Mecanismos de reacciones enzimaticas
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Manual de Prácticas de Laboratorio de Mecanismos de Reacciones Enzimáticas M. en C. y T. Luis Eduardo Segura García Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Extracto del Reglamento de Laboratorios de Química (D-CL-20) del Centro Universitario UTEG Artículo 1.- El presente reglamento es obligatorio y de observancia general, tanto para el personal como para los alumnos que conforman la comunidad universitaria UTEG, y tiene por objeto regular el uso y conservación de los laboratorios y equipos especializados en química, incluyendo a sus ramas disciplinarias, así como los derechos y obligaciones de los usuarios y encargados de los mismos. Artículo 3.- Para los efectos de este reglamento se entiende por: a. Agente Infeccioso: microorganismo capaz de causar una enfermedad si se reúnen las condiciones para ello y cuya presencia en un residuo lo hace peligroso. b. Laboratorio de Química: lugar habilitado con material e instrumentos especializados para realizar investigaciones y experimentos de tipo científico, en la materia de química incluyendo sus ramas disciplinarias. c. Residuos Peligrosos: son aquellos que posean alguna de las características de corrosividad, reactividad, explosividad, toxicidad, inflamabilidad, o que contengan agentes infecciosos que les confieran peligrosidad, así como envases, recipientes, embalajes y suelos que hayan sido contaminados cuando se transfieran a otro sitio. d. Residuos Peligroso Biológico-Infecciosos: aquellos clasificados como tales en las Normas Oficiales Mexicanas, como la sangre, sus componentes y derivados; cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos; desechos patológicos como tejidos, órganos, cadáveres y partes de animales; muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e histológico, excluyendo orina y excremento; residuos no anatómicos como materiales de curación que contengan algún tipo de líquido corporal y derivados de los laboratorios; y objetos punzocortantes contaminados y no contaminados (lancetas, jeringas, porta y cubreobjetos, navajas de bisturí). e. Usuario: toda persona miembro de la comunidad universitaria UTEG, sea personal académico, alumnos y trabajadores administrativos, que utilice o haga uso de los laboratorios de química. Artículo 6.- Toda persona que haga uso de los laboratorios deberá registrar su ingreso en las bitácoras correspondientes que, para el efecto de registro, posea el centro universitario, anotando su nombre, matricula o número de empleado y firma. Artículo 7.- Todas las prácticas y/o experimentos que se realicen en los laboratorios deberán estar supervisados por el docente de la asignatura correspondiente. Lic. en Químico Farmacobiólogo I Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Artículo 8.- Los usuarios deberán portar, al ingresar a los laboratorios, el siguiente atuendo: a. b. c. d. e. f. g. h. i. j. k. Bata blanca de manga larga abotonada, con el logo de la institución. Lentes de seguridad. Paño o franela para limpiar su área de trabajo. No usar lentes de contacto, quienes necesiten lentes correctivos deberán portar anteojos. Calzado cerrado, de piso, no de tela y suela antiderrapante (el zapato deberá cubrir completamente el empeine; no se permitirá la entrada con zapato abierto o semicerrado, con o sin calcetines). Pantalón largo de mezclilla o gabardina de algodón. No se permite la entrada con pantalón corto, faldas, blusas escotadas o de tirantes. Cabello recogido (en el laboratorio que se requiera portar cofia). Uñas cortas y limpias, sin esmalte. No accesorios como aretes, anillos, cadenas, pulseras, esclavas y/o relojes. Portar guantes de látex y cubre bocas (bajo indicación del docente, de acuerdo al tipo de práctica y de laboratorio). Mujeres sin maquillaje, de acuerdo al tipo de práctica y de laboratorio, bajo la indicación del docente. Asimismo, es obligatorio llevar a cabo la técnica de lavado de manos indicada por los docentes al iniciar y al terminar la práctica. Artículo 9.- El docente deberá identificar los riesgos específicos de cada práctica e indicar las medidas y procedimientos de seguridad adecuados para su realización, en especial si el alumno pudiera estar expuesto a situaciones de peligro o riesgo, con sustancias peligrosas por el tipo de sus características explosivas, volátiles, corrosivas, reactivas, tóxicas, inflamables o infeccionas. Artículo 11.- Durante el desarrollo de las prácticas en los laboratorios, los docentes a cargo son responsables directos del correcto uso de las instalaciones, material, equipo, reactivos y sustancias, siendo su obligación reportar cualquier irregularidad descubierta en los mismos, notificando por escrito de inmediato al personal a cargo de los laboratorios, así como de los eventuales infractores en su caso. Artículo 12.- El docente que utilice los laboratorios deberá permanecer en los mismos hasta que concluya la práctica, siendo responsable de proporcionar una asesoría adecuada y de calidad a los alumnos durante su desarrollo, así como del comportamiento de los alumnos. Artículo 13.- Los alumnos son responsables del material y equipo de los laboratorios que empleen durante las prácticas. En caso de falla o desperfecto en los equipos, deberán reportarlo de inmediato al docente a cargo de la práctica y/o al Técnico Laboratorista y/o Coordinador de Laboratorios. Para el caso de que algún alumno II Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas rompa de manera accidental o intencionada el material o instrumentos del laboratorio, deberá reponerlo en la misma calidad, cantidad y de la misma marca que el que le fue entregado. Artículo 14.- Son obligaciones de los usuarios de los Laboratorios de Química, las siguientes: a. Asistir con puntualidad a las prácticas. b. Permanecer en orden y guardar silencio. c. Abstenerse de jugar, correr, hacer bromas y emplear lenguaje inadecuado dentro de las instalaciones. d. Realizar el lavado de manos indicado por el docente antes de iniciar la práctica. e. Atender a las indicaciones de vestimenta y atuendo indispensable para asistir a las prácticas. f. Acatar a la brevedad las indicaciones del docente o encargado del laboratorio y/o técnico auxiliar de laboratorio. g. Hacer un uso adecuado de las instalaciones, equipo, materiales, sustancias y/o reactivos. h. Respetar los horarios y condiciones de uso de los laboratorios y sus equipos especializados. i. Revisar con antelación al desarrollo de la práctica, en el manual correspondiente, el material necesario para su realización, solicitado por el docente y/o técnico y/o encargado de laboratorio, ya que sin él no podrán realizarla, ni ingresar al laboratorio, sin excepción. j. Atender a las indicaciones del docente y/o técnico y/o encargado de laboratorio, para la disposición final de las sustancias y reactivos empleados durante las prácticas. k. Localizar el equipo de seguridad para que, en cualquier contingencia, puedan operarlo. l. Usar solamente equipo que se encuentre en buenas condiciones y reportar cualquier desperfecto de inmediato a su docente y/o encargado de laboratorio. m. Guardar su material limpio, seco y completo en la gaveta asignada para tal efecto. n. Una vez concluida la actividad dentro del laboratorio, dejar en perfecto orden el entorno en el cual estuvo trabajando; apagar y entregar equipos y materiales, limpiar las mesas de trabajo, acomodar las bancas o sillas; retirar y limpiar los papeles y elementos utilizados, y reportar cualquier falla del equipo. Artículo 15.- Los alumnos tienen la posibilidad de alquilar en la dirección administrativa del plantel, un lócker al inicio de cada ciclo escolar, para el efecto de que guarden sus objetos personales durante las prácticas de laboratorio; en caso contrario, los alumnos no podrán dejar sus pertenencias en los pasillos, aulas o dentro del laboratorio, y la institución no se hace responsable de los daños que puedan sufrir. Lic. en Químico Farmacobiólogo III Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Artículo 16.-El alumno deberá leer cuidadosamente las etiquetas de los reactivos; en caso de accidente, deberá actuar con calma y reportar inmediatamente lo sucedido al docente y/o técnico y/o encargado de laboratorio. Artículo 17.- Los alumnos deberán observar los cuidados necesarios para el manejo de los equipos utilizados en la práctica y leer previamente el instructivo de trabajo, el cual se encontrará al lado del equipo. Cualquier duda al respecto deberá consultarla con el encargado y/o técnico del laboratorio y/o docente. Artículo 25.- Para poder ingresar a los laboratorios, el alumno deberá portar el atuendo establecido en el presente reglamento, en caso contrario, será facultad del Docente y/o encargado y/o técnico de laboratorio, restringirle el acceso al mismo; de igual manera, deberá asistir con puntualidad en las horas programadas para la práctica. Se nombrará lista de asistencia 10 diez minutos después de la hora señalada para la práctica, después de lo cual no se permitirá el acceso o salida a ningún alumno; sin excepción. Artículo 26.- Se dará una tolerancia de sólo 5 cinco minutos para desocupar las instalaciones, una vez concluido el horario designado. La ausencia de un docente o grupo de alumnos en el horario posterior al que le corresponde, no da derecho a seguir ocupando los laboratorios. Ante la omisión reiterada en el cumplimiento de este artículo (dos o más veces), se podrá negar una nueva reservación, a criterio del Director Académico. Artículo 28.- El docente deberá respetar las fechas y número de prácticas establecidas por él mismo en el programa de prácticas del laboratorio. Si el docente planea realizar una práctica diferente a la programada, deberá notificar con preferencia 3 tres días de anticipación para evitar el gasto innecesario de reactivos y/o uso de equipos. Ante la omisión reiterada en el cumplimiento de este artículo (dos o más veces), se podrá negar una nueva reservación, a criterio del Director Académico. Artículo 29.- El usuario conservará y mantendrá el orden y limpieza de las instalaciones y equipos de los laboratorios de química. Si el laboratorio se encuentra sucio antes de empezar la sesión, el usuario deberá reportarlo al encargado y/o técnico en turno; en caso de no recibir respuesta favorable, se deberá reportar a la Dirección Académica. Artículo 30.- Al inicio de cada semestre los alumnos deberán agruparse por equipos o mesas de laboratorio para realizar las prácticas que les corresponda durante todo el ciclo escolar, nombrando un representante. El docente y/o encargado y/o técnico de laboratorio les entregará por equipo o mesa el material que requerirán a lo largo del semestre, firmando el responsable del equipo, mismo que deberán guardar en la gaveta que les corresponda. Al final del semestre, el material deberá ser devuelto íntegro, de lo contrario le será condicionada la reinscripción al equipo completo. IV Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Existe material que no debe reusarse por la naturaleza de las muestras que se manejan (como portaobjetos, cubreobjetos), este material deberá desecharse en su contenedor correspondiente y el alumno deberá reponerlo en la práctica inmediata posterior en que fue desechado. Artículo 31.- Al inicio de cada práctica el alumno deberá solicitar al docente y/o encargado y/o técnico de laboratorio la llave de la gaveta donde se encuentra su material, para poder emplear el requerido durante la práctica; al final de la misma el material deberá ser devuelto completamente limpio y seco. En caso de que éste sufra algún desperfecto, deberá reportarlo al docente y/o encargado del laboratorio, de lo contrario, asumirá la responsabilidad correspondiente. Artículo 32.- Por ningún motivo el alumno deberá tratar de abrir o reparar el material o equipo del laboratorio por sí mismo. Cualquier falla en el equipo o material deberá ser reportada al docente o técnico y/o encargado del laboratorio. Artículo 33.- El material y/o equipo utilizado debe ser devuelto en las condiciones que fue prestado. Por tal motivo, en caso de que el usuario dañe el equipo y/o material a su cargo de manera accidental o intencional, deberá reponerlo en la práctica inmediata posterior por uno igual en marca y características. En caso contrario, se le negará el servicio por tiempo indefinido y se levantará el acta correspondiente, ajeno a la sanción que le corresponda de acuerdo al Reglamento de Alumnos. En el caso de docentes y/o técnicos laboratoristas que dañen algún equipo o material, se valorará el por parte de Coordinación de Laboratorios y la Dirección Académica; en caso de que tengan que pagar o reponer el material esto se puede hacer mediante un descuento vía nómina previo Vo. Bo. del departamento de Recursos Humanos. Artículo 34.- Para el caso de que el laboratorio no cuente con las muestras necesarias para el desarrollo de la práctica, el docente deberá solicitarlas a sus alumnos con anticipación. Artículo 38.- Se debe conservar siempre limpia la mesa de trabajo al inicio, durante y al finalizar cada práctica; depositar toda la basura en los cestos correspondientes. Los vertederos deberán estar siempre libres de residuos, no se deberán arrojar cuerpos sólidos ni papeles. Artículo 44.- Queda estrictamente prohibido a los usuarios lo siguiente: a. Mascar chicle, introducir y consumir bebidas, alimentos, cigarrillos o cualquier tipo de golosina dentro del área de laboratorios. Lic. en Químico Farmacobiólogo V Mecanismos de Reacciones Enzimáticas b. El uso de lentes oscuros, gorras, audífonos, teléfonos celulares, reproductor de música o video; videojuegos o cualquier equipo electrónico de entretenimiento o comunicación no permitido durante el uso de los laboratorios. c. El uso de sandalias, bermudas, pantalones cortos, cabello largo suelto, accesorios prominentes y corbata. d. Ingresar al laboratorio, tanto alumnos como docentes, sin bata de marga larga o con una bata diferente a la reglamentaria. e. El desorden y ruidos fuera de lo normal, dentro y fuera de los laboratorios; en todo caso los usuarios deberán esperar para su ingreso en el perímetro de acceso a que llegue su docente. f. La entrada a personas ajenas a la comunidad Universitaria UTEG. g. Correr, jugar, hacer bromas o acciones que pongan el peligro su seguridad y la de sus compañeros. h. Ingresar a los laboratorios si no está presente el docente o encargado de laboratorio. i. Utilizar computadora durante la clase, excepto si se requiere para exponer algún tema. j. Introducirse objetos en la boca. k. Hacer uso del equipo de seguridad y/o salida de emergencia cuando no sea necesario. l. Mezclar sustancias y reactivos sin la debida autorización del docente o encargado de laboratorio. m. Hacer un uso incorrecto del mobiliario, equipos, instalaciones, sustancias o reactivos de los laboratorios. n. Proferir palabras altisonantes u ofensivas entre los alumnos, docentes, técnicos y/o encargados de laboratorio. o. Las demás que sean establecidas por el docente, encargado y/o técnico o Director Académico, para garantizar el buen funcionamiento y conservación de los equipos y laboratorios de química. Artículo 45.- Ningún alumno podrá permanecer en el recinto de los laboratorios en ausencia de sus docentes o del responsable de laboratorio, ni portando una bata ajena a la reglamentaria. Ningún docente podrá permanecer en los laboratorios fuera de su programa de prácticas sin la autorización del encargado de laboratorio y/o Director Académico de la carrera y/o portando bata ajena a la reglamentaria. Artículo 46.- En caso de incumplimiento a los lineamientos establecidos en el presente reglamento, podrán ser aplicadas por el encargado o personal responsable del laboratorio, el docente, el Director Académico y/o Administrativo, según sea el caso, sin perjuicio de exigir la reparación de los daños ocasionados, las siguientes sanciones: a. Amonestación verbal o escrita. b. Retención de credenciales. c. Suspensión del servicio. VI Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas d. Las sanciones establecidas en el reglamento que por su relación con el Centro Universitario le correspondan. Artículo 47.- El alumno debe comportarse adecuadamente dentro de las instalaciones del laboratorio, hacer uso apropiado del lenguaje oral y escrito, respetar a sus profesores y compañeros de clase técnicos y/o encargados de laboratorio; en caso contrario se le suspenderá el servicio temporalmente o en casos graves indefinidamente, a criterio del docente o del encargado y/o técnico del laboratorio, previo el aval de Dirección Académica. Artículo 48.- Los alumnos que incumplan con las disposiciones contenidas en el presente reglamento, deberán ser reportados por el docente y/o encargado y/o técnico de laboratorio al Director Académico que corresponda, para que con base en el Procedimiento de Determinación de Responsabilidad y Aplicación de Sanciones establecido en el Reglamento de Alumnos, se determine la sanción que le corresponda de acuerdo a la gravedad de la infracción y se glose copia del acta respectiva al expediente del alumno. Artículo 49.- Los docentes y técnicos y/o encargados de laboratorios que incumplan las obligaciones que este reglamento les confiere, podrán ser sancionados con base en la gravedad de la infracción, de acuerdo al Reglamento de Docentes o Interior de Trabajo, según corresponda. Artículo 50.- Los casos no previstos en este Reglamento serán solucionados por el encargado o técnico del laboratorio, o por el Director Académico en su caso, atendiendo a los intereses de la comunidad y teniendo a la vista el cumplimiento de las finalidades que son propias del servicio de los laboratorios de Química del Centro Universitario. El presente reglamento fue modificado a petición del Director Académico de la Licenciatura en Químico Farmacobiólogo durante revisión oficiosa R03/0114 en el mes de enero de 2014; en virtud de lo anterior se deberá entender que subsiste el contenido en todas sus partes del presente reglamento, en lo que ve a aquellas disposiciones que no fueron modificadas. Estas reformas entrarán en vigor a partir del mes de enero de 2014, previa autorización del Director del Macroproceso correspondiente. TABLA DE MODIFICACIONES REVISIÓN R02 FECHA APROBACIÓN Enero de 2013 Lic. en Químico Farmacobiólogo MODIFICACIONES Artículo 4, 8 inciso e) y f) y 18. VII Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Contenido Introducción, 1 Práctica Nº 1. Titulación de aminoácidos, 3 Práctica Nº 2. Precipitación de proteínas, 9 Práctica Nº 3. Elaboración de geles de acrilamida, 15 Práctica Nº 4. Electroforesis vertical, 19 Práctica Nº 5. Tinción de geles de acrilamida y determinación del peso molecular de proteínas, 25 Práctica Nº 6. Zimograma, 33 Práctica Nº 7. Determinación de la velocidad de reacción enzimática, 39 Práctica Nº 8. Identificación del tipo de inhibición, 45 Bibliografía, 53 Recomendaciones para el manejo de residuos biológico-infecciosos, 55. Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Introducción Este manual fue diseñado para estudiantes de la Licenciatura en Químico Farmacobiólogo, donde podrán comenzar con el estudio de proteínas mediante la ejecución de las prácticas. El alumno se familiarizará primero con los materiales y técnicas utilizadas comúnmente, para después efectuar prácticas especificas que permitan estudiar de manera particular enzimas con una actividad específica. Las enzimas son los catalizadores biológicos por excelencia, nos ayudan a consumar las reacciones a velocidades relativamente rápidas. Por tanto, el estudio de cómo es que ellas trabajan es muy útil en cualquier ámbito laboral del QFB. Conocer cómo se lleva a cabo una reacción que es catalizada por una enzima, permitirá al estudiante tener el control de las reacciones, pudiendo modificar la velocidad de las mismas y detenerlas en el momento deseado. También se podrá favorecer la reacción con la adición de cofactores que necesite la enzima. El estudio de mecanismos de reacciones enzimáticas permitirá al estudiante tener un amplio conocimiento de cómo las enzimas participan en diversas reacciones metabólicas en el organismo, además de concretar una integración del conocimiento adquirido a lo largo de la carrera en las diferentes asignaturas que anteceden a ésta. Al conocer cómo trabaja una enzima, se adquiere la capacidad de análisis y asociación de alteraciones enzimáticas con enfermedades, lo que permite un diagnostico más certero. M. en C. y T. Luis Eduardo Segura García. Lic. en Químico Farmacobiólogo 1 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Práctica Nº 1 Titulación de aminoácidos Fundamento El punto isoeléctrico está definido como el pH en el cual las cargas positivas igualan a las cargas negativas y no existe movimiento en un campo eléctrico. Las proteínas exhiben una conducta anfotérica debido a la presencia de grupos funcionales de aminoácidos y grupos amino y carboxil terminales. En medios ácidos, es decir, en presencia de altas concentraciones de iones H+, la proteína tiene carga positiva. En medios alcalinos, es decir en presencia de iones OH-, la proteína tiene carga negativa. En el punto isoeléctrico, las cargas positivas de los radicales NH3+ igualan a las cargas negativas de los radicales COO-. Las funcionalidades de las proteínas se ven afectadas cuando se aproximan al punto isoeléctrico, debido a la atracción electroestática de los grupos con carga opuesta. De esta manera, las propiedades de la proteína, como el grado de hidratación, viscosidad gelificación, turbidez, fuerza de gel y poder de espumado, cambian de acuerdo con el pH en que se encuentren. El punto isoeléctrico de un aminoácido depende de su estructura, y es el promedio de las dos constantes de disociación ácida que incluyen el zwitterion neutro. En cuanto a los aminoácidos con una cadena lateral que sea un ácido fuerte o un ácido débil, el punto isoeléctrico es el promedio de los dos valores de pKa más bajos. En el caso de los aminoácidos con una cadena lateral básica, el punto isoeléctrico es el promedio de los dos valores de pKa más altos. La capacidad tampón de las proteínas es debida a sus aminoácidos constituyentes, y es mayor que la de los sistemas inorgánicos. Dependiendo del pH del medio en que se encuentren, los aminoácidos pueden tener carga negativa, positiva o compensada (igual número de cargas de ambos signos). La carga de una proteína dependerá del tipo de aminoácidos que la forman y del pH del medio en que se encuentre. El punto isoeléctrico (pI) es el pH para el cual una proteína presenta carga neta compensada (igual número de cargas positivas que negativas) y en el mismo, la solubilidad de la proteína es mínima. Objetivos Determinar los valores de pKa, pKi y pKb de diferentes aminoácidos. Observar el comportamiento de la curva de pH y la forma en que se modifica al agregar una base en presencia del aminoácido. Recursos de la práctica Lic. en Químico Farmacobiólogo 3 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Material Vaso de precipitados 50 ml. Agitador magnético. Reactivos Solución al 1% de glicina (pH 1.3). Solución al 1 % de lisina (pH 1.3). Solución al 1 % de ácido glutámico (pH 1.3). Hidróxido de sodio 0.1 N. Equipo Equipo de titulación. Bureta. Soporte. Plancha con agitación. pH metro. Procedimiento 1. Colocar 20 ml de la solución de glicina 1 % (con pH de 1.3) en un vaso de precipitados de 50 ml con un agitador magnético, sobre una placa con agitación. 2. Agregar hidróxido de sodio 0.1 N en volúmenes de 0.5 ml y anotar el pH. 3. Continuar la titulación hasta que el pH llegue a 12. 4. Efectuar el mismo procedimiento con los demás aminoácidos. 5. Con los datos obtenidos, dibujar una gráfica de pH vs. volumen de NaOH en mililitros. 6. Determinar los valores de pKa, pKi, pKR y pKb. Actividades de la práctica 1. Mencione los grupos funcionales químicos que caracterizan un aminoácido. 2. Mencione que características proporciona cada una de las cadenas R a los aminoácidos. 3. ¿Qué es un grupo ionizable y dónde se localizan en un aminoácido? 4. ¿Cómo se relaciona la carga eléctrica del aminoácido a lo largo de la curva de pH? 5. ¿Qué es el punto isoeléctrico? 4 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Resultados Lic. en Químico Farmacobiólogo 5 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Observaciones 6 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Conclusiones Bibliografía consultada para contestar las actividades del Manual de Prácticas de laboratorio Título 1.- Autor Página Editorial 2.3.- Datos del alumno Nombre del alumno Fecha Grado/grupo/turno Calificación Lic. en Químico Farmacobiólogo 7 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Práctica Nº 2 Precipitación de proteínas Fundamento Cuando la proteína no ha sufrido ningún cambio en su interacción con el disolvente, se dice que presenta una ‘estructura nativa’. Se llama ‘desnaturalización’ de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija. Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente disminuirá su estabilidad en disolución y provocará la precipitación. Así, la desaparición total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las cargas eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrógeno, facilitarán la agregación intermolecular y provocarán la precipitación. La precipitación suele ser consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización, y se dice entonces que la proteína está desnaturalizada. Los aminoácidos y las proteínas son menos solubles en su punto isoeléctrico si las demás condiciones permanecen iguales. Esto se debe a que los iones dipolares no presentan carga neta y cristalizan en forma de sales insolubles a ese pH. En una proteína cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada sólo tienen en común la estructura primaria, es decir, la secuencia de aminoácidos que la componen. Los demás niveles de organización estructural desaparecen en la estructura desnaturalizada. La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína, como cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteína, aumento en la viscosidad y disminución del coeficiente de difusión, así como una drástica disminución de su solubilidad, ya que los residuos hidrofóbicos del interior aparecen en la superficie, y finalmente, una pérdida de las propiedades biológicas. Una proteína desnaturalizada cuenta únicamente con su estructura primaria. Por este motivo, en muchos casos la desnaturalización es reversible, ya que es la estructura primaria la que contiene la información necesaria y suficiente para adoptar niveles superiores de complejidad estructural. El proceso mediante el cual la proteína desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama ‘renaturalización’. Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificación de proteínas, ya que no todas las proteínas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde están disueltas. En algunos casos, la desnaturalización conduce a la pérdida total de la solubilidad, con lo que la proteína precipita. La formación de agregados fuertemente hidrofóbicos impide su renaturalización y hacen que el proceso sea irreversible. Lic. en Químico Farmacobiólogo 9 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Objetivos Determinar la concentración de cada uno de los precipitantes de proteínas. Observar de qué manera las proteínas van precipitando en presencia de agentes precipitantes. Recursos de la práctica Material 20 tubos de ensayo 13x100. Pipeta 5 ml. Pipeta 1 ml. Reactivos Clara de huevo al 10 %. Plasma humano al 2 %. Solución saturada de sulfato de amonio. Ácido tricloroacético al 2 %. Ácido sulfosalicílico al 2 %. Hidróxido de sodio al 2 %. Cloruro férrico al 2 %. Sulfato cúprico al 2 %. Acetato de plomo al 2 %. Etanol al 70 %. Acetona. Equipo Vórtex. Procedimiento 1. Colocar 2.5 ml de la solución de clara de huevo al 10% en un tubo de ensayo. 2. De las soluciones mencionadas en reactivos, colocar gota a gota y medir la cantidad necesaria para precipitar las proteínas. 3. Observar lo que sucede con la primera gota adicionada de cada uno de los reactivos. 4. Efectuar el mismo procedimiento con la solución de plasma humano. Actividades de la práctica 1. Mencione cuál es la principal proteína encontrada en la clara de huevo y en el plasma humano. 2. ¿Por qué las proteínas precipitan en medio ácido? 10 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas 3. Mencione de qué manera afecta la temperatura a la estructura de las proteínas. 4. ¿De qué manera actúan los detergentes sobre la estructura de las proteínas? 5. Mencione cinco agentes precipitantes de proteínas que no modifiquen el pH. Lic. en Químico Farmacobiólogo 11 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Resultados 12 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Observaciones Lic. en Químico Farmacobiólogo 13 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Conclusiones Bibliografía consultada para contestar las actividades del Manual de Prácticas de Laboratorio Título 1.- Autor Página Editorial 2.3.- Datos del alumno Nombre del alumno Fecha Grado/grupo/turno Calificación 14 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Práctica Nº 3 Elaboración de geles de acrilamida Fundamento El gel de poliacrilamida se obtiene a partir de la polimerización de monómeros de acrilamida. Éstos forman cadenas largas que, a su vez se unen por medio de moléculas bifuncionales como el N N’-metilén-bis-acrilamida, que forma enlaces cruzados entre las diferentes cadenas. Para iniciar la reacción de polimerización se utilizan catalizadores como el persulfato de amonio (PSA). El resultado final es una red tridimensional cuya estructura es una red de moléculas. La relación entre las concentraciones de acrilamida y bisacrilamida determinan la longitud de las cadenas del polímero y el número de enlaces cruzados que se forman entre ellas, respectivamente. Ambos factores son importantes al momento de determinar las principales propiedades físicas del gel, como la densidad, elasticidad y, lo más importante, el tamaño del poro. Los geles de poliacrilamida son medios selectivos. Sus principales ventajas son la alta resolución, la ausencia de electroendósmosis y la posibilidad de obtener geles con la misma composición que garantizan la repetibilidad de los experimentos efectuados en diferentes lugares y tiempos. La principal desventaja del uso de los geles de poliacrilamida es la toxicidad de sus componentes, principalmente la acrilamida, la bisacrilamida y el persulfato de amonio, que pueden ser inhalados o absorbidos por contacto con la piel, lo que produce irritación y alteraciones del sistema nerviosos central. Los geles, una vez polimerizados, son relativamente poco tóxicos, aunque es conveniente tomar las precauciones adecuadas durante su manipulación. El tamaño molecular de los componentes de una muestra donde se desean conocer las proteínas de las que está conformada, puede ser bastante homogéneo o variar dentro de un intervalo de tamaños muy amplio. En el primer caso se pueden utilizar geles de poliacrilamida con el tamaño de poro uniforme, mientras que en el segundo caso, donde existe variedad de tamaños dentro una muestra, se recomienda el uso de geles con gradiente de desnaturalizante creciente, con el objetivo de desarrollar la separación electroforética, de forma que a medida que aumenta la concentración del monómero, disminuye el tamaño de los poros del gel, logrando una separación de las proteínas con diferentes tamaños de peso molecular. Objetivos Conocer el procedimiento para la elaboración de un gel de poliacrilamida. Familiarizarse con los reactivos y su función en el análisis de proteínas. Lic. en Químico Farmacobiólogo 15 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Recursos de la práctica Material Juego de micropipetas. Puntas para micropipetas. 2 vasos de precipitados 50 ml. Guantes de látex. Reactivos Acrilamida/bisacrilamida (30:0.8). Tris 3M (pH 8.8). Agua destilada. SDS 10 %. PSA 10 %. Equipo Cámara para electroforesis de proteínas Bio-rad MiniProtean® Tetra Cell. Fuente de poder 300 V. Procedimiento 1. Colocar en el siguiente orden cada una de las soluciones, para preparar el gel de migración a una concentración final de 12 % de acrilamida. 3.25 ml de acrilamida/bisacrilamida (30:0.8). Tris 3M (pH 8.8). 3.37 ml de agua destilada. 78 µl de SDS 10 %. 45 µl de PSA 10 %. 3.75 µl de TEMED (Tetrametil etileno diamina). 2. Una vez mezclado, colocar en el molde para geles de 1 mm. 3. Cuando el gel haya solidificado, preparar el gel superior concentrador, mezclando las soluciones en el siguiente orden: 0.63 ml de acrilamida/bisacrilamida (30:0.8). 0.25 ml de Tris 3M (pH 8.8). 2.83 ml de agua destilada. 37.5 µl de SDS 10 %. 12.75 µl de PSA 10 %. 2.62 µ. de TEMED (Tetrametil etileno diamina). 4. Colocar en la parte superior, encima del gel previamente preparado, y colocar el peine para marcar los pozos. 5. Una vez gelificado todo, guardar en refrigeración hasta el momento de usar, llenando con buffer de corrida todos los pozos. Para el armado de la cámara, seguir las instrucciones del fabricante. Se recomienda utilizar una cámara Bio-rad Mini-Protean® Tetra Cell. Actividades de la práctica 1. Mencione el papel que juega la bisacrilamida y cómo reacciona ésta con la acrilamida. 16 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas 2. Mencione la importancia del orden en los reactivos para la preparación del gel. 3. ¿Qué función tienen el TEMED y el PSA? Resultados Lic. en Químico Farmacobiólogo 17 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Observaciones Conclusiones Bibliografía consultada para contestar las actividades del Manual de Prácticas de Laboratorio Título 1.- Autor Página Editorial 2.3.- Datos del alumno Nombre del alumno Fecha Grado/grupo/turno Calificación 18 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Práctica Nº 4 Electroforesis vertical Fundamento La electroforesis es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico. Estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo, en dependencia de una combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional. Es de destacar que, a escala analítica, los métodos electroforéticos son de alta sensibilidad, poder de resolución y versatilidad, y sirven como método de separación de mezclas complejas de ácidos nucléicos, proteínas y otras biomoléculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Mediante estas técnicas, se pueden conocer también las características ácidobásicas de las proteínas presentes en un extracto crudo, lo que da la información necesaria si se pretende efectuar una separación cromatográfica basada en diferencias de carga. Es útil además para determinar otros parámetros como peso molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de las proteínas. El campo eléctrico se obtiene al aplicar una diferencia de potencial eléctrico entre dos electrodos con carga opuesta. Se crea una corriente eléctrica que, al pasar a través de un medio de soporte que ofrece resistencia, produce calor, el cual proviene de la fuerza electromotriz multiplicado por la intensidad de la corriente eléctrica y el tiempo. Por lo tanto, el calor aumenta la conductividad dentro del sistema electroforético debido a una disminución de la resistencia. Si se trabaja con una diferencia de potencial eléctrico constante, la intensidad de la corriente eléctrica y la velocidad de migración de los componentes de la muestra aumentan progresivamente. Para evitar esto, se aconseja trabajar manteniendo constante la intensidad de la corriente eléctrica. De acuerdo con la ley de Ohm, la fuerza electromotriz es igual a la intensidad de la corriente eléctrica, multiplicada por la resistencia al paso de la corriente eléctrica. Por lo tanto, si la intensidad de la corriente eléctrica es constante, al disminuir la resistencia por causa del calor, también disminuye la fuerza electromotriz y disminuyen los efectos del calor, teniendo como resultado final una velocidad de migración relativamente constante. Mediante la electroforesis es posible separar moléculas biológicas en dependencia fundamentalmente de su carga, bajo la influencia de un campo eléctrico. La electroforesis es un método analítico semipreparativo, en el que se separan biomoléculas, en dependencia entre otros factores de su carga y bajo la acción de un campo eléctrico. Fue empleado por primera vez por Tiselius en 1937. Raymond y Weintraub emplearon en 1959 como soporte para la electroforesis un gel de poliacrilamida (PAGE), posteriormente el método fue perfeccionado por varios investigadores como Davis y Ornstein. La popularidad de éste creció rápidamente y se logró un aumento de la resolución. El dodecil sulfato de sodio (SDS) se introduce en esta técnica en 1970, y ya en 1972 se emplean agentes reductores y SDS en la Lic. en Químico Farmacobiólogo 19 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas determinación del peso molecular de proteínas, en lo que se denominó electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). Objetivos Efectuar una electroforesis vertical de proteínas. Aprender y visualizar cómo el campo eléctrico provoca una migración de las proteínas de la muestra a través del gel de acrilamida. Recursos de la práctica Material Gradilla flotante para tubos de microcentrífuga. Vaso de precipitados 500 ml. Juego de micropipetas. Puntas para micropipetas. Recipientes de plástico para colocar el gel. Reactivos Suero sanguíneo. Huevo. Saliva. Cultivo bacteriano de Pseudomonas aeruginosa. Tierra. Buffer simple de carga. Buffer desnaturalizante. Buffer de corrida 1X. Marcador de peso molecular Kaleidoscope Prestained Standards. Solución decolorante 1X. Equipo Vórtex. Plancha de calentamiento. Cámara para electroforesis de proteínas Bio-rad Mini-Protean® Tetra Cell. Fuente de poder de 300 V. Refrigerador. Procedimiento 1. Preparación de soluciones. Buffer simple (10x) Buffer desnaturalizante Buffer de migración desnaturalizante (10x) Tris-HCl 2 M, pH 8.8, EDTA 50 mM, sucrosa 10 mM, azul de bromofenol 1 % p/v, glicerol 20 % p/v. SDS 18 % p/v, DTT o 2-mercaptoetanol 0.05 M. Trizma base 0.25 M pH 8.5, glicina 14.4 % p/v, SDS 1 % p/v. 2. Preparación de las muestras. Muestra de suero sanguíneo al 20 %. Muestra de clara de huevo al 20 %. Muestra de yema de huevo al 5 %. 20 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Muestra de saliva al 50 %. Muestra de un cultivo bacteriano (Pseudomonas aeruginosa) centrifugado; recuperar el sobrenadante y diluir al 50 %. Muestra de tierra al 10 %, centrifugar y recuperar el sobrenadante. 3. Tomar 40 µL de muestra, mezclar con 5 µl de buffer simple de carga y 10 µl de buffer desnaturalizante. 4. Las mezclas se calientan a 96 °C por 5 minutos y se agitan en vórtex para su homogenización. 5. Colocar el gel previamente preparado en la práctica anterior dentro de la cámara de electroforesis y colocar buffer de corrida 1X hasta la marca indicada en la cámara. Medir el volumen de buffer gastado. 6. Inyectar 10 µl de cada una de las muestras con una micropipeta, una en cada pozo, con cuidado de no contaminar los pozos con las diferentes muestras; dejar vacíos los pozos de las orillas. 7. Posteriormente, con la ayuda de una micropipeta, se cargan en los pozos de las orillas 5 µl de un marcador de peso molecular; se recomienda Kaleidoscope Prestained Standards Bio-rad®. 8. Una vez cargado el gel, se tapa la cámara de electroforesis, se conecta a la fuente de poder y se programa a 120 V constantes durante 90 minutos, o hasta el momento en que el frente de corrida salga del gel. 9. Apagar la fuente de poder y terminar la electroforesis. 10. Desarmar la cámara con cuidado de que el gel no se rompa y colocar el gel en solución decolorante 1x; guardar hasta su tinción en refrigeración. Actividades de la práctica 1. ¿Qué carga eléctrica tienen las proteínas y qué le confiere esa carga? 2. Durante la electroforesis, ¿cuál es el polo eléctrico que atrae a las proteínas? 3. ¿Cuál es la función de buffer de corrida? 4. ¿Podría efectuarse una electroforesis con agua destilada en lugar de buffer de corrida? Justifique su respuesta. Lic. en Químico Farmacobiólogo 21 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Resultados Observaciones 22 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Conclusiones Bibliografía consultada para contestar las actividades del Manual de Prácticas de Laboratorio Título 1.- Autor Página Editorial 2.3.- Datos del alumno Nombre del alumno Fecha Grado/grupo/turno Calificación Lic. en Químico Farmacobiólogo 23 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Práctica Nº 5 Tinción de geles de acrilamida y determinación del peso molecular de proteínas Fundamento Las tinciones son utilizadas para visualizar las proteínas separadas dentro del gel de poliacrilamida. Los colorantes más utilizados son el azul de Coomassie y el nitrato de plata, siendo este último el más sensible, logrando teñir pequeñas concentraciones de proteína en el gel. Las proteínas coloreadas naturales, como la mioglobina, hemoglobina, ferritina y citocromo C, pueden ser observadas directamente en los geles, sin embargo la visualización de la mayoría de las proteínas requiere el uso de colorantes. Los colorantes orgánicos fueron los primeros empleados para teñir proteínas en los geles, ejemplo de éstos son el azul de bromofenol y azul de Coomassie. Una rápida tinción, desteñido y fijación son esenciales en el caso de las proteínas pequeñas para evitar su elusión; la omisión del metanol de la solución de tinción es beneficiosa, ya que se reduce el tiempo de tinción y disminuye el hinchamiento de los geles. La tinción de plata tiene la característica de producir generalmente coloraciones negras y grisáceas, sin embargo algunas proteínas tienen colores característicos, como las lipoproteínas, que tienden a colorearse de azul, y algunas glicoproteínas que aparecen amarillas, carmesíes o rojas. Este efecto cromático se ha demostrado que está dado por la difracción de la luz en la plata. Se han desarrollado algunos procedimientos de tinción con plata para identificar ciertas proteínas, con el empleo de combinaciones de tinción. La tinción con Coomassie puede emplearse para la determinación de proteínas cuando éstas son abundantes, pero no para la determinación de pureza de proteínas en trazas. Esta tinción requiere un medio ácido para generar la atracción electrostática entre las moléculas del colorante y los grupos amino de las proteínas. La atracción iónica es por medio de las fuerzas de Van Der Walls, que unen a las proteínas y al colorante formando un complejo. Esta unión es totalmente reversible en condiciones apropiadas. Se ha reportado la tinción de proteínas por otros métodos, entre los que se encuentran el negro de eriocromo, compuestos fluorogénicos y modificación de los aminoácidos de las proteínas. El peso molecular (PM) de las proteínas puede determinarse en electroforesis al comparar las movilidades electroforéticas de varios marcadores de peso molecular conocido. Existen patrones (mezclas de proteínas de peso molecular conocido y que se tiñen uniformemente) de varios rangos de peso molecular, se debe utilizar el que abarque el peso molecular esperado para la proteína que se quiere determinar. Estos patrones deben ser tratados de manera similar a la muestra. En general, cuando las proteínas tienen gran cantidad de carbohidratos en su composición o cuando están Lic. en Químico Farmacobiólogo 25 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas unidas a complejos de membrana, migran de manera aberrante, por lo que no son recomendadas como marcadores de peso molecular. Al elaborar una gráfica del logaritmo del peso molecular (log PM) de la proteína patrón como función del valor del factor de retención (Rf), se obtiene un gráfico ligeramente sigmoideo. El peso molecular desconocido puede estimarse por el análisis de regresión lineal o por interpolación en la curva del log de PM contra Rf. La gráfica de Ferguson del log de Rf contra el porcentaje de desnaturalizante del gel separador para varias proteínas patrones, comprueba el error sistemático del método. Para esto es importante que dichas proteínas muestren uniformidad en su densidad de carga, lo que se determina por la intercepción de sus líneas a 0 % de desnaturalizante. Se obtiene una gráfica de Ferguson no lineal, el fraccionamiento de pequeñas proteínas a una alta concentración de gel o de proteínas muy grandes que dan valores de Rf muy pequeños. El coeficiente de retardación (Kr) da una medida de la influencia de la separación o tamizaje sobre la movilidad de las biomoléculas; se ha reportado que es función del peso molecular y existe inclusive para moléculas pequeñas. Los valores de Kr podrían minimizarse para todas las proteínas patrones por selección de valores bajos de corriente. Con el empleo de la gráfica de Ferguson se pueden discriminar las diferencias de carga, el peso molecular y las formas de diferentes isómeros, así como determinar el peso molecular de estos; sin embargo se pueden encontrar dificultades técnicas cuando varios multímeros de proteínas se analizan. Objetivos 26 Aprender cómo se efectúa la tinción de un gel de poliacrilamida para visualizar las proteínas separadas que componen una muestra. Determinar los pesos moleculares de las proteínas que componen una muestra. Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Recursos de la práctica Material Recipientes de plástico para colocar el gel. Reactivos Solución colorante de azul de Coomassie. Solución decolorante 5X. Agua destilada. Equipo Agitador orbital. Transiluminador de luz blanca. Fotodocumentador. Procedimiento 1. Preparación de soluciones. Solución colorante Solución decolorante (5x) Azul de Coomasie 0.25 % p/v, etanol 45.5 % v/v, ácido acético 9 % v/v, agua 45.5% v/v. Etanol 25 % v/v, ácido acético 37.5 % v/v, agua 37.5 % v/v. 2. Desmontar el gel de electroforesis de la práctica anterior. 3. Con cuidado de que no se rompa el gel, se coloca en un recipiente con la solución colorante de azul de Coomassie durante 1 hora. 4. Posteriormente se coloca el gel en la solución decolorante 5X durante 3 horas y se cambia la solución para dejar otras 3 horas más; finalmente se deja en agua destilada toda la noche. 5. Observar las bandas de color azul que corresponden a cada una de las proteínas que conforman la muestra, para una mejor visualización de las bandas, colocar el gel en un transiluminador de luz blanca. 6. Para la determinación del peso molecular, identificar el marcador de peso molecular y cada una de las bandas que lo conforman. 7. Tomar una fotografía con el fotodocumentador y hacer una interpolación de las bandas de proteínas de la muestra con los valores del peso molecular de las bandas del marcador de peso molecular. Actividades de la práctica 1. ¿Cuál es la función del ácido acético en la solución de tinción y en la decolorante? 2. ¿Qué sucedería si omitimos el ácido acético al momento de preparar las soluciones antes mencionadas? Lic. en Químico Farmacobiólogo 27 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas 3. Explique de qué forma el azul de Coomassie se une a las proteínas. 4. ¿Por qué las bandas de peso molecular diferente no son equidistantes en su migración? 5. ¿Cuál de las muestras analizadas presenta mayor diversidad de proteínas? ¿Por qué cree usted que esta muestra tenga la mayor variedad? 28 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Resultados Lic. en Químico Farmacobiólogo 29 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Observaciones 30 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Conclusiones Bibliografía consultada para contestar las actividades del Manual de Prácticas de Laboratorio Título 1.- Autor Página Editorial 2.3.- Datos del alumno Nombre del alumno Fecha Grado/grupo/turno Calificación Lic. en Químico Farmacobiólogo 31 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Práctica Nº 6 Zimograma Fundamento El zimograma es un método que permite determinar en un gel de acrilamida nativo (sin desnaturalizar) cuál de las proteínas presentes en la muestra es la que tiene una actividad enzimática especifica; eso requiere utilizar sustratos específicos para la enzima en cuestión. Una vez efectuada la separación de las proteínas que componen una muestra compleja, ésta se pone en contacto con el sustrato, permitiendo que se lleve a cabo la reacción. Para visualizar la banda que está produciendo la reacción se utiliza un colorante como indicador, el cual puede estar basado en el cambio de pH producido por el metabolito de la reacción que la enzima esté realizado, o bien puede llegar a producirse como metabolito una molécula que tenga color propio. Las lipasas son enzimas triacilglicerol acilhidrolasas (EC 3.1.1.3) que son capaces de hidrolizar los triglicéridos, generando como metabolitos los ácidos grasos libres y la molécula del glicerol. Utilizando el cambio de pH en la zona de reacción, se pueden observar las zonas que corresponden a la banda que tiene la actividad enzimática. Objetivos Determinar cuál de las proteínas presentes en la muestra manifiesta actividad lipasa. Visualizar el cambio de color en un zimograma que corresponde a una reacción positiva de actividad lipasa. Recursos de la práctica Material Juego de micropipetas. Puntas para micropipetas. 2 vasos de precipitados 50 ml. Guantes de látex. Gradilla flotante para tubos de microcentrífuga. Vaso de precipitados 500 ml. Reactivos Acrilamida/bisacrilamida (30:0.8). Tris 3M (pH 8.8). Agua destilada. SDS 10 %. PSA 10 %. Suero sanguíneo. Huevo. Saliva. Cultivo bacteriano de Pseudomonas aeruginosa. Lic. en Químico Farmacobiólogo Equipo Cámara para electroforesis de proteínas Bio-rad Mini-Protean® Tetra Cell. Fuente de poder de 300 V. Vórtex. Plancha de calentamiento. Refrigerador. 33 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Recipientes de plástico para colocar el gel. Recipientes de plástico para colocar el gel. Tierra. Buffer simple de carga. Buffer desnaturalizante. Buffer de corrida 1X. Marcador de peso molecular Kaleidoscope Prestained Standards. Solución decolorante 1X. Solución colorante de azul de Coomassie. Solución decolorante 5X. Agua destilada. Agitador orbital. Transiluminador de luz blanca. Fotodocumentador. Procedimiento 1. Elaborar dos geles no desnaturalizantes, para lo cual se preparan los geles de poliacrilamida al 12 % y se sustituye el SDS por agua destilada. 2. Se elaboran dos geles idénticos, uno se teñirá con azul de Coomassie (como se ha trabajado previamente en las prácticas anteriores) y el otro se utilizará para realizar el zimograma. 3. Las muestras se preparan sin adición de SDS ni agente reductor (DTT o β-mercaptoetanol), es decir, sin el buffer desnaturalizante. 4. La corrida electroforética se hace con un buffer de migración que no debe contener SDS. 5. La migración se lleva a cabo a 80 V durante 3 horas o hasta el momento en que el frente de corrida emerja del gel. Durante la migración se recomienda mantener la cámara de electroforesis fría, para lo cual puede colocarse dentro del refrigerador o bien dentro de un recipiente con hielo. Esto, con el fin de evitar un aumento en la temperatura que pueda ocasionar una desnaturalización o modificación en la estructura de las enzimas. 6. Una vez finalizada la electroforesis, los geles deberán desmontarse y colocarse de manera individual en recipientes; en el gel que será teñido con azul de Coomassie se sigue la técnica de la práctica anterior y el otro gel se coloca con agua destilada, manteniéndolo en agitación por 1 hora a temperatura ambiente y haciendo cambios de agua cada 20 minutos. 7. Para la búsqueda de actividad lipasa, se prepara una solución de tributirina (TC4) 0.25 % p/v y rojo de fenol 0.01 % p/v en MOPS 2.5 mM, pH 6.8 y 0.15 % de NLS (N-laurilsarcosina). El pH se ajusta a 6.8 para tener una mejor definición del color. Para una homogeneización total de la solución, utilizar el vórtex. 8. Después de ser lavado con agua destilada, el gel para el zimograma se sumerge en la solución con el sustrato y el colorante hasta que se observen bandas de color amarillo, que serán indicativas de actividad lipasa. 9. Colocar el gel en el transilumidor de luz blanca y tomar una fotografía con el fotodocumentador. 34 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas 10. Hacer una comparación de los 2 geles, en el gel teñido con azul de Coomassie se observarán todas las proteínas que componen la muestra, mientras que en el gel del zimograma se observarán sólo las bandas que posean actividad lipasa. Actividades de la práctica 1. ¿Para qué sirven los zimogramas? 2. Explique la función del rojo de fenol en el sustrato del zimograma. 3. ¿Qué función tiene el NLS en la solución de sustrato? 4. Dibuje la estructura de la tributirina y describa lo que le sucede por acción de la enzima lipasa. Lic. en Químico Farmacobiólogo 35 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Resultados 36 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Observaciones Lic. en Químico Farmacobiólogo 37 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Conclusiones Bibliografía consultada para contestar las actividades del Manual de Prácticas de Laboratorio Título 1.- Autor Página Editorial 2.3.- Datos del alumno Nombre del alumno: Fecha Grado/grupo/turno Calificación 38 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Práctica Nº 7 Determinación de la velocidad de reacción enzimática Fundamento La mayoría de las reacciones químicas que ocurre en el organismo como parte del metabolismo, es catalizada por enzimas. Las enzimas son proteínas especializadas en incrementar millones de veces la velocidad en que ocurren las reacciones que catalizan. Esto es posible porque se combinan de forma específica y transitoria con los sustratos de la reacción, facilitando la estabilización o ruptura de un enlace químico. Como proteínas, poseen una estructura tridimensional que resulta esencial para su actividad catalítica. Algunas precisan de otros componentes químicos, ajenos a la cadena peptídica, denominados ‘cofactores’. Las enzimas se sintetizan en el interior de las células, aunque se encuentran también en el líquido intersticial y en muchos fluidos biológicos debido a que son excretadas, o bien, llegan a escapar de la célula que las produjo. En organismos superiores cada tipo celular contiene una dotación de enzimas especializadas, dependiendo de la función requerida, lo cual se logra con un mecanismo de regulación de la expresión genética. En bioquímica es de gran importancia medir la concentración de enzimas en algunos líquidos biológicos, como el suero sanguíneo y la orina, lo cual sirve como indicador de alteraciones o buen funcionamiento de diversos órganos y tejidos. Aunque la concentración de enzimas en estos líquidos es muy baja, teniendo unidades de nanomoles, es posible medirlas gracias a su actividad catalítica, pues producen la transformación del sustrato específico en un tiempo determinado. Otra opción analítica para la cuantificación de enzimas es el inmunoanálisis, que es menos practicado y consiste en la utilización de anticuerpos marcados que reconocen específicamente a la enzima. La medición de la actividad catalítica tiene en cuenta la concentración de enzima funcionalmente activa, mientras que el inmunoanálisis cuantifica toda la masa de enzima que es reconocida por el anticuerpo, lo cual puede incluir una concentración de enzima inactiva. En las muestras biológicas coexisten tanto la forma catalíticamente activa como la inactiva por perdida de cofactores. La actividad catalítica de una enzima es una propiedad que se estima mediante la medición de la velocidad de transformación de una reacción química catalizada en un sistema de reacción específico. Se expresa como cantidad de sustancia transformada por unidad de tiempo, por ejemplo moles por segundo (mol/s), siendo su unidad el ‘catal’ (kat). Por otro lado, la concentración catalítica es la actividad por unidad de volumen de muestra y su unidad es el ‘catal por litro’ (kat/l). Objetivos Determinar la velocidad de reacción de una enzima. Lic. en Químico Farmacobiólogo 39 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Medir de manera práctica el tiempo que tarda una enzima en transformar su sustrato, así como la concentración del mismo. Recursos de la práctica Material Tubos de ensayo. Micropipetas. Puntas para micropipetas. Cubetas 1 cm para espectrofotómetro. Reactivos Suero sanguíneo. P-nitrofenil-fosfato (p-NFF). P-nitrofenol (p-NF). Agua destilada. Buffer Tris 10 mM pH 9.6. NaOH 0.2 N. Equipo Espectrofotómetro. Baño de agua a 37 °C. Procedimiento 1. Preparar la curva tipo, de concentraciones conocidas del producto de la reacción, que en este caso será p-nitrofenol (p-NF). Colocando los volúmenes descritos a continuación. Tubo Blanco 1 2 3 4 Tris pH 9.6 2.2 ml 2.2 ml 2.2 ml 2.2 ml 2.2 ml Agua destilada 1 ml X X X X Solucion de p-NF X 1 ml (15µM) 1 ml (30µM) 1 ml (60µM) 1 ml (90µM) 2. Mezclar bien en vórtex. 3. Colocar la longitud de onda del espectrofotómetro a 400 nm, que corresponde a la máxima absorción del p-NF. 4. Ajustar el cero de absorbancia con el tubo marcado como blanco. 5. Medir la absorbancia de todos los tubos (1-4) y anotar los valores obtenidos. 6. Elaborar la gráfica de absorbancia contra la concentración de p-NF y determinar la ecuación de la recta mediante regresión lineal. 7. Para conocer la velocidad de reacción de la enzima fosfatasa alcalina, preparar 6 tubos como se menciona a continuación. Colocar todos los reactivos, excepto el suero, y mantener en hielo. Tubo 1 2 3 4 5 6 40 Tris pH 9.6 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml Agua destilada 1 ml X X X X x p-NFF X 1 ml (2.5 mM) 1 ml (5 mM) 1 ml (7 mM) 1 ml (10 mM) 1 ml (15 mM) Suero 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas 8. Una vez que se tienen todos los reactivos en el tubo, colocar el suero al mismo tiempo en todos los tubos e incubar por 5 minutos a 37 °C. 9. Para detener la reacción, pasados los 5 minutos colocar 0.3 ml de NaOH 0.2 N a todos los tubos al mismo tiempo y mezclar en vórtex. 10. Ajustar el cero de absorbancia con el tubo 1 a 400 nm. 11. Medir la absorbancia de los demás tubos (2-6). 12. Calcular las velocidades de cada tubo expresada en nmoles p-NF/min. 13. Elaborar la grafica de 1/V contra 1/S y calcular los parámetros Km y Vmax. Actividades de la práctica 1. Describa la reacción del p-NFF y cómo éste es convertido en p-NF por acción de la enzima fosfatasa alcalina. 2. ¿Cómo se interpreta el valor numérico de Km, respecto a la afinidad de la enzima por el sustrato? Lic. en Químico Farmacobiólogo 41 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Resultados 42 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Observaciones Lic. en Químico Farmacobiólogo 43 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Conclusiones Bibliografía consultada para contestar las actividades del Manual de Prácticas de Laboratorio Título 1.- Autor Página Editorial 2.3.- Datos del alumno Nombre del alumno Fecha Grado/grupo/turno Calificación 44 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Práctica Nº 8 Identificación del tipo de inhibición enzimática Fundamento Diversos factores afectan la velocidad con la que una enzima transforma el sustrato en productos. Por consiguiente, variaciones en estos factores pueden ocasionar cambios importantes en la velocidad de transformación que se mide y, por tanto, en la concentración catalítica medida. Es preciso conocer y normalizar adecuadamente cada una de dichas fuentes de variabilidad. Existen inhibiciones reversibles e irreversibles. Mientras que la inhibición reversible ocurre mediante uniones no covalentes, en la inhibición irreversible la unión sucede covalentemente. La inhibición reversible puede anularse cuando se retira el inhibidor. En algunos casos, la unión no covalente puede ser tan fuerte que parecería irreversible en condiciones fisiológicas. En la inhibición irreversible se incapacita totalmente a la enzima; este tipo de inhibición suelen provocarlo las toxinas y venenos específicos, muchos de los cuales pueden causar la muerte al incapacitar enzimas importantes. Los mecanismos mediante los cuales se reduce la actividad enzimática y la forma en que afectan la cinética de la reacción, difieren en los diversos modos de inhibición reversible. La inhibición competitiva ocurre cuando el inhibidor se trata de una molécula muy parecida al sustrato, pero la enzima no es capaz de transformarlo; por tanto, el inhibidor se une a la enzima en el sitio de unión, lo que provoca un retraso en la actividad enzimática. Durante la fracción de tiempo en que la molécula de inhibidor competitivo ocupa el lugar activo, la enzima no está disponible para la catálisis. El efecto global es como si la enzima no pudiera unirse al sustrato tan bien cuando está presente el inhibidor, por tanto el valor de Km aumenta, pero la velocidad máxima de reacción no es afectada, teniendo un valor de Vmax igual. La inhibición no competitiva se produce cuando una molécula o un ion pueden unirse a un segundo lugar de una superficie enzimática pero no al sitio activo, de tal manera que se modifique el Kcat, distorsionando la enzima de modo que el proceso catalítico no fuera tan eficaz. En este caso el inhibidor no se parece al sustrato, sino que tiene una afinidad por un segundo sitio de unión, de forma que la enzima sí puede unirse al sustrato, pero no deja que la enzima efectúe su reacción. De esta manera, la afinidad por el sustrato no es modificada y la Km permanece constante mientras que la Vmax disminuye por efecto del inhibidor. Las inhibiciones mixtas son aquellas que modifican no sólo Km sino también Vmax, de la misma manera, donde el inhibidor tiene afinidad tanto por el sitio de unión a la proteína como por el complejo enzima sustrato, la cual se aprecia en la grafica de la doble inversa con rectas que poseen la misma pendiente. Lic. en Químico Farmacobiólogo 45 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Objetivos Identificar el tipo de inhibición que provocan el EDTA y la urea sobre la acción de la fosfatasa alcalina. Observar cómo se afecta la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina en presencia de sustancias como el EDTA y la urea. Recursos de la práctica Material Tubos de ensayo. Micropipetas. Puntas para micropipetas. Cubetas 1 cm para espectrofotómetro. Reactivos Suero sanguíneo. P-nitrofenil-fosfato (p-NFF). P-nitrofenol (p-NF). Agua destilada. Buffer Tris 10 mM pH 9.6. NaOH 0.2 N. EDTA 1 mM pH 9.6. EDTA 0.5 mM pH 6. Urea 1 mM pH 6. Urea 0.5 mM pH 6. Equipo Espectrofotómetro. Baño de agua a 37 °C. Procedimiento 1. Preparar la curva-tipo de concentraciones conocidas del producto de la reacción, que en este caso será p-nitrofenol (p-NF), colocando los volúmenes descritos a continuación. Tubo Blanco 1 2 3 4 Tris pH 9.6 2.2 ml 2.2 ml 2.2 ml 2.2 ml 2.2 ml Agua destilada 1 ml X X X X Solución de p-NF X 1 ml (15 µM). 1 ml (30µM). 1 ml (60 µM). 1 ml (90 µM). 2. Mezclar bien en vórtex. 3. Colocar la longitud de onda del espectrofotómetro a 400 nm, que corresponde a la máxima absorción del p-NF. 4. Ajustar el cero de absorbancia con el tubo marcado como blanco. 5. Medir la absorbancia de todos los tubos (1-4) y anotar los valores obtenidos. 6. Elaborar la gráfica de absorbancia contra la concentración de p-NF y determinar la ecuación de la recta mediante regresión lineal. 46 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas 7. Para conocer la velocidad de reacción de la enzima fosfatasa alcalina, preparar 6 tubos como se menciona a continuación. Colocar todos los reactivos, excepto el suero, y mantener en hielo. Tubo 1 2 3 4 5 6 Tris pH 9.6 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml Agua destilada 1 ml X X X X X p-NFF X 1 ml (2.5 mM). 1 ml (5 mM). 1 ml (7 mM). 1 ml (10 m) 1 ml (15 mM) Suero 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 8. Una vez que se tienen todos los reactivos en el tubo, agregar el suero al mismo tiempo a todos los tubos e incubar por 5 minutos a 37 °C. 9. Para detener la reacción, pasados los 5 minutos colocar 0.3 ml de NaOH 0.2N a todos los tubos al mismo tiempo y mezclar en vórtex. 10. Ajustar el cero de absorbancia con el tubo 1 a 400 nm. 11. Medir la absorbancia de los demás tubos (2-6). 12. Para conocer el efecto del EDTA, preparar los tubos como se menciona a continuación. Tubo 7 8 9 10 11 12 Tris pH 9.6 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml Agua destilada 1 ml X X X X x p-NFF X 1 ml (2.5 mM) 1 ml (5 mM) 1 ml (7 mM) 1 ml (10 mM) 1 ml (15 mM) EDTA 0.5 mM 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Suero 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 13. Ajustar el cero de absorbancia con el tubo 7 a 400 nm. 14. Medir la absorbancia de los demás tubos (8-12). 15. Para conocer el efecto del EDTA, preparar los tubos como se menciona a continuación. Tubo 13 14 15 16 17 18 Tris pH 9.6 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml Agua destilada 1 ml X X X X X p-NFF X 1 ml (2.5 mM) 1 ml (5 mM) 1 ml (7 mM) 1 ml (10 mM) 1 ml (15 mM) EDTA 1 mM 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Suero 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 16. Ajustar el cero de absorbancia con el tubo 13 a 400 nm. 17. Medir la absorbancia de los demás tubos (14-18). 18. Para conocer el efecto de la urea, preparar los tubos como se menciona a continuación. Lic. en Químico Farmacobiólogo 47 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Tubo 19 20 21 22 23 24 Tris pH 9.6 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml Agua destilada 1 ml X X X X x p-NFF X 1 ml (2.5 mM) 1 ml (5 mM) 1 ml (7 mM) 1 ml (10 mM) 1 ml (15 mM) Urea 0.5 mM 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Suero 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 19. Ajustar el cero de absorbancia con el tubo 19 a 400 nm. 20. Medir la absorbancia de los demás tubos (20-24). 21. Para conocer el efecto de la urea, preparar los tubos como se menciona a continuación. Tubo 25 26 27 28 29 30 Tris pH 9.6 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml 2.1 ml Agua destilada 1 ml X X X X X p-NFF X 1 ml (2.5 mM) 1 ml (5 mM) 1 ml (7 mM) 1 ml (10 mM) 1 ml (15 mM) Urea 0.5 mM 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Suero 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 22. Ajustar el cero de absorbancia con el tubo 25 a 400 nm. 23. Medir la absorbancia de los demás tubos (26-30). 24. Calcular las velocidades de cada tubo expresada en nmoles p-NF/min. 25. Realizar la gráfica de 1/V contra 1/S y calcular los parámetros Km y Vmax. Actividades de la práctica 1. Explique los 3 tipos de inhibidores irreversibles. 2. ¿Qué es una enzima michaeliana? 3. Mencione 5 inhibidores biológicos que afectan la actividad de la enzima fosfatasa alcalina. 4. ¿Cuál es la concentración normal de fosfatasa alcalina en el suero sanguíneo? 48 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Resultados Lic. en Químico Farmacobiólogo 49 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Observaciones 50 Lic. en Químico Farmacobiólogo Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Conclusiones Bibliografía consultada para contestar las actividades del Manual de Prácticas de Laboratorio Título 1.- Autor Página Editorial 2.3.- Datos del alumno Nombre del alumno Fecha Grado/grupo/turno Calificación Lic. en Químico Farmacobiólogo 51 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Bibliografía Devlin, TM (2004). Bioquímica. Un texto con aplicaciones clínicas. 4ª edición. Ed. Reverte. Mathews, CK; Van Holde, KE; Ahern, KG (2014). Bioquímica. 4ª edición, Ed. Pearson Higher Education. ISBN: 9788490353929. Nelson, DL y Cox, MM (2005). Lehninger principios de bioquímica. 4ª edición. Ed. Omega. Segel IH (1993). Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme System, Ed. Wiley. Voet D.; Voet J. (2006). Bioquímica. Ed. Médica Panamericana. Lic. en Químico Farmacobiólogo 53 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas Recomendaciones para el manejo de residuos biológico-infecciosos Durante el desarrollo de las prácticas del laboratorio de biotecnología se manipularán microorganismos vivos, por lo cual se deberán seguir los reglamentos establecidos para el manejo y desecho de residuos biológico infecciosos en el laboratorio, de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo. Para efectos de esta NOM y la utilización dentro de este Manual de Prácticas, se consideran residuos peligrosos biológico-infecciosos los siguientes: Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación, así como los generados en la producción y control de agentes biológico-infecciosos. Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biológico-infecciosos. Los alumnos deberán colocar los residuos en los recipientes correspondientes para que sean tratados por los prestadores de servicio. Los prestadores de servicios deben cumplir con las disposiciones correspondientes a las siguientes fases de manejo, según el caso: a) b) c) d) e) Identificación de los residuos. Envasado de los residuos generados. Almacenamiento temporal. Tratamiento. Disposición final. Tipo de residuos Estado físico Envasado Color Cultivos y cepas de agentes infecciosos Sólidos Bolsas de polietileno Rojo Objetos punzocortantes Sólidos Recipientes rígidos de polipropileno Rojo Tratamiento Los residuos peligrosos biológico-infecciosos deben ser tratados por métodos físicos o químicos que garanticen la eliminación de microorganismos patógenos y deben hacerse irreconocibles para su disposición final en los sitios autorizados. Para este fin, los residuos generados no son considerados patógenos, pues se utilizan microorganismos utilizados en la industria alimenticia considerados como Lic. en Químico Farmacobiólogo 55 Mecanismos de Reacciones Enzimáticas seguros para consumo humano, por lo que se esterilizarán en autoclave para posteriormente ser desechados. Disposición final Los residuos peligrosos biológico-infecciosos tratados e irreconocibles, podrán disponerse como residuos no peligrosos en sitios autorizados por las autoridades competentes. Residuos químicos Los residuos químicos generados se colectarán por separado y se entregarán al técnico del laboratorio para que sean tratados de acuerdo a las normas y reglamentos establecidos por la institución. 56 Lic. en Químico Farmacobiólogo
