez para la interpretación y correlación de los
resultados.
A lo largo de las prácticas realizadas el alumno desarrollara conocimientos y
habilidades manuales que le permitirán desempeñarse de manera adecuada
dentro del laboratorio de inmunología y al conocer el fundamento básico de dichas
técnicas será capaz de comprender lo que sucede dentro de los equipos
automatizados.
Los autores
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Práctica 1
INFLAMACIÓN
Fundamento
La inflamación es una respuesta compleja de nuestro sistema inmune
innato, la cual refleja los efectos de las citocinas liberadas sobre los tejidos
vascularizados; de manera simple, a una reacción inflamatoria se le puede definir
como calor, rubor, tumefacción, dolor y pérdida de la funcionalidad. Las
características primordiales de una reacción inflamatoria localizada fueron
descritas desde hace casi 2000 años por los romanos y fue en el siglo II DC
cuando el médico Galeno añadió la pérdida de la función al concepto. La
inflamación puede ser aguda, como ejemplo tenemos al daño tisular, o crónica
como consecuencia de una patología ya establecida.
El proceso de una reacción inflamatoria es complejo y está dado por una
cascada de eventos que finalmente conducen a la migración de células del
sistema inmune hacia el lugar de la lesión. Inmediatamente después de la lesión
tisular aumenta el diámetro de los vasos sanguíneos (vasodilatación) en dicha
zona, lo que ocasiona un aumento del volumen sanguíneo, este aumento de
sangre calienta el tejido y lo enrojece. También se aumenta la capilaridad,
permitiendo el escape de líquido desde los vasos sanguíneos y la expansión del
tejido (edema). Pocas horas después los leucocitos se adhieren a las células
endoteliales y atraviesan las paredes de los vasos sanguíneos para migrar a los
espacios tisulares, proceso llamado extravasación. Estos leucocitos se encargan
de fagocitar a los patógenos invasores y liberan mediadores moleculares que
contribuyen a la reacción inflamatoria y al reclutamiento y activación de otras
células del sistema inmune, todo esto tiene como consecuencia la sensación de
dolor y pérdida de la función en la zona lesionada.
Las células del sistema inmune innato desempeñan un papel muy
importante en la respuesta hacia microorganismos invasores, en conjunto todas
estas células activan una cascada de respuestas cada vez más compleja para
permitir la eliminación del agente invasor. Los macrófagos y células NK secretan
citocinas que activan a los macrófagos y estimulan la inflamación, también ayudan
al reclutamiento y activación de leucocitos. Los neutrófilos y los macrófagos
reconocen a los microorganismos por medio de receptores que actúan
estimulando la migración de las células al sitio de la lesión, promoviendo la
fagocitosis y producción de sustancias que eliminan a las bacterias. Los neutrófilos
son las células que migran con mayor rapidez, son las primeras células que
aparecen en las zonas de inflamación aguda y predominan durante los primeros
días, a partir del primer día comienzan a migrar fagocitos mononucleares y
algunos linfocitos, por último llegan las células T CD8+ y algunas células B.
Si durante la reacción aguda inflamatoria se logra eliminar el agente invasor
el tejido se comienza a recuperar de manera normal, pero si no fue posible
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eliminar dicho agente, la reacción inflamatoria evolucionará a la cronicidad; en
estos casos las células presentes comienzan a cambiar, escasean los neutrófilos y
se encuentran grandes cantidades de linfocitos T CD4+
y fagocitos
mononucleares, las reacciones frente a las enfermedades parasitarias suelen
acompañarse de una acumulación de eosinófilos.
El proceso de migración leucocitaria a los sitios de la lesión depende de la
estimulación por citocinas y está mediado por los receptores leucocitarios y por los
ligandos endoteliales de estos receptores. Las citocinas de mayor importancia son
el TNF y las quimiocinas, las cuales son producidas por los macrófagos, las
células endoteliales y otras células en respuesta a la lesión; el TNF estimula a las
células endoteliales para que secuencialmente expresen distintas moléculas que
median la fijación de los leucocitos a la pared del vaso sanguíneo; una o dos horas
después de la exposición al TNF, las células endoteliales expresan selectina E,
que inicia la unión de los neutrófilos y de otros leucocitos a los vasos sanguíneos
en los sitios de inflamación. La molécula de adhesión vascular 1 (V-CAM), el
ligando de la integrina (VLA-4), la molécula de adhesión intracelular (ICAM-1) y los
ligandos de integrinas LFA-1 y Mac-1 aparecen en el endotelio 6 a 12 horas
después de la exposición al TNF. Las integrinas median la fijación estable de los
leucocitos al endotelio, para dar lugar a la posterior migración a través de los
espacios interendoteliales al tejido extravascular donde se encuentre la lesión.
La extravasación de neutrófilos se divide en 4 pasos:
A) Rodamiento: en presencia de flujo sanguíneo, los leucocitos son
impulsados de tal manera que se desplazan a lo largo de la superficie
endotelial.
B) Activación por estímulo quimioatrayente: a medida que el neutrófilo se
desplaza, encuentra quimiocinas producidas en el sitio de la lesión que lo
dirigen.
C) Detención y adhesión: al llegar al sitio de la inflamación, gracias a la
interacción integrinas-ICAM, el neutrófilo estabiliza su adhesión.
D) Migración transendotelial: una vez adherido, el neutrófilo se abre paso a
través de las células endoteliales y migra hacia el tejido dañado.
Objetivo general
 Comprender el proceso de una reacción de inflamación.
Objetivos particulares
 Identificar las células del sistema inmune en respuesta a una lesión
inflamatoria.
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Recursos





Material
Cubreobjetos
Portaobjetos
Pipetas Pasteur
1 paquetito de algodón
Cinta microporo



Reactivos
Alcohol 90%
Agua desionizada o
tampón de fosfatos,
pH 6.8–7.2
Colorante WrigthGiemsa
Equipo
Procedimiento
Parte A. Evaluar la respuesta inflamatoria.
Inflamación local
 Seleccionar a una persona por equipo y con un portaobjeto se hará una
lesión por raspado en el antebrazo previamente desinfectado con una
torunda con alcohol.
 Colocar un cubreobjetos sobre la lesión y fijar cuidadosamente con una
cintra microporo.
 El cubreobjetos se cambiará a las 2, 6, 12, 24 y 48 hrs, marcando cada
uno de ellos y teniendo extremo cuidado de no romperlos.
 Guardar los cubreobjetos cuidadosamente y marcar la hora que
corresponde a cada uno, llevarlos a la siguiente práctica para realizar la
segunda parte.
Parte B. Observación de las células participantes en la reacción inflamatoria.
Esta parte consiste en teñir los cubreobjetos con el colorante Wrigth-Giemsa para
poder observar al microscopio las células que se encuentran a las diferentes
horas.
Tinción de Wrigth-Giemsa
 Colocar los cubreobjetos completamente secos en una gradilla de tinción.
 Cubrir el cubreobjetos con colorante de Wright-Giemsa.
 Tras 1 minuto, añadir un volumen igual de agua desionizada o tampón de
fosfatos, pH 6.8–7.2, y mezclar bien soplando con cuidado sobre el
cubreobjetos, sin derramar el colorante.
 Tras 1–3 minutos, lavar con agua desionizada y secar al aire.
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Observar al microscopio
 Identificar las diferentes líneas celulares reclutadas en el sitio de la lesión a
los diferentes tiempos en el microscopio con los objetivos de 10X y 40X.
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Qué es la inflamación?
2. Menciona las características principales de la inflamación
3. Menciona los tipos de inflamación y un ejemplo de cada uno de ellos
4. ¿Cuáles son las primeras células en aparecer en una reacción inflamatoria
aguda?
5. ¿Qué son las citocinas y cuál es su función en el proceso de inflamación?
6. ¿Cuáles son las citocinas más importantes en una reacción inflamatoria?
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7. ¿Cuáles son las moléculas que median la fijación estable de los leucocitos al
endotelio vascular?
8. Menciona y explica brevemente los pasos de la extravasación de neutrófilos
B) Diagrama de flujo de la reacción de inflamación.
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Resultados
Observaciones
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Conclusiones
Bibliografía
Título
Autor
Página Editorial
1.
2.
3.
Nombre del alumno:
Fecha:
Grado/grupo/turno:
Calificación:
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Práctica 2
IDENTIFICACIÓN DE LINFOCITOS T
DETERMINACIÓN DE ROSETAS T
Fundamento
Los linfocitos son las únicas células del cuerpo capaces de reconocer los
diversos antígenos y distinguirlos específicamente, por lo que le dan a la
respuesta inmunitaria adaptativa sus dos características principales: la
especificidad y la memoria. Los linfocitos constan de distintos subconjuntos que
difieren en su función y productos proteínicos, pero son morfológicamente muy
parecidos.
Las poblaciones y subpoblaciones de linfocitos tienen características
morfológicas similares, para identificarlas, hacen falta métodos de laboratorio que
detectan, proteínas de membrana denominadas "marcadores". Brain alrededor de
1970 demostró que los linfocitos T humanos poseen la propiedad de unirse
espontáneamente a los eritrocitos de carnero in vitro, formando agrupaciones
denominadas rosetas E. Esta propiedad ha sido útil para desarrollar una técnica
sencilla y de bajo costo para la cuantificación de los linfocitos T.
La formación de las rosetas se debe a que los linfocitos T humanos poseen
en su superficie un receptor que provoca su unión con los eritrocitos de carnero.
Este receptor se conoce como CD2 y forma parte de una familia llamados CD (CD,
clusters of differentiation), como tal es una glicoproteína de membrana de 50 kDa,
presente en los linfocitos T maduros, su función es interactuar con una
glicoproteína de 40-70 kDa, llamada LFA-3 (leukocyte function antigen) o CD58,
presente en la superficie de diversos tipos celulares. Por su parte los eritrocitos de
carnero poseen una molécula similar al LFA-3 humano en su superficie. El
receptor CD2 cumple la función de estabilizar las interacciones celulares durante
la adhesión y la activación de los linfocitos T.
La presencia del CD2 es útil para identificar a los linfocitos T humanos, a
través de la formación de rosetas. Este método ha sido paulatinamente sustituido
por métodos de inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales,
especialmente con citometría de flujo. Sin embargo, dado su bajo costo en, el
método de rosetas E sigue siendo una alternativa válida y útil para los laboratorios
pequeños o de bajo presupuesto.
Objetivo general
 Analizar la participación de los linfocitos T en la respuesta inmune y aprender
los métodos empleados para la identificación de los mismos.
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Objetivos particulares
 Identificar a los linfocitos B utilizando el método de rosetas “E”.
Recursos
Material
 4 tubos de 13 x 100
 4 tubos de 12 x 75
 1 tubo con tapón de
vaquelita.
 1 pipeta de 5 ml.
 1 torniquete.
 2 pipetas Pasteur.
 1 portaobjetos y
cubreobjetos.
 1 jeringa de 5 ml.
 Algodón.
 1 pipeta de 1 ml.
 Perlas de vidrio.
Reactivos
 Solución Linfocell o
Linfoprep.
 Eritrocitos de carnero
al 2%.
 Solución de Hanks.
 Alcohol.
Equipo
 Centrifuga
clínica
Procedimiento
Parte A. Preparación del método
Preparación de células indicadoras
1. Obtener 5 ml de sangre periférica de carnero en condiciones asépticas en
tubos con anticoagulante. La muestra puede ser almacenada en
refrigeración hasta por 4 semanas.
2. Lavar 3 veces los eritrocitos con SSF, centrifugando a 2000 rpm durante 7
minutos cada vez.
3. Resuspender el botón eritrocitario en 1 ml de TBE.
4. Realizar una dilución al 6% de eritrocitos (llevando el ml de eritrocitos a un
volumen final de 17.5 ml).
Procedimiento de rosetas
1. Tomar de 3 a 5 ml de sangre y desfibrinar.
2. A 2 ml de sangre desfibrinada agregar 2 ml de solución de Hanks.
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3. Tomar 1 ml de esta disolución y agregárselos a 2ml de Linfoprep.
Centrifugar a 1000 rpm durante 15 minutos para separación de linfocitos.
4. Con una pipeta Pasteur tomar los linfocitos y pasarlos a un tubo 12x75 y
lavar con 2 ml de solución de Hanks. Centrifugar a 3000 rpm durante 5
minutos.
5. Observar el anillo que se forma al fondo del tubo, son los linfocitos. Eliminar
con mucho cuidado la solución de Hanks con una pipeta Pasteur a dejar +/0.25 ml.
6. Agitar suavemente y con una pipeta Pasteur colocar una gota en un
portaobjetos para observar al microscopio si hay leucocitos.
7. Aparte preparar una solución de eritrocitos de carnero al 1%.
8. Del paso 6 queda 0.25 ml de linfocitos en Hanks. Añadir 0.25 ml de E. de C.
al 1%. Centrifugar a 500 rpm.
9. Incubar a 37°C durante 15 minutos.
10. Con mucho cuidado se suspende el paquete celular. Se toma una gota con
una pipeta Pasteur y se coloca en porta y cubreobjetos.
Parte B. Examen de rosetas.
1. Se observan al microscopio utilizando el objetivo seco fuerte.
2. Se cuentan 100 linfocitos y se toman como rosetas aquellos que tengan 3 o
más eritrocitos adheridos a su superficie.
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Cuál es la función característica de los linfocitos T?
2. Menciona otros métodos de identificación de linfocitos T
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3. ¿Qué característica permite la formación de rosetas de linfocitos T?
4. Explica porque razón se utilizan eritrocitos de carnero y no eritrocitos
humanos
5. ¿En qué órgano ocurre el proceso de maduración de linfocitos T?
B) Diagrama de flujo del método de rosetas EAC.
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Práctica 3
IDENTIFICACIÓN DE LINFOCITOS B
Fundamento
Los linfocitos B son las células productoras de anticuerpos (inmunidad
humoral), sus primeras fases de maduración transcurren en la médula ósea (en
inglés, Bone marrow), gracias a la cual adquirieron su nombre.
Cuantificación de linfocitos B
La mayoría de los linfocitos residen en los órganos linfáticos, razón por la
cual es difícil su cuantificación exacta en los tejidos periféricos. Los linfocitos B se
distinguen por la síntesis de inmunoglobulinas de superficie, mismas que portan
en el exterior, éstas deben ser diferenciadas de las inmunoglobulinas absorbidas;
estas células también pueden ser detectadas por la presencia de receptores Fc y
un receptor para el tercer componente del complemento (C3). Del 10 al 25% de
los linfocitos circulantes portan estos marcadores. Es importante que las células B
sean enumeradas tanto en porcentaje como en números absolutos.
Se encuentran problemas técnicos con todos los métodos de identificación
de marcadores usados; las inmunoglobulinas de superficie membranal (IgS) son
las más específicas, pero son las que presentan más problemas, puesto que dan
resultados falsos positivos gracias a que los complejos y los agregados en las
pruebas de antisueros se unen a receptores Fc. Es posible usar una amplia gama
de antisueros específicos para poder identificar las diferentes clases y subclases
de inmunoglobulinas.
Los Fc y C3 de los linfocitos pueden ser detectados por los métodos de
rosetas con células rojas tratadas adecuadamente, sin embargo, los monocitos
también presentan esta característica, por lo que es necesario identificar a los
monocitos por su capacidad de fagocitar partículas de látex, o removerlos
mediante la adherencia con plástico/nylon; ninguno de estos métodos es
completamente confiable, ya que no todos los monocitos pueden ser fagocitos y
algunas células B pueden ser removidas por dichos métodos de adherencia.
Identificación de los linfocitos B
El porcentaje de linfocitos B portadores de diferentes clases de IgS en
personas normales tiene poca relación con el nivel sérico de la mismas
inmunoglobulinas; en algunas inmunodeficiencias estos niveles no guardan
relación, como en la agamaglobulinemia de Bruton, que los niveles de IgS están
bajos e incluso ausentes, en cambio en la hipogamaglobulinemia, los niveles
séricos se encuentran normales. Otro ejemplo se encuentra en los pacientes con
deficiencia aislada de IgA, los cuales tienen una población normal de linfocitos
circulantes con IgA.
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Métodos para determinar la cantidad de células B
Uno de los métodos utilizados se basa en que los linfocitos B tienen
receptores de membrana para C3, gracias a esto tienen la capacidad de formar
rosetas con las células rojas cubiertas de complemento, las células rojas que se
utilizan son eritrocitos de carnero (E) tratados con anticuerpos de eritrocito (A) y
complemento humano (C). Otro método de identificación consiste en el uso de
anticuerpos anti-inmunoglobulina, los cuales pueden ser marcados con cromóforos
como la fluoresceína (método directo o método de anticuerpo primario), o pueden
no estar marcados y depender del uso de un segundo anticuerpo marcado en
contra del primero (método indirecto o método de anticuerpo secundario).
Objetivo general
 Analizar la participación de los linfocitos B en la respuesta inmune y aprender
los métodos empleados para la identificación de los mismos.
Objetivos particulares
 Identificar a los linfocitos B utilizando el método de rosetas “EAC”.
Rosetas de linfocitos B (EAC)
Recursos
Material
Reactivos
Equipo
 Tubos de ensayo de 10 x  Eritrocitos de carnero (en
 Centrifuga
75 mm
solución de Alsever al 50%)
clínica
 Suero con IgM antieritrocito de carnero
 Suero fresco humano
congelado (frío) AB
 Colorante May-GrunwaldGiemsa
 Solución
Linfocell
o
Linfoprep.
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Procedimiento
Parte A. Preparación del método
Preparación de células indicadoras
 Lavar 3 veces 0.5 ml de eritrocitos con solución salina, al final
suspenderlos en 5 ml de solución salina.
 Añadir 0.1 ml de suero de conejo con IgM anti-eritrocito de carnero a
dosis de subhematoglutinación e incubar a 37°C por 20 minutos
agitando la muestra.
 Lavar 3 veces en solución salina y resuspenderlo en 10 ml de solución
salina.
 Añadir 0.3 ml de suero fresco humano congelado AB como fuente de
complemento e incubar a 37°C por 20 minutos mezclando
repetidamente.
 Lavar 3 veces en solución salina y resuspenderlo en 5 ml de solución
salina (solución EAC).
Nota: La suspensión debe estar fresca y preparada para el día de la prueba; si ya
pasó más de una hora entre la preparación y su uso, lavar una vez más en
solución salina.







Preparación de linfocitos
Se obtienen 5 ml de sangre venosa de un voluntario con la jeringa heparinizada se
mezcla bien por inversión.
Con la misma jeringa se toman 5ml de SSA y se mezcla bien por inversión.
De la sangre diluida se estratifica 4 ml sobre 2.5 ml de la solución Linfoprep
contenida en un tubo de ensaye.
se centrifuga a 1500 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente (centrifuga
clínica).
En la interfase entre Linfoprep y el plasma diluido quedan los linfocitos los cuales
se recuperan con una pipeta Pasteur.
se transfieren las células a un tubo de ensaye y se lavan por centrifugación tres
veces con SSA a 1500 rpm durante 4 minutos (centrífuga clínica).
las células recuperadas se cuentan y se ajustan a una concentración de 4x10 6
linfocitos/ml utilizando pipetas Thomas para leucocitos.
Procedimiento de rosetas
 Añadir 8 a 10 gotas de suspensión de EAC (radio 8:1) a 0.5 ml de
suspensión de linfocitos (aprox. 2x106/ml).
 Mezclar la suspensión y sedimentar por centrifugación gentil a 25g por 5
minutos.
 Incubar a 37°C por 40 minutos.
 Resuspender por aspiración hasta eliminar los grumos.
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
Con mucho cuidado se suspende el paquete celular. Se toma una gota
con una pipeta Pasteur y se coloca en porta y cubreobjetos.
Parte B. Examen de rosetas.
Se debe tener cuidado al observar, ya que los polimorfismos y los
monocitos también pueden formar rosetas EAC, para identificar
adecuadamente las rosetas B EAC se toma en cuenta que éstas son más
pequeñas y tienen una capa de células rojas adherentes. Para excluir esta
formación de rosetas debido a los receptores Fc de otras células, se utiliza
una fracción IgM de suero anti-eritrocítico.
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Cuál es la característica principal de los linfocitos?
2. Menciona la función de los linfocitos B y en dónde transcurren sus primeras
fases de maduración
3. ¿A qué tipo de respuesta inmunitaria pertenece la activación de linfocitos B
(producción de anticuerpos)?
4. Menciona la razón por la cual es difícil la cuantificación exacta de los
linfocitos en los tejidos periféricos
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5. ¿Qué características presentan los linfocitos B que
diferenciación de otras células del sistema inmune?
permiten su
6. Menciona los métodos para identificar linfocitos B en el laboratorio
7. ¿Qué característica permiten identificar y diferenciar a los monocitos?
8. Menciona la diferencia entre el método directo y el indirecto para la
identificación de linfocitos B
B) Diagrama de flujo del método de rosetas EAC.
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Práctica 4
HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA
PRUEBAS INTRADÉRMICAS
Fundamento
La reacción de hipersensibilidad inmediata se conoce de esta forma debido
a su rápida aparición, la cual ocurre inmediatamente después del contacto con el
antígeno y ocasiona consecuencias patológicas importantes (hipersensibilidad).
Las respuestas inmunitarias a los antígenos ambientales dan lugar a la
diferenciación de los linfocitos TH2 CD4+ y a la síntesis de anticuerpos de la clase
IgE que se unen a los receptores Fc de los mastocitos y basófilos, cuando el
anticuerpo se entrecruza con el antígeno, éstas células se activan y liberan
rápidamente diversos mediadores como histaminas, leucotrienos, entre otros, que
provocan un aumento de la permeabilidad vascular, vasodilatación, contracción
del músculo liso bronquial y visceral e inflamación local, lo que comprende una
reacción de hipersensibilidad inmediata, si esto ocurre en la piel, se manifiesta a
manera de habones o ronchas circunscritas y un área de edema, rodeada de
inflamación; en la práctica clínica, estas reacciones se conocen como alergias o
atopias.
La reproducción de una reacción de hipersensibilidad inmediata se logra
mediante la aplicación directa de pequeñas cantidades de extractos alergénicos
sospechosos dentro de la piel, esto es de gran ayuda diagnóstica en medicina.
Las pruebas intradérmicas se han utilizado con gran éxito para la detección de
pacientes alérgicos que presentan signos y síntomas característicos, ya que en
manos expertas proporcionan un parámetro de gran confianza diagnóstica y
terapéutica, una de sus ventajas es que pueden realizarse en poco tiempo y
representan un mínimo riesgo para el paciente.
Las técnicas para el diagnóstico de alergias comprenden dos grupos,
aquellas que se realizan directamente en las personas (in vivo) y aquellas que se
realizan en el laboratorio (in vitro); todas han sido probado y estudiadas
ampliamente para saber su especificidad, sensibilidad y positividad predictiva, por
lo que son muy confiables.
Las pruebas in vivo incluyen las pruebas intradérmicas con alergenos y las
pruebas de exposición directa con sustancias alergénicas (método de Prick); de
estas dos pruebas, las intradérmicas son las preferidas por su especificidad,
predictividad y facilidad para realizarse. Las pruebas intradérmicas tienen varias
ventajas, entre las cuales se encuentran la rapidez con la que son realizadas, la
simplicidad, el bajo costo y su alta sensibilidad. Gracias a estas pruebas se puede
identificar el agente productor de alergia, como polen, hongos, pelos, caspa de
animales, etc; se realizan preferentemente en los brazos en sesiones de varios
días, en las cuales se utilizan antígenos a diferentes concentraciones en series
progresivas.
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Dentro de las pruebas cutáneas tenemos 3 alternativas: la estimación
directa de niveles séricos de IgE, la eliminación de histamina de leucocitos
periféricos y el RAST (radioalergeno-absorbencia); los últimos dos métodos son
más exactos pero menos sensibles, debido a esto no se prefieren. Las
indicaciones clínicas para realizar estas pruebas se hacen ante cualquier
sospecha clínica de que un signo o síntoma sea resultado de una alergia, esta
decisión la debe tomar el médico, basándose en la observación y en la historia a la
exposición de alergenos conocidos.
Objetivo general
 Conocer las características principales de las reacciones de hipersensibilidad
inmediata.
 Aprender a realizar pruebas intradérmicas de hipersensibilidad inmediata.
Objetivos particulares
 Conocer los elementos participantes en la reacción de hipersensibilidad
inmediata.
 Entender el mecanismo fisiopatológico de las reacciones de hipersensibilidad
inmediata.
 Entender los principios de diagnóstico inmunológico en las enfermedades
alérgicas.
Pruebas intradérmicas
Recursos
Material
Reactivos
Equipo
 Jeringas hipodérmicas  Diferentes
alergenos
de insulina
diluidos en soluciones de
Evans a concentraciones
 Algodón
de 1:1000 y 1:10 000.
 Antígenos de polvo, gato,
perro, algodón, tabaco,
ganado, ácaro, pólenes y
hongos.
 Alcohol 90%
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Procedimiento
Nota: estas pruebas deben realizarse con cuidado debido a las reacciones
alérgicas generalizadas que aunque raramente, se pueden presentar y son fatales.
En caso de una reacción anafiláctica se debe poner un torniquete arriba del sitio
de la prueba e inyectar 0.1cc de adrenalina acuosa 1:1000, la cual debe estar
siempre a la mano.
1. Tomar una jeringa estéril desechable de 1ml de tuberculina con aguja de
26x12 (1cm) y llenarla con 0.1 ml de solución a probar, cuidar que la jeringa
no tenga burbujas.
2. Limpiar muy bien con alcohol la zona de la piel en donde se aplicará la
prueba (preferentemente en el brazo).
3. Los sitios de aplicación se marcan apropiadamente para distinguir cada
sustancia, deben estar separados al menos 7.6 cm uno de otro para
prevenir solapamiento de las reacciones.
4. Aplicar la solución intradérmicamente; si se usa el brazo la piel debe jalarse
por detrás, se pone la jeringa a un ángulo de 45° con el bisel hacia abajo,
se introduce la aguja y lentamente se deposita la sustancia.
5. Se utilizará un control con histamina para verificar la calidad de la técnica,
con la solución base de histamina al 0.01% con 0.275mg de fosfato de
histamina (Eli Lily & Co Indianapolis) por ml de diluyente (11.5 mm de
roncha con +- 2.1mm).
6. La lectura se realiza 15 minutos después, se reporta si hay formación de
pápula o eritema inmediato o tardío, guiándose con la siguiente tabla:
Grado Tamaño del eritema (mm) Tamaño de la roncha (mm)
0
<5
<4
+-
5-10
5-10
1+
11-20
5-10
2+
21-30
5-10
3+
31-40
10-15 (con pseudópodos)
4+
>40
>15 (con pseudópodos)
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Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Qué otros nombres reciben las reacciones de hipersensibilidad inmediata?
2. ¿Cuál es la inmunoglobulina que se encuentra en las reacciones de
hipersensibilidad inmediata?
3. Menciona brevemente la
hipersensibilidad inmediata
fisiopatología
de
las
reacciones
de
4. ¿De qué manera se logra la reproducción de una reacción de
hipersensibilidad inmediata en una paciente?
5. ¿En qué consiste el método de Prick?
6. ¿Cuáles son los métodos que se pueden utilizar dentro de las pruebas
cutáneas y cual se prefiere?
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7. Menciona al menos 3 ventajas de las pruebas intradérmicas
B) Diagrama de flujo de las pruebas intradérmicas.
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Práctica 5
DEGRANULACIÓN DE BASÓFILOS
Fundamento
Los mastocitos, los basófilos y los eosinófilos son las células efectoras de
las reacciones de hipersensibilidad inmediata o de tipo I y por lo tanto de la
enfermedad alérgica. Aunque cada una de estas células tiene sus propias
características, las tres tienen gránulos citoplásmicos que contienen mediadores
importantes de las reacciones alérgicas y las tres sintetizan mediadores lipídicos y
citocinas que desencadenan la inflamación. Los basófilos son granulocitos
sanguíneos que derivan de progenitores existentes en la médula ósea, maduran
en la misma y circulan en la sangre, estas células representan menos del 1% de
los leucocitos y sus gránulos se tiñen con colorantes básicos.
Las alergias a los medicamentos representan un problema frecuente, por lo
que su prevención, reconocimiento y diagnóstico temprano son muy importantes.
Las pruebas cutáneas son de gran ayuda, aunque sólo muestran si la piel del
paciente es hipersensible a la droga, pero no indican que ésta sea capaz de
provocar una respuesta sistémica; es por esta razón que la prueba confirmatoria
es la degranulación de basófilos, la cual valora la hipersensibilidad que se
presenta ante dicha droga en un sistema in vitro, mediante la observación de la
respuesta biomorfológica del basófilo ante la droga, ya que esta prueba es
realizada in vitro, es completamente segura para el paciente. También es útil la
degranulación de basófilos para diagnosticar la hipersensibilidad a insectos o a su
veneno, como es el caso de las personas sensibles al veneno de abeja; o puede
ser solo un criterio de hipersensibilidad inmediata en situaciones no alérgicas.
Esta prueba se originó en 1958 gracias a Shilley, que observó un choque
anafiláctico en un paciente alérgico a la penicilina, Shilley encontró que los
basófilos son un índice citológico útil para medir la anafilaxia y realizó estudios en
diferentes especies de animales, finalmente concluyó que al colocar los basófilos
de conejo (similares a los de humano) en el suero de pacientes sensibles a la
penicilina y añadir la misma, los basófilos presentaban degranulación, lo cual no
ocurría con el suero de personas no sensibles a la penicilina.
Otros estudios han demostrado que la degranulación de basófilos también
es útil como indicador de la reacción antígeno anticuerpo y que ésta varía en
proporción a las cantidades del antígeno, por esta razón se cree que el sistema de
células cebadas-basófilo tienen respuestas paralelas y ambas células liberan el
complejo histamina-heparina en una reacción alérgica, esto explica que los
esteroides y los antihistamínicos puedan inhibir el fenómeno de la degranulación.
La degranulación de basófilos es tiempo-dependiente, esto es que puede
ser negativa una o dos semanas después del choque anafiláctico debido a la
depleción de anticuerpos; puede ser alterada por varios factores como la lipemia
(la ingesta de 4mg/kg de margarina y niveles séricos de 8mEq/L de triglicéridos),
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la cual puede causar la degranulación en el 75% de las veces, sin embargo, no
hay correlación entre el nivel de lipemia y el porcentaje de degranulación.
Objetivo general
 Conocer la participación de los basófilos en la respuesta inmune tipo I.
 Aprender la técnica de degranulación de basófilos.
Objetivos particulares
 Revisar el proceso fisiopatológico de la respuesta inmune tipo I.
 Realizar la técnica de degranulación de basófilos.
Recursos
Material
 15 tubos de
ensayo de 10x75
ml.
 3
pipetas
Pasteur
con
bulbo.
 2
pipetas
graduadas
de
1ml.
 1
pipeta
graduada
de
5ml.
 Portaobjetos
Reactivos y muestras
Equipo
 2ml de sangre heparinizada de  Centrífuga
una persona alérgica a un  Estufa
a
medicamente (especificar a cuál).
37°C
 El medicamento al cual es  Microscopio
alérgica.
 2ml de sangre heparinizada de
una persona sana como control
negativo.
 2ml de sangre heparinizada de
una persona alérgica al veneno de
abeja como control positivo.
 linfoprep.
 Solución salina 0.95%.
 Colorante rojo neutro.
 Colorante azul de Toluidina.
Procedimiento
1. Una vez tomadas las muestras entre los 120 días posteriores a la ingesta
de la droga reactante, se realiza el método de aislamiento de células
mononucleares de la misma manera que en la técnica de determinación de
rosetas de linfocitos B
2. Se obtiene un paquete de células blancas (basófilos) mediante la
centrifugación y purificación con linfoprep. de los 2ml de sangre
heparinizada de cada paciente.
3. Preparar diluciones de la droga reactante a concentraciones de 1:100,
1:1000 y 1:2000, diluirlas con solución salina fisiológica al 0.95%.
4. Poner en contacto las células rojas con las diferentes diluciones.
5. Añadir 2 gotas de rojo neutro e incubar a 37°C por 20 minutos.
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6. Realizar un frotis de células y dejar secar, posteriormente teñir con azul de
Toluidina.
7. Usar las células blancas del individuo sano y las del individuo alérgico al
veneno de abeja como controles.
8. Se observa al microscopio y se cuentan 1000 células y los basófilos que se
encuentren entre ellas, para comparar el número de basófilos de las
muestras control con la muestra problema.
9. La muestra será positiva si presenta 2 o más degranulaciones mayores al
20% respecto de la muestra control.
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Cuáles son las células efectoras de las reacciones de hipersensibilidad
inmediata o de tipo I?
2. Describe a los basófilos
3. Describe brevemente la fisiopatología de la degranulación de basófilos
4. ¿Por qué no es suficiente una prueba cutánea para diagnosticar alergia a
los medicamentos?
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5. ¿Cuál es la prueba confirmatoria de alergia a algún medicamento?
6. ¿Qué medicamentos se pueden utilizar para inhibir el fenómeno de la
degranulación?
7. ¿Qué factores pueden alterar la degranulación de basófilos?
B) Diagrama de flujo de la degranulación de basófilos
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Resultados
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Práctica 6
CUANTIFICACIÓN DE EOSINÓFILOS EN SECRECIÓN
NASAL
Fundamento
Los eosinófilos son granulocitos procedentes de la médula ósea, ahí
maduran y posteriormente circulan en la sangre, sus gránulos contienen proteínas
básicas que se unen a los colorantes básicos como la eosina; estas células se
presentan abundantemente en los infiltrados inflamatorios de las reacciones
tardías y contribuyen a muchos de los procesos patológicos de las enfermedades
alérgicas. Las citocinas producidas por los linfocitos T H2 activan a los eosinófilos y
los atraen hacia los focos de inflamación en fase tardía, la IL-5 es una citocina que
estimula la maduración de los eosinófilos, también es activadora de los mismos y
mejora su capacidad para liberar el contenido de los gránulos, el cual contiene
proteínas tóxicas para los parásitos y que pueden dañar a los tejidos normales.
En los procesos inflamatorios que tienen como factor desencadenante a un
parásito o a procesos alérgicos, se encuentra infiltración de eosinófilos, se sugiere
que estos cumplen un papel de fagocitosis de complejos inmunes y desactivación
de la histamina liberada de los tejidos por los mastocitos. Los eosinófilos tienen
dos tipos de gránulos, unos pequeños de tipo lisosomas dotados de fosfatasa
alcalina y otros de mayor tamaño dotados de arginina y cristales de Charcot-lydn.
La eosinofilia es característica de los procesos autópicos, y puede aumentar
si aumenta el contacto con el alérgeno, la eosinofilia es favorecida por la liberación
del factor quimiotáctico eosinofílico (FQE) de las células cebadas degranuladas;
debido a esto una persona atópica puede presentar eosinofilia en sangre periférica
y en moco nasal, o puede que la presente en uno y en el otro esté normal.
Objetivo general
 Identificar a los eosinófilos en la secreción nasal.
Objetivos particulares
 Valorar la respuesta celular en la secreción nasal.
 Realizar la técnica de tinción de eosinófilos.
Recursos
Material
 Portaobjetos
 Hipos estériles
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Reactivos y muestras
 Colorante de Wrigth
 Mucosa nasal
Equipo
 Microscopio
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Procedimiento
1. Se tomará una muestra de secreción de la mucosa nasal con un hisopo
estéril, se debe hacer de forma giratoria.
2. Correr suavemente la muestra sobre el portaobjetos.
3. Dejar secar a temperatura ambiente.
4. Teñir con la técnica de Wrigth
5. Observar al microscopio la presencia de eosinófilos y sus características,
usar aceite de inmersión.
6. Los resultados se interpretan de la siguiente manera:
a. Más del 10% de eosinófilos en personas atópicas.
b. 0% de eosinófilos en personas no atópicas.
Actividades
A) Cuestionario
1. Describe a los eosinófilos
2. ¿En dónde podemos encontrar infiltrados de esosinófilos?
3. ¿Cuál es la citocina que estimula la maduración de los eosinófilos y los
activa para liberen el contenido de sus gránulos?
4. ¿Cuáles son los tipos de gránulos que encontramos en los eosinófilos y qué
contienen?
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5. Mencione los valores normales de eosinófilos en la secreción nasal en
personas atópicas y no atópicas
B) Diagrama de flujo de la cuantificación de eosinófilos en la secreción nasal
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Práctica 7
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD HEMOLITICA DEL
COMPLEMENTO POR IDR
Fundamento
El sistema del complemento está constituido por un conjunto de
glicoproteínas plasmáticas presentes en el organismo a manera de zimógenos, las
cuales tienen la capacidad de ser activadas frente a estímulos de diferente
naturaleza.
La activación de este sistema se realiza de forma secuencial también
denominado sistema en cascada y forma parte importante de los mecanismos
inespecíficos de la inmunidad en vertebrados, participando principalmente en
actividades como la promoción de la inflamación y de la fagocitosis, el ataque lítico
hacia membranas y la facilitación de la remoción de complejos inmunes.
Dependiendo que estímulo es el responsable de activar la cascada puede
ser clasificado dentro de alguna de las siguientes vías:
Vía clásica: Iniciada por el reconocimiento de los complejos antígeno-anticuerpo,
principalmente los de origen IgM, IgG1 e IgG3, para su activación es indispensable
la presencia de iones Ca++ y Mg++. El orden de activación de los componentes en
esta vía es el siguiente Ag-Ac → C1→C4→C2→C3→C5→C6→C7→C8→C9, las
consecuencias biológicas de su activación incluyen el aumento de: la
permeabilidad vascular, la quimiotaxis de polimorfomucleares, la adherencia
celular etc.
Vía alterna: Es la vía filogenéticamente más antigua iniciada por la detección de
polímeros de superficie de origen bacteriano o vírico (ej. Polisacáridos), en esta
vía no participan los factores C1, C4 y C2 en su lugar encontramos a los factores
D, C3, B C3b y P. El orden de activación es el siguiente Polisacárido→
C3→C3b→D→B→P→C3→C5→C6→C7→C8→C9.
Vía de las Lectinas: Se inicia por lectinas que reconocen residuos de manosa en
las superficies microbianas, como la MBL (mannose-binding lectin).
Todas estas vías de activación conducen a una fase efectora común, que
culmina con el ataque lítico a membranas.
La medición y monitoreo del complemento es realizado con el objeto de
detectar y cuantificar el grado de producción y consumo del complemento y con
ello diagnosticar las deficiencias del mismo, ya sean deficiencias de tipo genético
o provocadas por algún factor secundario.
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Algunas de las alteraciones de importancia clínica del complemento son: En
inmunodeficiencias, existen defectos en este sistema, los cuales por lo general
consisten en la ausencia o la falta de funcionalidad de alguno de los factores de la
cascada, generalmente por causas genéticas.
En las enfermedades autoinmunes, las proteínas del complemento juegan
un papel importante en la lesión a los tejidos, determinación puede orientar el
diagnóstico, evaluar el curso y actividad de la enfermedad y dar una idea de la
severidad del daño.
Algunas patologías donde podemos encontrar de cambios en los niveles del
complemento son:
Patologías que aumentan los niveles de complemento: Síndrome de Reiter,
Ictericia obstructiva, Gota, diabetes, tiroiditis, artritis reumatoide, Fiebre reumática
aguda, Fiebre tifoidea, Periarteritis nodosa, Colitis ulcerativa, Dermatomiositis e
Infarto agudo al miocardio.
Patologías que disminuyen los niveles de complemento: Lupus eritematoso
sistémico, Enfermedad del suero, Cirrosis hepática avanzada, Hepatitis infecciosa
con artritis, Edema angioneurótico hereditario, Deficiencia hereditaria de C2,
Hemoglobinuria paroxística nocturna, Coagulación intravascular diseminada,
Inmunodeficiencia combinada grave, Glomerulonefritis membranoproliferativa,
Glomerulonefritis aguda, Enfermedades por complejos inmunes, Linfoma,
Rechazo de aloinjertos, Crioglobulinemia mixta (IgG-IgM), Endocarditis infecciosa
con glomerulonefritis, Miastenia gravis y Derivaciones ventriculoarteriales
infectadas.
Metodología para la determinación de complemento.
La determinación del sistema del complemento presenta algunas
dificultades dada la complejidad propia de la cascada, la labilidad de sus
componentes y su inhibición por factores reguladores. Estos factores limitantes
dificultan la reproducibilidad de muchas de las técnicas.
Las principales técnicas empleadas para determinar el complemento
pueden dividirse en dos conjuntos generales: las pruebas funcionales y las
pruebas inmunoquímicas, cada conjunto posee diversas virtudes y limitaciones,
por lo que generalmente se emplean en combinación para obtener mejores
resultados.
La cuantificación de los componentes mayoritarios (C3, C4 y Cq), puede
realizarse mediante técnicas como inmunodifusión radial o inmunonefelometría. La
principal limitante de esta técnica es su capacidad de detectar tanto componentes
funcionales normales, como aquellos sin función (mutados, inactivados etc.). Por
ejemplo, algunos antisueros empleados en placas de inmunodifusión radial
pueden reaccionar con fragmentos de degradación de los componentes nativos, lo
cual puede originar valores falsos positivos.
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De la misma manera han desarrollado métodos para la cuantificación
funcional de cada uno de los componentes del sistema del complemento. Sin
embargo, estos métodos son metodológicamente muy complejos y relativamente
caros, por lo que su uso se restringe a laboratorios especializados en este campo.
Determinación del complemento hemolítico total por medio de placa de IDR.
El kit del complemento hemolítico total se encuentra diseñado para detectar
deficiencias en la vía clásica del complemento y los componentes de la vía común.
Esta prueba puede ser empleada en el monitoreo de la actividad total del
complemento, por lo que su utilidad clínica se encuentra como prueba de tamizaje
para personas con defectos del sistema del complemento.
Objetivo general
 Comprender el proceso de una reacción de inflamación.
Objetivos particulares
 Identificar las células del sistema inmune en respuesta a una lesión
inflamatoria.
Recursos




Material
1 placa de I.D.R. complemento
1 jeringa de 3ml
2 tubos de ensayo de 10 x 75 ml
1 pipeta Pasteur con bulbo
Reactivos
Equipo
 Centrifuga
clínica
Procedimiento
1. Extraer 3ml de sangre y colocarla en un tubo de ensayo de 10 x 75 ml
2. Centrifugar a 2000 rpm para separar el suero
3. Colocar 0.5 µl de suero en una de las horadaciones de la placa
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4. Colocar los controles necesarios
5. Incubar de 24 a 48 horas
6. Medir el halo de hemólisis formado y realizar una curva con los datos
obtenidos
7. Calcular concentración y reportar
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Cuál es la función del sistema del complemento?
2. ¿Cuáles son los factores que participan en la vía común del complemento?
3. ¿A qué tipo de inmunidad corresponde el sistema del complemento?
4. ¿Cuáles son las principales moléculas de origen microbiano responsables
de activar el complemento?
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5. Mencione 3 patologías que alteran las concentraciones de los niveles del
complemento y describa si aumentan o disminuyen sus valores
B) Diagrama de la determinación del complemento por IDR.
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Práctica 8
IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS LE
(LUPUS ERITEMATOSO)
Fundamento
Una de las principales características del sistema inmune es que en
condiciones normales no reacciona contra sus propios constituyentes, hay
diversos mecanismos que permiten al sistema inmune tolerar lo propio e identificar
y destruir lo extraño, pero en ocasiones estos mecanismos se pierden y el sistema
inmune genera autoanticuerpos, lo cual puede que no genere problemas, o de lo
contrario, que se desarrolle una enfermedad autoinmunitaria.
Según la teoría de eliminación clonal de Burnet, todos los individuos deben
nacer carentes de las clonas celulares capaces de reconocer a los antígenos
propios y por lo tanto, incapaces de desarrollar respuestas autoinmunes; sin
embargo se presentan las enfermedades autoinmunes, para lo cual existen varias
explicaciones: tolerancia inmunológica y supresión activa, liberación de antígenos
secuestrados, reactividad cruzada (mimetismo molecular), activación policlonal,
factores genéticos, antígenos HLA y autoinmunidad.
Existen muchas enfermedades autoinmunes, y se pueden clasificar
principalmente en las enfermedades de órganos específicos y en las
enfermedades sin órgano específico (sistémicas). En las enfermedades de
órganos específicos los anticuerpos se dirigen contra componentes del órgano
afectado; un ejemplo son las enfermedades tiroideas autoinmunitarias, que
comprenden 3 tipos: enfermedad de Graves o hipertiroidismo, enfermedad de
Hashimoto o hipotiroidismo y Mixedema con ausencia total de función tiroidea. En
las enfermedades sin órgano específico los anticuerpos no están dirigidos contra
un componente en especial, sino que atacan a varios componentes de varios
órganos, un ejemplo de esto es el Lupus Eritematoso Sistémico.
Debido a la gran variedad de enfermedades autoinmunes, no solo se
clasifican dependiendo la extensión en órgano específicas y órgano inespecíficas,
sino que también se clasifican de acuerdo a su relación con los antígenos de clase
I o II del CMH.
El Lupus eritematoso sistémico (LES) se caracteriza por afección cutánea
en la cara en forma de alas de mariposa (eritema) y afección a varios órganos; es
una enfermedad multisistémica crónica con remisiones y reactivaciones, afecta
principalmente a las mujeres entre 20 y 60 años de edad, con una relación
mujer:hombre de 10:1. En esta enfermedad se encuentran autoanticuerpos contra
ADN y autoanticuerpos contra diversos constituyentes celulares, los complejos
inmunitarios que se forman, se depositan en varios sitios, estimulando la
inflamación generalizada, la citotoxicidad dependiente de anticuerpos y la
activación de fagocitos. Los anticuerpos que se encuentran más frecuentemente
en estos pacientes son los anticuerpos antinucleares anti-ADN, anticuerpos contra
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las ribonucleoproteínas, contra histonas y antígenos nucleorales, contra eritrocitos
y plaquetas, entre otros.
Las principales manifestaciones clínicas son: erupciones cutáneas, artritis,
glomerulonefritis, vasculitis de pequeñas arterias en todo el cuerpo, anemia
hemolítica, trombocitopenia y afectación del SNC. La prueba fundamental para el
diagnóstico de la enfermedad es la presencia de anticuerpos antinucleares
(anticuerpos contra el ADN nativo de doble cadena).
Prueba para el Lupus Eritematoso Sistémico
Es una prueba que tiene como objetivo determinar la presencia de un tipo
especial de células que indican dicho padecimiento, por lo tanto se utiliza como
prueba diagnóstica de LES. La forma en que se realiza el examen es la siguiente:
se extrae sangre venosa en un frasco hermético o jeringa, en bebés o niños
pequeños se punza con una aguja o lanceta y se recoge la sangre en un tubo
pequeño de vidrio, en una lámina de vidrio o en una tira de examen;
posteriormente se prepara la muestra y se buscan al microscopio las células LE.
El valor normal de esta prueba es la ausencia de dichas células, en presencia de
valores anormales se deben descartar artritis reumatoide con esclerodermia y
sensibilidad a los medicamentos, pues en ocasiones estos pacientes muestran un
examen de células LE positivo, los pacientes con LES que presentan un examen
positivo varían de un 50 a un 75%.
Objetivo general
 Conocer los principios básicos de la autoinmunidad.
 Identificar qué enfermedades se consideran autoinmunes.
Objetivos particulares
 Conocer las características del Lupus Eritematoso Sistémico.
 Identificar a las células LE (Lupus Eritematoso).
Recursos
Material
 Capsula de porcelana
 Tubo de Wintrobe
 Portaobjetos
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Reactivos y muestras
Equipo
 Muestra de sangre en  Incubadora
tubo seco
 Microscopio
 Colorante de Wrigth
óptico
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Procedimiento
1. Se obtiene la muestra de sangre y se deja coagular.
2. Con la ayuda de aplicadores se intenta eliminar la mayor cantidad de fibrina
de la muestra.
3. Incubar la muestra a 37°C durante 2 horas.
4. Decantar el suero liberado y comprimir el paquete en una malla para que el
coágulo se quede en ella y las células y el suero pasen a la cápsula de
porcelana.
5. La muestra traumatizada se pone en tubos de Wintrobe y se centrifuga
durante 10 minutos.
6. Se hace un frotis y se tiñe con la técnica de Wrigth.
7. Se observa el frotis con el microscopio con el objetivo 40X buscando
posibles células LE y se verifican con el objetivo 100X.
8. Para dar un resultado observar por lo menos 500 PMN.
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Qué es una enfermedad autoinmune?
2. Menciona las posibles explicaciones para una enfermedad autoinmune
3. ¿Cómo se clasifican las enfermedades autoinmunes?
4. Menciona por lo menos 3 ejemplos de enfermedades autoinmunes órgano
específicas
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5. Definición de Lupus Eritematoso Sistémico
6. ¿Cuáles son los autoanticuerpos que más frecuentemente se encuentran
en LES?
7. Menciona las principales manifestaciones clínicas del LES
8. ¿Cuál es la prueba diagnóstica del LES y en qué se basa?
B) Diagrama de flujo
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Resultados
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Práctica 9
INMUNOLOGÍA DEL CÁNCER
Fundamento
Según la OMS, se proyecta que para el 2020 habrá 15 millones de casos
nuevos de cáncer por año. En nuestro país el cáncer ocupa la segunda causa de
muerte. La inmunología del cáncer estudia el reconocimiento y la respuesta del
sistema inmune contra las células cancerosas, su estudio abarca desde la
transformación maligna de las células, el entendimiento de los tumores y la
evasión del sistema inmune hasta la aplicación en oncología con fines preventivos,
diagnósticos y de tratamiento (inmunoterapia).
En la mayor parte de los órganos y tejidos se conserva un equilibrio entre
la renovación y muerte celular, en circunstancias normales, la producción de
nuevas células es regulada por diversos mecanismos para que el número de
cualquier tipo particular de éstas se conserve constante, sin embargo, en
ocasiones aparecen células que no están reguladas por los mecanismos normales
de crecimiento, y pueden dar lugar a clonas que producen un tumor o neoplasia.
El cáncer es, en realidad, un grupo de enfermedades caracterizadas por una serie
de cambios en el genoma de las células.
La oncogénesis es un proceso representado por la activación de oncogenes
y la pérdida de la función de los genes supresores, en general, las características
distintivas del cáncer comprenden la autosuficiencia en señales de crecimiento,
insensibilidad a las señales de regulación del crecimiento, escape de los
mecanismos de apoptosis, replicación sin límite, fomento de la angiogénesis,
evasión del sistema inmune, invasión y metástasis. Se han podido identificar
algunos de los mecanismos que utilizan los tumores para evadir la respuesta
inmunológica, entre ellos se encuentran la escasa inmunogenicidad de los
antígenos tumorales, el acelerado crecimiento tumoral que llega a rebasar la
velocidad de la respuesta inmune, la ausencia o enmascaramiento de las
moléculas del CMH I, la secreción de factores que inhiben la activación de la
respuesta inmune, entre otros.
La capacidad del sistema inmune de discriminar entre células normales y
células tumorales es crítica para permitir la destrucción del tumor efectivamente, si
las células tumorales expresan moléculas que actúan como antígenos no propios
para el hospedero, antígenos nuevos que surgen durante el proceso de
transformación maligna celular, es posible que el sistema inmune sea capaz de
reconocer y destruir a estas células anormales mediante diversos mecanismos
como la respuesta específica por linfocitos T y anticuerpos o por medio de
componentes de la inmunidad innata como las células dendríticas, macrófagos y
células NK; gracias a esto, podemos clasificar a los antígenos tumorales según la
respuesta que ocasionen: respuesta humoral (anticuerpos), generación de células
CD4+ y generación de células CD8+ (citotóxicas).
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Algunos de los antígenos presentes en el cáncer se usan para monitorear el
curso del tumor, en el caso de los antígenos reconocidos por linfocitos T, es más
relevante para evaluar el rechazo a los tumores. Los antígenos reconocidos por
los linfocitos T se pueden agrupar en 4 categorías: en el primer grupo se
encuentran las mutaciones somáticas, son los antígenos presentes en un tumor
específico de un individuo; en el segundo grupo encontramos a los antígenos
específicos de un tumor pero que se encuentran en diferentes individuos, un
ejemplo son los antígenos virales; en el tercer grupo entran los antígenos producto
de genes normales con una distribución restringida en los tejidos; por último, en el
cuarto grupo se incluyen los antígenos compartidos en los tejidos, lo cual implica
un reconocimiento autoreactivo.
Uno de los tantos retos de la inmunoterapia es el contrarrestar los
mecanismos de evasión al mismo tiempo que se estimulan formas eficientes de
respuesta inmune contra las células cancerosas; es por esto que la inmunoterapia
se basa en varios métodos que incluyen el uso de antígenos (lisado de tumor,
proteínas tumorales, péptidos sintéticos y ADN), células activadas (células
dendríticas, células T citotóxicas y células NK), anticuerpos específicos, citocinas
conjugadas o modificadas y terapia génica.
Objetivo general
 Conocer los principios básicos del cáncer.
Objetivos particulares
 Conocer los mecanismos que utilizan las células tumorales para evadir al
sistema inmune.
Principio básico del método
El modelo de ratones con linfoma murino L-5178-Y representa un buen
ejemplo de supresión de la respuesta inmune celular, a través de los diferentes
mecanismos de evasión inmunológica, en este caso la inmunosupresión se logra
gracias a la acción supresora de una glucoproteína presente en el líquido ascítico
y plasma de estos ratones.
La inmunosupresión se verifica mediante la prueba del dinitro-fluorobenceno (DNFB), este agente ocasiona una reacción de hipersensibilidad tardía
que refleja lo que sucede en la respuesta inmune celular contra microorganismos.
Mediante esta prueba se puede apreciar la reacción de hipersensibilidad tardía en
el grupo control, mientras que el grupo experimental, inmunosuprimido por el
linfoma, no se logra conseguir dicha reacción.
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Recursos
Material
 Ratones cepa Balb/c
 Torundas con alcohol
 Jeringas de 1ml (para
insulina)
 Navajas para rasurar
 Guantes de látex
 Gasas
Reactivos
Equipo
 Linfoma L-5178-Y
 Solución salina fisiológica
0.9%
 PBS (solución salina de
fosfatos)
Procedimiento
Parte A. Inoculación del tumor
1. Rasurar la región cervical derecha de 4 ratones.
2. Marcar a dos de los ratones como control y a los otros dos como
experimentales.
3. Inocular en un ratón experimental 10 millones de células tumorales en 200ul
de solución de Hanks.
4. Administrar a los ratones controles 200ul de solución de Hanks.
5. Transcurridos 8 días se realizará la prueba de hipersensibilidad retardada
con el DNFB para evaluar la respuesta inmune celular.
6. Obtener células tumorales de los ratones inoculados previamente.
7. Realizar un frotis de células tumorales y teñirlo con la técnica de Wright.
8. Observar al microscopio y describir las células encontradas.
Parte B. Prueba de hipersensibilidad tardía al DNFB
(Siguiente práctica)
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Qué estudia la inmunología del cáncer?
2. ¿Qué es la oncogénesis?
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3. Menciona los mecanismos que utilizan los tumores para evadir la respuesta
inmunológica
4. ¿Qué es lo que le permite al sistema inmune discriminar entre células
normales y células tumorales?
5. ¿Cómo se clasifican a los antígenos tumorales según la respuesta que
producen?
6. ¿Cómo se agrupan los antígenos reconocidos por linfocitos T?
7. Menciona el objetivo de inocular a los ratones con el linfoma y cómo se
demuestra el mismo.
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B) Diagrama de flujo
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Práctica 10
HIPERSENSIBILIDAD TARDÍA E INMUNODEFICIENCIA
Fundamento
La hipersensibilidad tardía también es llamada hipersensibilidad de tipo IV,
o mediada por células T, este tipo de reacción desempeña un importante papel en
la defensa del huésped contra agentes ambientales o químicos y microorganismos
intracelulares. Cuando algunas poblaciones de células T H activadas se encuentran
con ciertos tipos de antígenos, comienzan a secretar citocinas que inducen una
reacción inflamatoria localizada (reacción de hipersensibilidad tardía), este
reconocimiento y eliminación del agente infeccioso o antígeno extraño son el
resultado del sistema inmune adaptativo, por medio de sus mecanismos
humorales y celulares.
Cuando un individuo se expone a un antígeno, se dice que se sensibiliza,
las células presentadoras de antígeno ayudan a que los linfocitos TH reconozcan
al antígeno procesado y se activen, diferenciándose en linfocitos T H1; si el
individuo se vuelve a exponer al mismo antígeno, las células T H1 lo reconocen y
secretan citocinas y quimiocinas que atraen y activan a macrófagos y otras células
inflamatorias inespecíficas, lo cual establece la reacción de hipersensibilidad
tardía.
La reacción de hipersensibilidad tardía se puede inducir de forma
experimental en un laboratorio en modelos animales. El proceso incluye desde la
fase de sensibilización, donde el animal entra en contacto por primera vez al
agente sensibilizante o antígeno mediante la aplicación por contacto o cutánea; el
agente aplicado es reconocido y procesado por las células presentadoras de
antígenos, quienes lo presentan a los linfocitos T; cuando los linfocitos T
reconocen al antígeno como algo extraño se activan y desencadenan una
respuesta específica contra ese antígeno; al final de esa respuesta, algunos de los
linfocitos se diferenciarán en células de memoria. Si posteriormente el animal es
expuesto a ese mismo agente, se desencadenará la reacción de hipersensibilidad
tardía en las próximas 24 a 48 hrs, caracterizándose por enrojecimiento e
induración del tejido expuesto.
Objetivo general
 Identificar y comprender las reacciones de hipersensibilidad tardía o de tipo IV.
Objetivos particulares
 Identificar las diferentes fases de una reacción de hipersensibilidad tardía
mediante la prueba del DNFB.
 Comprender la relación entre la inmunosupresión y la eliminación de la
respuesta de hipersensibilidad tardía.
 Evaluar el estado de la respuesta inmune celular en el modelo animal.
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Principio básico del método
La inmunosupresión en el modelo de ratones con linfoma murino L-5178-Y
se hace patente mediante la prueba del DNFB, que causará una reacción de
hipersensibilidad retardada en los ratones control, mientras que en los ratones
experimentales esta reacción se verá suprimida.
Se sensibiliza a los ratones con el DNFB, el cual funciona como un hapteno
en unión a proteínas de la dermis, este complejo es reconocido por las células de
Langerhans, las cuales lo procesan y presentan a los linfocitos T en los ganglios
más cercanos, esto activa a los linfocitos TH1, ahora capaces de reconocer al
complejo en la dermis. Cuando se aplica una dosis de DNFB, se forma el complejo
en la dermis y al ser reconocido por los linfocitos TH1, se producen IFN-g e IL-17,
los cuales a su vez estimulan la producción de IL-1, IL-6, GM-CSF, TNF-a y
diferentes quimiocinas por parte de los queratinocitos y células inflamatorias; las
citocinas y quimiocinas promueven la respuesta inflamatoria, la llegada de
monocitos que se convierten en macrófagos y la llegada de más linfocitos, lo que
instaura la reacción de hipersensibilidad retardada.
Recursos
Material
 Ratones cepa Balb/c (se
usarán
los
ratones
experimentales
y
controles de la práctica
anterior)
 Hoja de rasurar
 Aplicador de plástico
 Jeringas de insulina
 Guantes de látex
 Gasas
Reactivos
 Dinitrofluorobenceno
(DNFB)
 Acetona
 Aceite de oliva
Equipo
 Micrómetro de
precisión
Procedimiento
Prueba de hipersensibilidad tardía al DNF.
1. Se rasurarán los ratones de la región abdominal.
2. Se tomará un ratón control y otro experimental de los dos ratones
previamente inoculados con el linfoma, y de la misma manera se tomará un
ratón control y uno experimental de los ratones sanos.
3. Los dos ratones experimentales se sensibilizarán con una dosis de 20ul de
DNFB al 0.5% en una mezcla de acetona y aceite de oliva en proporción
4:1 (v/v) en la región del abdomen previamente rasurada.
4. Los dos ratones controles se sensibilizarán con 20ul de solución salina
fisiológica al 0.9% en la región del abdomen previamente rasurada.
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5. 24 horas después se aplicará un segundo reto de 20ul de DNFB a los
ratones experimentales y 20ul de solución salina al 0.9% a los ratones
control.
6. A los 5 días se aplicará un tercer reto con 20ul de DNFB a los ratones
experimentales y 20ul de solución salina al 0.9% a los ratones control.
Además de la aplicación en la región abdominal se aplicará en el pabellón
auricular derecho 10ul de DNFB a todos los ratones (experimentales y
control). Antes de la aplicación en el pabellón auricular, medir el grosor del
mismo con el micrómetro.
7. Esperar 48 horas y medir nuevamente con el micrómetro el pabellón
auricular derecho de cada ratón verificar la reacción de hipersensibilidad.
Calcular la diferencia existente entre ambas mediciones y anotar la
conclusión.
Actividades
A) Cuestionario
1. Explica el proceso de una reacción de hipersensibilidad tardía.
2. ¿Cuáles son las células mediadoras de las reacciones de sensibilidad
tardía y qué otras células participan?
3. ¿De qué manera se puede inducir de forma experimental una reacción de
hipersensibilidad tardía?
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4. ¿Cuál es la aplicación clínica de las reacciones de hipersensibilidad tardía?
5. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de reacción de hipersensibilidad
tardía al DNFB?
6. ¿Qué cuidados se deben tener al manejar el DNFB y cuáles son los
riesgos?
7. Menciona la clasificación de Coombs y Gell para las reacciones de
hipersensibilidad y da un ejemplo de cada una.
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B) Diagrama de flujo
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Resultados
Observaciones
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Práctica 11
INMUNOLOGÍA DE LOS TRASPLANTES
Fundamento
En inmunología, el término trasplante se refiere a la acción de transferir
células, tejidos u órganos de un individuo a otro, esto se realiza con la justificación
de la posibilidad de curar muchas enfermedades al reemplazar un tejido dañado
por uno sano; el objetivo es mantener la integridad funcional del tejido trasplantado
en el receptor y así suplir la falla orgánica preexistente, en ocasiones es crucial
realizar un trasplante para evitar la muerte. El mayor problema que se presenta en
esta situación es la disponibilidad de los tejidos y el rechazo que se puede
presentar por parte del receptor.
Al hacer un trasplante, el sistema inmune tiene una participación muy
importante, pues de esto depende la supervivencia o el rechazo de los mismos,
para ayudar a la supervivencia de los injertos, se utilizan diferentes agentes
inmunosupresores como fármacos y anticuerpos específicos desarrollados para
disminuir el ataque del sistema inmune hacia el injerto, la desventaja que tiene
esto es que los agentes inmunosupresores actúan a nivel global y ponen al
individuo en riesgo, haciéndolo susceptible a infecciones y otras enfermedades.
Debido a que la inmunorreacción a los antígenos tisulares del CMH es la principal
razón para el rechazo, la compatibilidad entre el receptor y el donante se evalúa
mediante la tipificación de los antígenos tisulares de CMH cases I y II.
El grado de inmunorreacción que causa el injerto en el receptor depende de
la naturaleza del mismo, se pueden clasificar los injertos en 4 tipos:
 Autoinjerto.- es el tejido del mismo individuo transferido de una a otra parte
del cuerpo.
 Isoinjerto.- es el tejido que se transfiere entre individuos genéticamente
idénticos.
 Aloinjerto.- es el tejido que se transfiere entre individuos de la misma
especie pero genéticamente diferentes.
 Xenoinjerto.- es el tejido transferido entre individuos de diferentes especies.
Los autoinjertos y los isoinjertos generalmente son bien aceptados en el
individuo; el aloinjerto tiene cierto grado de rechazo debido a que el sistema
inmune lo reconoce como algo extraño; el xenoinjerto es el que presenta rechazo
con mayor intensidad debido a la gran diferencia genética entre los individuos.
El rechazo de un injerto es la inmunorreacción que presenta reconocimiento
de lo propio y o extraño, especificidad y memoria; estas reacciones de rechazo se
clasifican en tres:
 Rechazo hiperagudo.- esta mediado por anticuerpos preexistentes en el
receptor contra los antígenos del injerto.
 Rechazo agudo.- esta mediado por linfocitos TH y células citotóxicas.
 Rechazo crónico.- está mediado por componentes humorales y celulares.
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Cuando se presenta un rechazo, se pueden describir dos etapas, la primera
es la etapa de sensibilización, en la que se estimulan y activan los linfocitos T; la
segunda es la etapa efectora, durante la cual se produce el ataque al injerto.
Trasplante de piel
La piel es el órgano más grande, está encargada de proporcionar una
barrera protectora contra el medio ambiente al organismo, por esto es esencial en
la homeostasis, control de la temperatura, intercambio de fluidos con el exterior y
por supuesto, es el principal mecanismo de defensa contra microorganismos
invasores. Su alta especialización hace que el trasplante de piel sea una prueba
de histocompatibilidad muy rigurosa, ya que prácticamente todos los antígenos se
encuentran ahí. Los injertos de piel son de primera intención, esto es que su
vasculatura se establece por anastomosis directa termino-terminal entre los vasos
del injerto y los vasos del receptor.
La evolución en los injertos de piel es rápida, en los primeros días no se
observan grandes diferencias en los tejidos, dentro de las primeras 24 horas todos
los injertos se encuentran pálidos y es hasta el segundo día que aparecen
manchas de color rosado, en el tercer y cuarto día todo el injerto se ve de un color
rosa uniforme, para el quinto día comienza a desaparecer el edema y eritema y
hay regeneración epidérmica y fusión gradual del injerto con la piel del huésped,
para el vigésimo día ya se observa un patrón de vasculatura similar al de la piel
circundante.
En caso de que se presente un rechazo al injerto, dentro de la primer
semana se observa un halo de edema y eritema que incrementa durante los
siguientes días, para el octavo y noveno día el color del injerto cambia a rojo
cereza, progresando a cianosis franca, después de esto se presenta punteado
trombótico, escarificación y hemorragia en los siguientes días, al final del proceso
de rechazo, se pierde por completo el flujo sanguíneo y el injerto se convierte en
una escara negra que se esfacela.
Los criterios de diagnóstico para el rechazo de autoinjerto de piel son los
siguientes:
 Intensidad del eritema y edema circundantes.
 Color y consistencia del injerto.
 Valoración microscópica de la vasculatura superficial.
 Presencia o ausencia de trombosis o hemorragia.
Basándose en estas observaciones, se determina un criterio específico para
diagnosticar el rechazo basándose en lo siguiente:
 Desarrollo de edema y eritema intensos alrededor del injerto.
 Color rojo oscuro o cianosis del injerto.
 Edema y opacificación de la superficie del injerto.
 Interrupción del flujo sanguíneo en todos los vasos del injerto.
 Presencia de trombosis intravascular y hemorragia.
 Escarificación y esfacelación del injerto.
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Objetivo general
 Comprender la participación del sistema inmune en los trasplantes.
Objetivos particulares
 Identificar los efectos de un trasplante de piel en un modelo murino.
 Evaluar la evolución en un trasplante de piel.
Recursos
Material
Reactivos
Equipo
 Ratones de la cepa  Anestesia pentobarbital
Balb/C, DBA.
sódico o Zoletil®
 Cajas de Petri
 Solución fisiológica
 Pipetas pasteur
 Bulbos de succión
 Estuche de disección
 Navajas de rasurar
 Sutura de seda 3-0
 Gasas
 Guantes
 Cubre bocas
Procedimiento
1. Se anestesia a los ratones con 2ml de pentobarbital sódico vía
intraperitoneal.
2. Rasurar el dorso de los ratones y delinear la piel a trasplantar, cuidando
que sean las mismas dimensiones en el donador y en el receptor.
3. Cortar con bisturí la zona delineada y disecar el tejido con mucho cuidado
con tijeras curvas.
4. La piel separada del dorso de los ratones se colocará en las cajas de Petri
con solución salina fisiológica al 0.9% a temperatura ambiente, cuidando
que los injertos no se sequen. Cuidar también que no se seque en ningún
momento la zona descubierta de los ratones.
5. Implantar el tejido en la zona destinada como receptora, es importante que
los bordes queden bien alineados para garantizar el contacto y la irrigación
del injerto. El injerto se fija con puntos simples, utilizando la sutura de seda
3-0.
6. Dejar a los ratones en su jaula y ponerle al agua un antihistamínico.
7. Evaluar la evolución del trasplante y registrar los cambios en los injertos
durante los próximos 15 días.
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Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Qué es el trasplante y con qué objetivo se realiza?
2. ¿Cómo participa el sistema inmune en la evolución de los trasplantes?
3. Menciona la importancia del CMH en la inmunología de los trasplantes
4. Menciona los tipos de injertos y sus características
5. Describe los tipos de rechazo que se pueden presentar
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6. Describe brevemente el proceso del rechazo, sus etapas y las células del
sistema inmune que participan
7. ¿Qué cambios se observan en la primera semana después de un trasplante
de piel?
8. ¿Cuáles son los criterios finales para diagnosticar rechazo en un trasplante
de piel?
9. ¿Cómo se puede evitar el rechazo de los trasplantes y qué riesgos
conlleva?
10. En caso de presentarse el rechazo, ¿cuáles son las medidas a llevar a
cabo?
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B) Diagrama de flujo
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Resultados
Observaciones
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Conclusiones
Bibliografía
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Autor
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Bibliografía
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