UN CANDIDATO A VACUNA CONTRA LA SÍFILIS DEFINIDO INHIBE LA DISEMINACIÓN DE TREPONEMA PALLIDUM SUBESPECIE PALLIDUM (1)

UN CANDIDATO A VACUNA CONTRA LA SÍFILIS DEFINIDO
INHIBE LA DISEMINACIÓN DE TREPONEMA PALLIDUM
SUBESPECIE PALLIDUM
La sífilis es una enfermedad importante en los países de ingresos bajos y medios, y una amenaza de salud
pública reemergente en los países de ingresos altos. La eliminación de la sífilis requerirá el desarrollo de
una vacuna eficaz que hasta ahora ha sido difícil de alcanzar. Aquí evaluamos el potencial vacunal de
Tp0751, una adhesina vascular del agente causante de la sífilis, Treponema pallidum subsp. pallidum. Los
animales inmunizados con Tp0751 exhiben una carga de órganos bacterianos significativamente reducida
tras la exposición a T. pallidum en comparación con los animales no inmunizados. Introducción de ganglios
linfáticos de T. pallidum inmunizado con Tp0751-Animales desafiados a animales ingenuos no inducen
infección, lo que confirma la protección estéril. Estos hallazgos proporcionan evidencia de que Tp0751 es
un candidato prometedor para la vacuna contra la sífilis.
Sífilis, causada por una infección por la
espiroqueta Treponema pallidum subsp.
pallidum (en lo sucesivo, T. pallidum), sigue
siendo una enfermedad prevalente,
especialmente en los países de ingresos bajos
y medianos, con una carga mundial estimada
de 36 millones de casos y 11 millones de
casos nuevos por año. Las tasas de sífilis
infecciosa entre hombres que tienen sexo
con hombres (HSH) están exhibiendo un
aumento alarmante, con una tasa de 228,8
casos por 100.000 HSH (0,228%) informada
en los Estados Unidos en 2013 en
comparación con una tasa de 15,8 por
100.000 HSH. población (0,016%) informada
en 2000. Se están observando aumentos
similares en China, Inglaterra, Canadá y
Australia. La transmisión de la sífilis de madre
a hijo también está en aumento, con un
estimado de 1,36 millones de mujeres
embarazadas infectadas cada año en todo el
mundo y más de 500.000 de estos embarazos
conducen a resultados adversos que incluyen
aborto espontáneo, muerte fetal, parto
prematuro,
muerte
neonatal
y
manifestaciones
de
enfermedades
congénitas. sífilis. Las infecciones por sífilis
sintomáticas aumentan la transmisión y
adquisición del virus de inmunodeficiencia
humana (VIH) de dos a cinco veces, y los
estudios de modelos predicen que la
erradicación de la sífilis tendría un impacto
significativo en la prevención del VIH. La
creciente prevalencia de sífilis infecciosa y
congénita, a pesar de la continua sensibilidad
de T. pallidum al tratamiento con penicilina,
subraya la necesidad de desarrollar una
vacuna contra la sífilis como complemento a
los enfoques tradicionales de detección y
tratamiento para la eliminación global de la
sífilis. Además, aunque T. pallidum aún no ha
mostrado resistencia a la penicilina, ha
surgido resistencia a la terapia de segunda
línea, como los antibióticos a base de
macrólidos. Como resultado, y debido a las
devastadoras consecuencias de la sífilis
congénita, las mujeres embarazadas alérgicas
a la penicilina requieren desensibilización y
tratamiento con penicilina, lo que enfatiza
aún más la necesidad de una medida de
control alternativa.
El desarrollo eficaz de una vacuna contra la
sífilis debe centrarse en la naturaleza
altamente invasiva de T. pallidum que se
disemina a través del torrente sanguíneo y los
vasos linfáticos e invade una amplia variedad
de tejidos y órganos. Treponema pallidum
subsp. pallidum cruza las barreras
endoteliales, placentaria y hematoencefálica
en las primeras etapas de la infección, como
lo demuestran las manifestaciones clínicas
generalizadas asociadas con las infecciones
por sífilis, la aparición de sífilis congénita y la
invasión del sistema nervioso central
observada en aproximadamente el ~40% de
los pacientes con sífilis temprana. Sin
embargo, existe un conocimiento limitado de
los mecanismos responsables de la capacidad
de diseminación generalizada de T. pallidum.
Una proteína de T. pallidum que se ha
implicado en la diseminación treponémica es
la adhesina Tp0751. Los ensayos de
opsonofagocitosis proporcionan evidencia de
la presencia de esta lipoproteína en la
superficie de T. pallidum, lo que facilitaría la
interacción directa con el entorno del
huésped. Se ha demostrado que Tp0751 se
une a múltiples componentes de la matriz
extracelular,
incluyendo
laminina,
fibronectina y fibrinógeno. Todos estos
componentes del hospedador están muy
próximos al endotelio vascular y, por lo tanto,
se sugiere que la interacción de Tp0751 con
estas moléculas posicione idealmente T.
pallidum para facilitar la diseminación a
través del torrente sanguíneo.
Los intentos anteriores de desarrollo de
vacunas para la sífilis han logrado diversos
grados de éxito. La inmunización de conejos,
el modelo animal óptimo que recapitula las
múltiples etapas y la cronicidad de la sífilis
humana, con una selección de proteínas
recombinantes individuales ha provocado en
el mejor de los casos una protección parcial.
Se han logrado resultados de protección más
prometedores utilizando células enteras
atenuadas Preparaciones de T. pallidum.
Como informó Miller en 1973, la
inmunización con T. pallidum irradiado con γ
proporcionó una protección completa tras la
exposición homóloga en el modelo de conejo,
como lo demuestra la ausencia de lesiones
primarias en los sitios de exposición y la
imposibilidad de inducir la infección tras la
transferencia de los ganglios linfáticos de
estos conejos a conejos ingenuos. En el Miller
33 estudio, los conejos se les dio 60
inyecciones intravenosas que contienen un
total de 3,7 × 109 γ-irradiado T. pallidum
durante un período de 37 semanas. Aunque
este régimen de inmunización no es práctico
para su uso en humanos, este estudio avanzó
significativamente en el campo del desarrollo
de vacunas contra la sífilis, ya que ilustró que
la protección estéril se puede lograr con éxito
con la selección de antígenos adecuada y, al
mismo tiempo, destacó la importancia de los
antígenos de superficie de T. pallidum en
conferir protección.
Aquí investigamos la capacidad de la
inmunización Tp0751 para inhibir la
diseminación de T. pallidum a sitios de
órganos distantes en conejos. Mostramos
que los animales inmunizados con Tp0751
muestran una carga treponémica reducida en
múltiples órganos distantes al sitio de
exposición en comparación con los animales
de control no inmunizados. Además,
demostramos que los ganglios linfáticos
recuperados de animales inmunizados con
Tp0751 no inducen una infección productiva
cuando se inyectan en animales receptores
sin tratamiento previo, lo que demuestra
además que la inmunización con Tp0751
inhibe la diseminación treponémica a sitios
de órganos distantes. Nuestros resultados
apoyan a Tp0751 como una vacuna candidata
prometedora para prevenir la propagación
hematógena de T. pallidum dentro del
huésped.
Resultados
La inmunización con Tp0751 atenúa el
desarrollo de lesiones. Se sedaron e
inmunizaron tres conejos tres veces con
Tp0751 emulsionado en adyuvante TiterMax
Gold a intervalos de 3 semanas, lo que
provocó la inducción de títulos altos de
anticuerpos anti-Tp0751 en cada uno de los
animales inmunizados (Figura 1 y las figuras
complementarias 1 y 2). Las investigaciones
de control previas realizadas utilizando un
régimen de inmunización solo con adyuvante
no mostraron un efecto protector de la
inmunización simulada con un adyuvante de
conejo en ausencia del antígeno,
descartando así la posibilidad de que el
adyuvante
solo
confiera
inmunidad
protectora. A las 3 semanas siguientes a la
inmunización final, los animales inmunizados
y los animales de control no inmunizados se
sedaron y se desafiaron por vía intradérmica
con 1 x 106 T. pallidum subsp. pallidum, cepa
Nichols, en cada uno de los 10 sitios en sus
espaldas afeitadas (total de 1 × 107 T.
pallidum/conejo; Figura 1a). Durante los
siguientes 14 días, se controlaron los sitios de
exposición para detectar la aparición de
lesiones indoloras, o chancros, que surgen en
el sitio de inoculación y son exclusivos de la
sífilis. El chancro representa el primer signo
clínico de infección y, por lo tanto, el
seguimiento del desarrollo del chancro
proporciona una métrica de la eficacia de la
vacuna. Las lesiones se controlaron
diariamente para determinar el diámetro, la
induración, la ulceración y la presencia de T.
pallidum viable. El día 14, las lesiones estaban
presentes en todos los animales; sin
embargo, los animales inmunizados
mostraron un retraso en el desarrollo de la
lesión en comparación con los animales de
control no inmunizados. Los animales de
control presentaron un 100% de induración
de la lesión (endurecimiento de la piel debido
a la inflamación) el día 4, mientras que los
animales inmunizados solo alcanzaron el 67%
de la induración observada en los animales
de control el día 4 y no coincidieron con el
nivel de induración observado en los
animales de control hasta el día. 10 (tabla 1).
La ulceración indolora en los animales de
control fue aparente ya en el día 10 y el 100%
de las lesiones estaban ulceradas el día 14.
Los animales inmunizados mostraron signos
de ulceración indolora el día 10, pero para el
día 14 solo el 47% de las lesiones estaban
ulceradas (Figura 2a). El diámetro de la lesión
observado en los animales de control fue
consistentemente un 20% mayor que el de
los animales inmunizados durante el período
de medición de 14 días (Figura 2b y tabla 1).
En el día 10 después de la exposición (PC),
cada lesión se evaluó mediante microscopía
de campo oscuro para detectar la presencia
de T. pallidum viable. El 70% de las lesiones
de los animales de control fueron positivas
para T. pallidum en comparación con solo el
20% de las lesiones de los animales
inmunizados (Figura 2c, P=0,002, prueba t de
Student de dos colas). Además, las lesiones
positivas en campo oscuro de los controles
tenían una densidad significativamente
mayor de treponemas y al menos el 50% de
estos organismos eran móviles, mientras que
las lesiones positivas en campo oscuro de
animales inmunizados tenían solo unas pocas
treponemas presentes por campo y estos
organismos no eran móviles. El análisis de la
progresión de la lesión reveló una
disminución significativa en la ulceración de
la lesión (Figura 2a, P=0,0011) y carga
treponémica (Figura 2c, P=0,02), y una
tendencia hacia la disminución del diámetro
de la lesión (Figura 2b, P=0,11) en animales
inmunizados con Tp0751.
FIGURA 1: Resumen experimental. (a) Inmunización y desafío. Los conejos recombinantes inmunizados con Tp0751 (N = 3; cada
inmunización se administró como cuatro inyecciones subcutáneas (SC) de 0,1 ml en los hombros y dos inyecciones intramusculares (IM)
de 0,04 ml en los músculos del cuádricep) y los animales de control (N = 2) se administraron por vía intradérmica desafiado con 1 × 106
T. pallidum subsp. pallidum, cepa Nichols, en cada uno de los 10 sitios. El día 14 después de la exposición (PC), los animales se
sacrificaron y los órganos se recolectaron para la evaluación de qPCR de la carga bacteriana; Se extrajeron y procesaron los ganglios
linfáticos poplíteos para la transferencia de los ganglios linfáticos. (b) Transferencia de ganglios linfáticos. Los nódulos linfáticos poplíteos
se recogieron de animales de control e inmunizados con Tp0751 recombinante y se inyectaron en los testículos de animales sin
tratamiento previo.
La inmunización con Tp0751 inhibe la
diseminación de T. pallidum. Para evaluar si
la inmunización con Tp0751 confiere
protección
contra
la
diseminación
treponémica, los animales de control e
inmunizados se sacrificaron durante 14 días
PC. A continuación, realizamos PCR
cuantitativa en tiempo real (qPCR) para
evaluar la carga de T. pallidum en muestras
de biopsia de lesiones que surgen en los sitios
de desafío y sitios de órganos distantes a la
ubicación de desafío. El análisis de la carga
treponémica local promedio reveló una ligera
tendencia hacia un aumento de las
concentraciones de ADN de T. pallidum
(copias flaA por μg de ADN del tejido del
hospedador) en los sitios de lesión primaria
de los tres animales inmunizados en
comparación con los dos animales de control
no inmunizados (Figura 3a). Sin embargo,
debe tenerse en cuenta que la carga
promedio más alta resultó de la detección de
una carga treponémica más alta en el conejo
1 inmunizado (Im1), mientras que los conejos
Im2 e Im3 exhibieron cargas treponémicas
más bajas que los animales de control (Figura
3a y tabla 1). Algo contradictorio con esta
observación, la evaluación microscópica de
las lesiones primarias reveló que todos los
animales inmunizados tenían cargas
treponémicas más bajas en comparación con
el grupo de control (Figura 2c). Mientras que
el análisis de campo oscuro de los aspirados
de lesiones de animales infectados permite
diferenciar entre organismos vivos y muertos
en función de la motilidad, la qPCR detecta el
ADN de organismos vivos y muertos que,
como era de esperar, daría como resultado
un valor más alto. Una evaluación detallada
de la viabilidad de las treponemas en PC de
animales
inmunizados
con
Tp0751,
probablemente
usando
análisis
de
transcriptasa inversa-qPCR para detectar
ARN en organismos viables, debe esperar
más estudios.
La carga treponémica también se evaluó en
los órganos distantes del hueso, el hígado y el
bazo para proporcionar una indicación de la
capacidad de T. pallidum para diseminarse
desde el sitio de la infección inicial. Estos
sitios fueron elegidos debido a la propensión
de T. pallidum a diseminarse y ser detectado
en estos órganos. La carga treponémica en
los extractos de hueso, hígado y bazo reveló
una
tendencia
generalizada
hacia
concentraciones más bajas de ADN en todos
los animales inmunizados (Fig. 3b–d). La
disminución más destacada se observó para
las concentraciones de ADN de T. pallidum en
el bazo de los animales inmunizados en
comparación con los controles no
inmunizados (Figura 3d). Es importante
destacar que el análisis de la carga
treponémica total en todos los sitios de
infección distantes reveló una disminución
significativa en la carga dentro de los
animales inmunizados en relación con los
controles no inmunizados (Figura 3e,
P<0,005, prueba de Mann-Whitney), lo que
indica que la inmunización con Tp0751 inhibe
la diseminación de T. pallidum a estos
órganos distantes.
Para determinar más a fondo si la
inmunización con Tp0751 protege contra la
diseminación de T. pallidum, se transfirieron
los ganglios linfáticos poplíteos de dos
animales control y tres inmunizados a cinco
animales receptores no expuestos y sin
experiencia (Figura 1b). El estado de infección
de los animales receptores se evaluó
mediante serología (a través del laboratorio
de investigación de enfermedades venéreas
(VDRL) y pruebas de absorción de
anticuerpos treponémicos fluorescentes
(FTA-ABS)), análisis microscópico de campo
oscuro de aspirados testiculares y desarrollo
de orquitis testicular (Figura 1 by Cuadro
complementario 2). De acuerdo con la
tendencia observada en los resultados de
qPCR, la transferencia de los ganglios
linfáticos poplíteos de los animales de control
no inmunizados a los animales receptores sin
tratamiento previo dio como resultado
evidencia de seroconversión el día 17
posterior a la transferencia, fuerte
seroconversión el día 31 posterior a la
transferencia y desarrollo de orquitis
asintomática durante el día 42 después de la
transferencia
(Tabla
2
y
Cuadro
complementario 2). El análisis de campo
oscuro de los testículos de los animales
receptores de control en el momento de la
eutanasia confirmó la presencia de T.
pallidum móvil. Por el contrario, ninguno de
los tres animales sin tratamiento previo que
recibieron ganglios linfáticos de los animales
inmunizados con Tp0751 desarrolló orquitis;
dos de los animales que recibieron ganglios
linfáticos
de
animales
inmunizados
(designados R-Im1 y R-Im2) no se
seroconvirtieron durante la duración del
experimento, y al menos dos de los animales
receptores (R-Im1 y R-Im2) no tenían
treponemas presentes a través del análisis de
campo oscuro (Tabla 2; análisis de campo
oscuro no realizado para R-Im3).
Curiosamente, el Im3 de conejo tuvo la carga
trepomemal más baja detectada en las
biopsias de la lesión, con un promedio de
1,66 × 106 copias flaA por μg de ADN de
conejo detectado en comparación con 2,04 ×
107 y 3,15 × 106 copias flaA por μg de ADN de
conejo para conejos Im1 e Im2,
respectivamente (Figura 3a y tabla 1). Esto
puede sugerir una disminución de la
proliferación de T. pallidum en los sitios de
lesión o puede indicar un mayor número de
T. pallidum diseminado desde el sitio de
exposición en este conejo. De acuerdo con
esta observación, la transferencia de ganglios
linfáticos de Im3 de conejo a R-Im3 de conejo
sin tratamiento previo llevó a la
seroconversión en este animal en el día 73, lo
que sugiere que algunas treponemas pueden
haber estado presentes en los ganglios
linfáticos transferidos, lo que da como
resultado una infección de bajo nivel que
condujo a una seroconversión tardía tabla 1y
Cuadro complementario 2). Sin embargo, las
cargas treponémicas detectadas en el bazo y
el hígado de conejo Im3 fueron las más bajas
de los tres animales inmunizados (Figura 3c,
d, tabla 1), lo que sugiere que la
seroconversión observada en el R-Im3 de
conejo no se produjo como resultado de una
mayor diseminación treponémica a sitios de
órganos distantes en Im3 de conejo. La
evidencia que respalda esto proviene de la
débil reactividad del VDRL que no aumentó
significativamente con el tiempo, y el
aumento lento y mínimo del FTA-ABS
observado para el conejo R-Im3 (tabla 1 y
Cuadro complementario 2).
en el sitio de la lesión local, así como en los
sitios de infección diseminada. Estos
incluyeron el hígado y los huesos, donde no
se detectó ADN treponémico mediante el
análisis de qPCR (Figura 3b, c y tabla 1), así
como el bazo, donde se detectó un nivel bajo
de ADN treponémico (Figura 3d y tabla 1).
Discusión
FIGURA 2: La inmunización con Tp0751 disminuye la
gravedad y la carga bacteriana en las lesiones
primarias. (a) La ulceración de la lesión y (b) el diámetro
de la lesión se controló durante 14 días en animales de
control (N = 2) e inmunizados (N = 3) después de la
exposición a T. pallidum. (c) La carga bacteriana en las
lesiones se evaluó el día 10 PC examinando la presencia
de T. pallidum utilizando microscopía de campo oscuro.
Los resultados se presentan como mediana intervalo de
confianza del ±95% entre animales inmunizados
individuales (N = 3) o control (N = 2). La significancia se
evaluó mediante regresión no lineal y suma adicional de
cuadrados F-test (**P<0,005 (a,b)) o una prueba t de dos
colas (*P<0.05 (c)).
La inmunización con Tp0751 promueve la
infiltración celular. Las muestras de biopsia
obtenidas de los sitios de lesiones primarias
de los animales inmunizados y de control se
analizaron para detectar la presencia de
cuatro subconjuntos de células inmunes. Los
animales inmunizados tenían niveles más
altos de infiltrados celulares en todos los
tipos de células analizados, incluidos
neutrófilos, células dendríticas, linfocitos y
células B diferenciadas (Figura 4). El análisis
de la composición del infiltrado celular total
en los sitios de lesiones primarias reveló un
aumento significativo en la cantidad de
infiltración celular en las lesiones de animales
inmunizados con Tp0751 frente a controles
no inmunizados (Figura 4e, P=0,045, prueba
de Mann-Whitney). En particular, el conejo
inmunizado Im3 tuvo los recuentos de células
más altos para cada tipo de célula inmunitaria
analizada, lo que sugiere que este animal
tenía la infiltración de células inmunitarias
más pronunciada en el día 14 PC (Figura 4,
tabla 1). De acuerdo con esta observación, el
Im3 de conejo también tenía la carga
treponémica más baja de todos los animales
Los resultados presentados en este estudio
demuestran que los animales inmunizados
con Tp0751 presentan un desarrollo de
lesiones atenuado, inhibición de la
diseminación de T. pallidum y aumento de la
infiltración celular en los sitios de la lesión
(Figura 5a). La carga treponémica en los sitios
de lesiones primarias se analizó tanto
visualmente mediante microscopía de campo
oscuro como cuantitativamente mediante
qPCR. En comparación con los dos controles
no inmunizados, los tres animales
inmunizados mostraron un desarrollo de
lesiones atenuado y, por análisis de campo
oscuro, cargas significativamente menores
de T. pallidum en los sitios de lesiones
primarias. Sin embargo, los resultados de
qPCR demostraron que Im1 de conejo
inmunizado tenía la carga treponémica más
alta en los sitios de lesión entre todos los
animales inmunizados y de control, mientras
que solo el 20% de las lesiones de Im1 de
conejo analizadas por microscopía de campo
oscuro fueron positivas para treponemas
móviles en comparación con 77,8% y 60%
para los conejos de control Ct1 y Ct2,
respectivamente. Esta observación de una
mayor carga treponémica en Im1 podría
sugerir que este animal experimentó un
aumento de T. pallidum retención en el sitio
de exposición y, por extensión, redujo la
diseminación de T. pallidum desde el sitio de
la lesión primaria. Sin embargo, estos
resultados deben interpretarse con cautela
ya que es difícil llegar a una conclusión
definitiva sobre la verdadera carga de
lesiones en Im1 debido a la variabilidad entre
conejos observada que se ve aún más
confusa por el hecho de que qPCR es capaz de
detectar ADN de ambos animales vivos. y
organismos muertos.
FIGURA 3: La inmunización con Tp0751 inhibe la diseminación de T. pallidum. La carga de T. pallidum se evaluó
en animales control (Ct, N = 2) e inmunizados (Im, N = 3) mediante PCR cuantitativa en tiempo real para medir las
concentraciones de ADN flaA en biopsias de lesiones ((a); sitio de infección local) y en sitios de infección diseminada,
(b) hueso, (c) hígado y (d) bazo. Los resultados se normalizaron a la concentración de ADNg de conejo y se presentaron
como mediana ± rango intercuartílico (IQR); los puntos corresponden a muestras extraídas por separado de cada animal.
(e) Se evaluó la carga diseminada total entre los animales de control (n = 6 muestras, 3 muestras por animal) y los
animales inmunizados (n= 9 muestras) en todos los sitios diseminados (hueso, azul; hígado, naranja; bazo, morado)
usando la prueba de Mann-Whitney (**P<0,005).
Para confirmar que se ha logrado la
inmunidad esterilizante, los animales que
reciben ganglios linfáticos de animales
inmunizados expuestos no deben mostrar
ningún signo físico o serológico de infección.
Los animales receptores de los ganglios
linfáticos de Im1 e Im2 (R-Im1 y R-Im2) no se
seroconvirtieron ni desarrollaron orquitis
asintomática después de la transferencia
durante un período de observación de 185
días, y el análisis de campo oscuro de los
extractos de testículos no detectó ninguna
presencia de T. pallidum (Figura 5b). El Im3 de
conejo inmunizado albergaba la carga
treponémica más baja tanto en los sitios de
desafío como en los sitios distales de los
órganos y mostraba los niveles más altos de
infiltración de células inmunitarias en el día
14 PC. Este alto grado de aclaramiento está
en desacuerdo con la observación de que el
R-Im3 de conejo, que recibió ganglios
linfáticos poplíteos de Im3 de conejo, se
seroconvirtió durante el transcurso del
experimento, aunque en un momento tardío.
Esta seroconversión, que mostró una
reactividad VDRL débil y no aumentó
sustancial o rápidamente para el ensayo FTAABS, puede indicar la transferencia de
treponemas muertos residuales que drenan a
los ganglios linfáticos poplíteos en Im3 de
conejo y, por lo tanto, puede no ser indicativo
de un activo infección en este animal
receptor. Además, los altos niveles de
infiltrado celular observados en Im3 de
conejo en el día 14 PC podrían sugerir que
este punto de tiempo representa la respuesta
inmune máxima dentro de las lesiones de
este animal en particular. Durante la
progresión natural de una lesión primaria de
conejo, el aclaramiento treponémico máximo
coincide con el aumento de la prevalencia de
macrófagos seguido de la detección de
organismos dentro de estas células
inmunes.35 . Esto podría respaldar aún más
la idea de que los treponemas se estaban
eliminando y drenando hacia los ganglios
linfáticos poplíteos en este momento. Sin
embargo, en ausencia de un curso temporal
de infiltración celular más completo,
actualmente es imposible determinar si este
es el caso.
El aclaramiento eficaz de T. pallidum de los
sitios de lesiones primarias depende del
desarrollo de una respuesta de citocina Thelper
tipo
1
(Th1)
producida
predominantemente por células T CD4+, la
activación
posterior
de
macrófagos
residentes y la presencia de suero específico
contra T. pallidum para promover la
opsonofagocitosis de treponemas por los
macrófagos. El análisis histológico de los
sitios de lesión primaria en los animales de
control e inmunizados reveló un aumento
significativo en la infiltración celular en los
animales inmunizados con Tp0751 en el día
14 PC. El aumento de la infiltración de células
B diferenciadas en lesiones primarias de
animales inmunizados sugiere la producción
local de anticuerpos específicos de Tp0751
secretados por estas células inmunes. Estos
anticuerpos podrían ser inhibidores u
opsónicos, facilitando así (1) la retención de
T. pallidum en los sitios de la lesión primaria
al inhibir la diseminación treponémica
mediante el bloqueo de las interacciones
patógenas mediadas por Tp0751 con la
matriz extracelular y el endotelio o (2) la
eliminación treponémica a través de la
opsonofagocitosis, respectivamente. Es
probable que estos dos mecanismos
propuestos contribuyan a la protección
observada contra T. pallidum difusión (Figura
5b), ya que se ha demostrado previamente
que el suero específico de Tp0751 promueve
la captación de T. pallidum por los
macrófagos peritoneales de conejo e inhibe
la adhesión de T. pallidum a la laminina. Las
lesiones primarias de animales inmunizados
también contenían niveles más altos de
células dendríticas y linfocitos. Nuestros
análisis no evaluaron la secreción de citocinas
ni evaluaron el estado de activación o la
actividad fagocítica de las células. Sin
embargo, la abundancia relativa de estos
tipos de células, junto con la protección
parcial contra la diseminación observada en
el estudio, sugiere que se montó una reacción
inmune eficiente contra T. pallidum en el sitio
de infección local. Tal reacción inmune
requeriría la participación de los linfocitos
para la producción de citocinas Th1 y la
actividad fagocítica de los macrófagos
residentes. También se observó un mayor
número de neutrófilos en las lesiones
primarias de los animales inmunizados con
Tp0751. Curiosamente, los neutrófilos se
asocian típicamente con un aumento de la
ulceración de las lesiones primarias, pero
todos los animales inmunizados mostraron
niveles consistentemente más bajos de
ulceración durante todo el experimento en
comparación con los controles no
inmunizados.
Los
neutrófilos
son
respondedores tempranos prominentes
durante las infecciones bacterianas, pero no
se sabe que medien la eliminación eficaz de
T. pallidum. Por tanto, el aumento de la
prevalencia de neutrófilos en las lesiones de
animales inmunizados podría significar una
localización eficaz de las células inmunitarias
en el sitio de la infección que también
contribuiría a la eliminación bacteriana.
Además, las diferencias en la infiltración
celular entre los animales inmunizados
individuales pueden atribuirse parcialmente
a la naturaleza exógena de este modelo
animal. También es importante considerar
que los análisis histológicos en este estudio
se realizaron en un solo punto de tiempo y
por lo tanto no representan necesariamente
la naturaleza dinámica de la infiltración
celular que ocurre en una lesión primaria.
Este
estudio
muestra
hallazgos
prometedores con respecto a la efectividad
de Tp0751 como candidata a vacuna contra la
sífilis. Cabe señalar que en este estudio el
poder estadístico es limitado debido al
pequeño tamaño de la muestra (N = 2,
control; N = 3, inmunizado), así como la
naturaleza exógena del modelo animal de
conejo. Sin embargo, los hallazgos de este
estudio se pueden utilizar para informar los
parámetros de investigaciones futuras que
incluirán análisis de poder para determinar el
tamaño de muestra adecuado. Aunque la
inmunización con Tp0751 no dio como
resultado una protección estéril dentro de los
sitios de infección diseminada de los
animales inmunizados, la protección estéril
lograda en animales que recibieron ganglios
linfáticos de animales inmunizados con
Tp0751 es una indicación positiva de que
optimizar la administración de la vacuna para
lograr las dosis adecuadas de antígeno y
adyuvante , podría resultar en inmunidad
estéril en animales inmunizados. Además, en
estos estudios futuros abordaremos si la
vacunación con Tp0751 da como resultado
una protección cruzada contra T. pallidum
heterólogo .son. En particular, las secuencias
de aminoácidos de Tp0751 son idénticas en
todas las cepas de T. pallidum secuenciadas ,
lo que sugiere que esta proteína provocará
una amplia capacidad protectora.
FIGURA 4: Los animales inmunizados con Tp0751 tienen una mayor infiltración celular en las lesiones. Se
evaluaron microscópicamente biopsias de lesiones de animales control (Ct, N = 2) e inmunizados (Im, N = 3) el día 14
PC para cuantificar (a) neutrófilos, (b) células dendríticas, (c) linfocitos y (d) diferenciados Células B de cinco campos de
visión (FOV, × 400) utilizando dos secciones verticales por biopsia. Se muestra la mediana ± rango intercuartílico (IQR);
los puntos individuales representan un campo de visión. (e) Se evaluó la composición del infiltrado celular total en las
lesiones (media ± se) entre los animales de control (n = 6 muestras, 3 muestras por animal) y los animales inmunizados
(n= 9 muestras) en todos los tipos de células (verde, linfocitos; púrpura, neutrófilos; rojo, células B diferenciadas; azul,
células dendríticas) utilizando una prueba t de dos colas (*P<0,05).
Los estudios futuros también incluirán probar
la eficacia de una vacuna multicomponente
que consiste en Tp0751 y TprK, otro
candidato de vacuna contra la sífilis
prometedor que juega un papel central en
facilitar la evasión inmune de T. pallidum a
través de la variación antigénica. Estudios
previos han demostrado que los animales
inmunizados con la porción N-terminal de
TprK presentan un desarrollo de lesiones
atenuado y cargas treponémicas más
pequeñas en las lesiones primarias en
comparación con los controles no
inmunizados. Además, las células T exhiben
reactividad a los epítopos que se encuentran
en las regiones conservadas de TprK que
pueden promover la secreción de citocinas
Th1 por las células T para activar los
macrófagos y facilitar el aclaramiento
treponémico. La formulación de un cóctel de
vacunas multicomponente utilizando estos
dos antígenos protectores puede permitir
una respuesta protectora de dos frentes
contra el desarrollo de lesiones y la
diseminación treponémica desde el sitio
primario de infección.
FIGURA 5: Resumen de hallazgos clave y mecanismos propuestos. (a) Resumen de hallazgos clave. La
inmunización con Tp0751 promueve la infiltración celular en las lesiones primarias e inhibe la diseminación de T. pallidum
a sitios de órganos distantes. La transferencia de ganglios linfáticos de animales inmunizados con Tp0751 a animales
sin tratamiento previo no causa infección por T. pallidum, lo que confirma la inmunidad estéril. (b) mecanismo propuesto
para la protección contra T. pallidum difusión conferidos por Tp0751 inmunización. Proponemos que la inmunización con
Tp0751 induce la producción de anticuerpos específicos en las lesiones primarias, lo que facilita la eliminación de T.
pallidum a través de la opsonofagocitosis de macrófagos. Los anticuerpos locales específicos de Tp0751 también
inhibirían T. pallidum entrada del torrente sanguíneo al evitar la adhesión mediada por Tp0751 a los componentes de los
vasos sanguíneos. En conjunto, estas reacciones evitarían que T. pallidum acceda al torrente sanguíneo y a los sitios de
infección secundaria.
La diseminación vascular es un componente
clave de la patogénesis de T. pallidum y, por
lo tanto, la identificación de los candidatos a
vacunas involucrados en este proceso es
fundamental para lograr una protección
exitosa. La evaluación de la carga
treponémica en el hígado, el hueso y el bazo
usando qPCR reveló que la inmunización con
Tp0751 inhibe la invasión de T. pallidum en
sitios de tejidos distantes. Es importante
destacar que la disminución más sustancial
en la concentración de ADN de T. pallidum
entre los animales inmunizados y los de
control se observó en el bazo, un sitio
altamente vascularizado que anteriormente
se había demostrado que albergaba la mayor
carga de T. pallidum durante la infección
temprana. Investigaciones anteriores han
implicado a Tp0751 en T. pallidum
diseminación basada en interacciones con los
componentes del huésped de la vasculatura,
incluida la fibronectina, que se encuentra en
la cara luminal del endotelio vascular, así
como laminina y colágeno, ubicados en la
porción subendotelial de la vasculatura.
Además, Tp0751 es capaz de mediar la unión
de las espiroquetas a las células endoteliales
cuando se expresa heterólogamente por una
cepa de Borrelia burgdorferi no infecciosa. Un
análisis estructural reciente de Tp0751 ha
revelado que el extremo C adopta un pliegue
de lipocalina de barril β antiparalelo de ocho
hebras y que las regiones proteicas
localizadas en este pliegue son responsables
de la interacción con los componentes de la
matriz extracelular, mientras que una región
más discreta del pliegue de lipocalina media
la adhesión. a las células endoteliales. El
pliegue de lipocalina Tp0751 es divergente
entre esta familia de proteínas, pero
comparte
importantes
similitudes
estructurales con la proteína de evasión del
complemento de Neisseria meningitidis,
fHbp. Tp0751 y fHbp son lipocalinas lipidadas
expuestas a la superficie que están
implicadas en la patogénesis bacteriana y
carecen de la bolsa de unión hidrófoba
característica que se encuentra en la mayoría
de las lipocalinas. Además, las regiones de
unión al huésped ubicadas dentro de estas
proteínas se mapean a lo largo de una sola
cara del pliegue de la lipocalina. De particular
relevancia para el estudio actual es el hecho
de que la fHbp se identificó como una vacuna
candidata prometedora para el serogrupo B
meningocócico y actualmente forma parte de
las
vacunas
contra
la
meningitis
multicomponente 4CMenB (Bexsero) y
rLP2086 (Trumenba). El rLP2086 se ha
probado con éxito en siete estudios clínicos
con más de 4000 sujetos humanos. Bexsero
fue aprobado en 2013 por la Agencia Europea
de Medicamentos para su uso en todos los
grupos de edad, y Bexsero y Trumenba
fueron aprobados en 2015 y 2014,
respectivamente, por la Administración de
Drogas y Alimentos de los Estados Unidos
para su uso en personas de 10 a 25 años de
edad.
Los resultados presentados en nuestro
estudio indican que el Tp0751 que contiene
el dominio de lipocalina de T. pallidum es un
candidato de vacuna prometedor, ya que la
inmunización con esta proteína reduce
significativamente
la
diseminación
treponémica dentro del huésped (Figura 5a).
La eliminación de la diseminación es un
requisito fundamental para una vacuna
contra la sífilis; Esto simultáneamente (1)
reducirá la incidencia de la sífilis al prevenir la
formación de las lesiones secundarias
altamente infecciosas características de la
sífilis, (2) eliminará las devastadoras
consecuencias de las infecciones congénitas y
(3) evitará la multitud de secuelas graves
asociadas con la sífilis. incluyendo neurosífilis
y sífilis ocular. Esta subunidad candidata a
vacuna, que induce una protección estéril
contra la infección por T. pallidum, puede
ofrecer una solución oportuna a la creciente
amenaza de sífilis que se observa en todo el
mundo.