Tesis: Bacterias Sulfato-Oxidantes en Anadara tuberculosa

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUÍZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DECANATO
PROYECTO DE TESIS
I.
GENERALIDADES
1. Título del Proyecto
Aislamiento y caracterización molecular de bacterias sulfato-oxidantes
presentes en la sangre del molusco bivalvo “Anadara tuberculosa
concha negra” (Sowerby 1833).
2. Personal investigador
2.1.Autor
Joselyn Marilyn Zavala Arellano
2.2.Asesor
Maria Victoria Lora Vargas
2.3.Co-Asesor
Benoit Diringer
3. Carrera Profesional-Especialidad
Biología- Biología Pesquera
4. Tipo de Investigación
4.1.De Acuerdo al fin que se persigue
Básica
4.2.De acuerdo a la técnica de contrastación
Descriptiva
5. Régimen de investigación
Libre
6. Localidad e institución donde se desarrollará el proyecto
El muestreo se realizará en los Manglares de Puerto Pizarro, Tumbes,
Perú y el análisis de las muestras se llevará a cabo en el laboratorio de la
empresa Inca Biotec S.A.C –Tumbes.
7. Duración del Proyecto
8 meses
8. Fecha Probable de inicio y término
8.1.Inicio
Noviembre 2016
8.2.Termino
Junio 2017
9. Cronograma de Actividades
Actividades
(Fases)
PLANEAMIENTO
Revisión bibliográfica
Elaboración del proyecto
Presentación del proyecto
Aprobación del proyecto
Implem. Del Proyecto
EJECUCIÓN
Recolección de muestras
Procesamiento de muestras
Registro de datos
Análisis de datos
COMUNICACIÓN
Análisis e interpretación
Elaboración del informe
Presentación del informe
2016
NOV DIC ENE FEB
2017
MAR ABR MAY JUN
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10. Recursos disponibles
10.1.
Personal
Asesor del Proyecto de Tesis: María Victoria Lora Vargas
Co-Asesor: Benoit Diringer
Equipo Técnico de laboratorio de Inca Biotec S.A.C
10.2.
Equipos e instrumento
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Centrifugadora
Impresora Multifuncional
Lapto Toshiba
Cámara digital Canon
Refrigeradora Coldex
USB DTSE3
Autoclave 18L GREETMED Mod:XY-28OD
Esterilizador em seco.
Equipo Vortex
Kit cámara de electroforesis Clearver Scientific Ltd
CS-300V 22 X 12.5 x 9cm
Termociclador Biometra
Transiluminador de luz UV
Balanza gramera OHaus 600g
Vernier
Cámara de flujo laminar
Jeringas 1m
Pinzas
Bisturí
Tubos Falcon 50ml
Tubos Falcon 15 ml
Tubos eppendorf 1.5 ml
Marcador
Puntas con filtro 50 µl y 500 µl
03 Micropipetas Axygen 20-200 µl ,100-1000 µl, 0.510 µl.
Láminas portaobjetos
Láminas cubreobjetos
Bitácora
Cinta adhesiva
Tijera
Placas Petri 100x15mm Borosilicato PETRIQ
Probetas graduadas b/vidrio hexagonal normax 100ml
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10.3.
Matraces pirex 100ml
Royos de papel aluminio
Doc. Papel kraft
Royo de bolsas transparentes
Royo de papel toalla
Toca
Cubre boca
Guantes de nitrilo
Guantes de latex
Palas pequeñas
Bolsas Ziploc
Guardapolvo blanco
Eppendorf biophotometer model AG
Material y Reactivos
 01 Kit extracción de ADN.
 02 tubos de primer´s universales 16S ARNr (27F1492R).
 06 tubos de primer´s específicos para genes
involucrados en la oxidación de azufre.
 01kit de PCR Thermo Scientific
 05 Galones de Agua Destilada
 Fosfato dipotasico hidrogenado
 Sulfato de Magnesio
 Sulfato de amonio
 Sulfato de hierro ectahidratado
 frasco Agar bacteriológico (AGAR AGAR) x 1 kg
Merck.
 Agar TSA (Agar Tripticasa de soya)
 Cloruro de sodio.
10.4.
Local
Laboratorios de biología molecular de la empresa Inca Biotec
S.A.C, Tumbes.
Centro Colectivo Educativo Experimental de Biología
Biotecnología Acuática y Acuícola de Puerto Pizarro CEBAP
y
11. Presupuesto
01.00 Bienes
01.10 Materiales de escritorio………………………………. S/.170
 1 USB Kingston
 3 Marcadores
 1 Tijera
 1 Bitácora
 1 Cinta adhesiva
 2 Millares de hojas A4 de 75gr
 12 Folders A4 de cartón
 3 Lapicero
 1 Resaltadores
01.20 Materiales e instrumentos de Laboratorio…………S/.64000
 1Centrifugadora
 Eppendorf biophotometer model AG
 1Termociclador Biometra
 1Refrigeradora Coldex
 1Autoclave 18L GREETMED Mod:XY-28OD
 1Equipo Vortex
 1Kit cámara de electroforesis Clearver Scientific Ltd
 1Transiluminador de UV
 1Balanza gramera OHaus 600g
 1Camara de flujo laminar
 1Vernier
 200 Puntas con filtro 50 µl
 200 Puntas con filtro 500 µl
 100 Tubos eppendorf 1.5
 25 Tubos falcon 50ml
 25 Tubos falcon 15 ml
 20 Pinzas
 40 Jeringas
 40 Bisturí
 03 Micropipetas Axygen 20-200 µl ,100-1000 µl, 0.5-10 µl
 15 Placas Petri 10x15 mm Borosilicato PETRIQ
 2 Probetas graduadas b/vidrio hexagonal normax 100ml
 5 Matraces pirex 100ml
 2 Royos papel aluminio
 2 Doc. Papel kraf
 2 Royos de Bolsa transparente
 2 Royos de papel toalla
 1 Caja cubre boca
 1 Caja de guantes de nitrilo
 1 Caja de guantes de latex
 1 Caja de mascarilla
S/.70,770
02.00 Servicios
 5 Palas pequeñas
 1 paquete de bolsas ziploc
 1 caja de láminas portaobjetos
 1 caja de láminas cubreobjetos
 01 Kit de extracción de ADN
 02 tubos de primer´s universales 16S ARNr (27F- 1492R)
 06 tubos de primer´s específicos.
 01Kit de PCR Thermo Scientific
 5 galones de agua destilada
 Fosfato dipotasico hidrogenado
 Sulfato de magnesio
 Sulfato de amonio
 Sulfato de hierro ectahidratado
 1 Frasco Agar bacteriológico (AGAR AGAR) x1kg Merk
 1 frasco agar tripticasa de soya
01.30 Material para procesar los datos…………………….S/6000
 1 Lapto Toshiba
 1 USB Kingston
 Microsoft Excel 2013
 Alineamientos de secuencia online (Blast)
S/.3,100
01.40 Material fotográfico.......................................................S/.600
 1 Cámara digital Canon
02.01 Pasajes y subvenciones...................................................S/.2400
 Pasajes
 Alimentación
 Hospedaje
02.20 Publicaciones…………………………………………..S/.400
 1 Impresa multifuncional Hp
 1 Cartucho de tinta negra Hp
 2 Cartuchos de tinta color Hp
 Empastado
02.30 Otros…………………………………………………… S/.300
TOTAL
S/.73,870
12. Financiación
Los gastos descritos en el presupuesto serán financiados por la
empresa Inca Biotec S.A.C y otros por la tesista.
II.
PLAN DE INVESTIGACIÓN
1. Realidad Problemática
1.1.Identificación del Problema
Anadara tuberculosa (Sowerby 1833) es un molusco bivalvo que habita
los ecosistemas de manglar y que se distribuye desde Baja California en
México hasta el norte del Perú. (Cruz and Borda, 2003). Estos moluscos
viven específicamente asociada a los raíces de mangle, enterradas en el
fango a una profundidad que varía de 1 a 30 cm (INRENA, 2007). Su
importancia radica en que son la base de una pesquería completamente
artesanal de subsistencia, sobre todo para las comunidades asociadas a
estos ecosistemas y poseen escasos recursos económicos. Sin embargo,
las actividades antropogénicas como la extracción, la destrucción del
hábitat y la contaminación de los ecosistemas de manglar han conllevado
a la disminución de los bancos naturales de A. tuberculosa (concha negra)
en los últimos años a tal punto que es considerado una especie en situación
vulnerable.
Con respecto a ello, algunas poblaciones se encuentran cercanas del
colapso en la mayoría de los países (Mora et al., 2011, Lucero, Cantera y
Neira 2011).En Perú las poblaciones de A. tuberculosa de la región de
Tumbes se han reducido en un 73,2% durante el periodo de 1996 a
2007(Ordinola et al., 2007; Vivar et al., 1996).
Por consiguiente la extracción actual está limitada por una talla mínima
de captura según la RM.N°209-2001 PE y por el periodo de veda
reproductiva según la RM.N°014-2006-PRODUCE.
Así, (Flores, et al., 2013) menciona “que la talla mínima de extracción de
la concha negra es de 4.5 cm desde el 2001 y el cumplimiento del periodo
de veda desde el 2006, sin embargo no se tiene una cuota máxima de
extracción por lo que el número total capturado de concha negra depende
de la habilidad del extractor”.
A pesar de estas medidas drásticas de conservación, no se recupera las
poblaciones si no al contrario siguen su descendencia y la situación
poblacional de esta especie está en constante reducción.
A consecuencia de ello y al posible impacto ambiental y también
económico de la desaparición de este recurso representativo del manglar,
se consideró una alternativa que podría mejorar la situación, a través del
desarrollo de proyectos de manejo de producción de semillas en
condiciones artificiales de laboratorio en Perú y Ecuador (Diringer et al.,
2012).
Cabe resaltar que estos proyectos dieron buenos resultados, sin embargo
los cultivos enfrentaron altas mortalidades, debido a infecciones
bacterianas a nivel de larvas y reproductores.
Estos acontecimientos conllevaron a la realización de investigaciones
basadas en microbiología, eco-fisiología y nutrición.
Teniendo en cuenta que la concha negra tiene un hábitat aparentemente
hostil ya que los suelos de manglar son sustratos lodosos que se
caracterizan por el alto contenido de agua, sal, sulfuro de hidrógeno, bajo
contenido de oxígeno y elevada proporción de humus (Cintrón-Molero &
Schaeffer-Novelli, 1983) pero que parecen ser sumamente productivos.
En este sentido nos damos cuenta que los ecosistemas manglares tienen
altos contenidos de elementos tóxicos que entran en ciclos químicos y que
son fuertemente influenciados por los microrganismos presentes, a través
de diferentes procesos de reducción, oxidación, etc.
Es por ello que se torna interesante investigar la relación entre animal,
microbiota y hábitat, sobre todo centrarnos en el componente más tóxico
que es el azufre que puede alcanzar niveles de hasta 0.1 kg S m–3 año–1
(Dent, 1992)
Para mitigar la incidencia de estos componentes azufrados, varios
moluscos bivalvos han desarrollados relaciones simbióticas con
microorganismos que tienen la capacidad de transformar las formas más
toxicas en compuestos relativamente neutros (Holguin and Bashan ,2007).
En este sentido existe escasa información sobre la microbiota que habita
en A. tuberculosa, es por ello que se plantea este proyecto con la finalidad
de conocer y describir presencia de microorganismos simbióticos sulfatos
oxidantes.
2. Problema
¿Existen bacterias SOB en la sangre del molusco bivalvo A. tuberculosa
“Concha negra”?
3. Hipótesis
Existen más de 1 un tipo de bacterias SOB utilizando las técnicas
presentadas.
4. Justificación e importancia
A. tuberculosa es una especie endémica del ecosistema manglar que está
actualmente en situación de sobreexplotación debido a la fuerte demanda
comercial para su consumo directo.
Esta especie ha sido recolectada ancestralmente como un alimento básico
y como un ingreso económico básico para las comunidades costeras. La
mayoría de las poblaciones naturales de A. tuberculosa están
sobreexplotadas y algunas poblaciones están a punto de colapsar en varios
países. El hábitat natural en el que se desarrolla A. tuberculosa se
caracteriza por altas concentraciones de azufre debido a la
descomposición de materia orgánica y variaciones importantes de factores
abióticos que, en su conjunto, probablemente estimulen el desarrollo de
una microbiota particular que podría ser específica y beneficiaría a su
supervivencia.
En este aspecto el presente estudio se revela primordial para confirmar la
presencia de microorganismos simbióticos de tipo SOB que podrían ser
esenciales para el desarrollo acuícola sustentable de esta especie.
5. Objetivos
5.1.Objetivo general

Aislar y caracterizar molecularmente bacterias sulfatooxidantes (SOB) provenientes de la sangre del molusco
bivalvo A. tuberculosa (Concha negra)
5.2.Objetivos específicos



Aislar SOB provenientes de A. tuberculosa usando medios
selectivos.
Caracterización molecular mediante secuenciación del gen
16S ARNr.
Caracterización molecular dirigido al gen especifico soxB
6. Antecedentes
A.tuberculosa (concha negra) es un molusco bivalvo de amplia
distribución en la costa del Pacifico Oriental, su distribución geográfica
comprende desde Laguna Ballena (México) hasta Tumbes (Perú).
(Cabanilla, 2010). Se estima que más de dos mil personas viven de su
explotación directa y un número aún no determinado que se dedica a su
comercialización. (USAID 2012).
En este contexto Marín (2013), demostró que el recurso concha negra en
Puerto Pizarro, Tumbes, se encuentra en condiciones de sobreexplotación,
mostrando que esta especie se encuentra en un 74% del máximo de
rendimiento en su biomasa.
El posible impacto socio-económico- ecológico de la desaparición de este
recurso emblemático del ecosistema manglar ha conducido a proyectos de
producción de semilla en condiciones artificiales de laboratorio en Perú
(Diringer et al, 2012) y recientemente en Ecuador (Concepto Azul 2014).
En ambos países los cultivos acuícolas sufrieron mortalidades inducidas
por episodios de bacteriosis, en particular los relacionados a los géneros
Vibrio y Pseudomonas.
Estos eventos ocurren generalmente cuando existe un desequilibrio entre
el animal, su microbiota y su medio. En este aspecto, la alta concentración
de materia orgánica y la importante variación de factores abióticos en el
lodo del manglar y agua intersticial deben estimular el desarrollo de una
fauna particular que habita este ecosistema. Por consiguiente, se podría
asumir que la microbiota de A. tuberculosa podría ser específica y
beneficiaría la sobrevivencia en el lodo del manglar. Este concepto
conocido como hologenoma considera al hospedero y su microbiota
(holobionte) como única unidad de selección donde la plasticidad genética
del huésped se ve reforzada a través de la capacidad de adaptación de su
composición microbiana frente a un cambio ambiental(Zilber Rosenberg
et al., 2008).
Existe poca información acerca de la microbiota de la concha negra, pero
estudios realizados han registrado que las concentraciones de
Enterobacterias y coliformes en individuos de A. tuberculosa se
encuentran por encima de los niveles recomendados para su consumo
(Wong et al., 1997; Fernández et al., 1977).
Recientemente, Sánchez et al. (2015), evaluaron 8 cepas de bacterias del
tracto gastrointestinal de conchas negras adultas como probióticos
potenciales para el cultivo de langostino Litopenaeus vannamei,
identificando cepas de Bacillus (4), Citrobacter (1), Vibrio (1),
Enterococcus (1) y Staphylococcus (1).
Sin embargo estos primeros resultados fueron obtenidos mediante
técnicas dependientes de cultivo que permiten la identificación de una
pequeña fracción de la microbiota total (entre el 10% al 1%) (Streit, 2004).
Justamente, resultados obtenidos mediante técnicas independientes de
cultivo (metagenómica) que permiten obtener una visión completa de la
microbiota (Diringer et al. 2016, Com.Pers), demostraron que la
microbiota circulante de la sangre y gónadas de individuos recientemente
extraídos del manglar está constituida principalmente por bacterias
pertenecientes a los géneros Rubritepida sp. Proteus vulgaris,
Kaistobacter sp., Nocardiodes sp., que son géneros muy poco conocidos
y no previamente descritos en bivalvos.
Además se realizaron tratamientos de dietas alimenticias para A.
tuberculosa en paralelo por más de 4 meses, donde se observó que los
individuos del tratamiento control (individuos que viven solo con agua de
manglar filtrada, clorinada y neutralizada con tiosulfato) registraron una
sobrevivencia del 94%.
Esta observación en conjunto con una evaluación bibliográfica (Dubert et
al.,2016; Xiao et al.,2016; Deng et al., 2009; Jin et al., 2005; Alarico et
al., 2002; Roxon et al., 1977) de los géneros obtenidos por metagenómica
sugiere que A. tuberculosa albergaría bacterias con capacidad de
oxidación de azufre, en particular el thiosulfato, lo que permitiría explicar
la importante sobrevivencia de estos individuos en condiciones de ayuno
prolongado.
En este sentido existen estudios sobre bacterias sulfato-oxidantes
presentes en los ecosistemas y en los organismos.
Así Behera et al. (2013) identificó por caracterización molecular los
géneros Micrococcus, Bacillus, Pseudomonas y Klebsiella, capaces de
oxidar el azufre presente en los suelos de manglar del delta del río
Mahanadi.
Así mismo, Rojas et al.(2013), realizó un estudio basado en cultivos
microbianos de 75 microorganismos de los cuales 54 de ellos tenían la
capacidad de oxidar azufre y solo tres: AZCT-M125-5, AZCT-M125-6 y
AZCT-M125-7 eran capaces de crecer autotróficamente usando azufre
elemental produciendo sulfato, además un análisis basado en la secuencia
de genes 16SRNAr indicaron que los cultivos microbianos AZCT-M1255, AZCT-M125-6 estarían estrechamente relacionados con Thiooxidans
Acidithiobacillus , mientras que la identificación de AZCT-M125-7 no fue
posible.
Consecuentemente hasta la fecha se han reportado 5 familias de bivalvos
conocidas por albergar SOB (Mytilidae, Vesicomyidae, Solemiydae,
Thyasiridae y Lucinidae). Estas familias se encuentran principalmente en
aguas profundas, los que habitan en chimeneas hidrotermales pero
también en ecosistemas no tan extremos como son los fangos y
sedimentos de los herbales y los suelos del manglar (Dupperon et al, 2013)
Sin embargo es importante comprender los mecanismos de acción para
que exista una asociación de posible simbiosis entre microorganismos y
huésped, sobretodo en la familia Lucinidae que es aquella que tiene más
similitud con la familia Arcidae donde pertenece A. tuberculosa ya que
ambas presentan sangre y hemoglobina , característica primordial.
En este contexto, Brissac et al. (2010),realizó un análisis molecular
comparativo de los huéspedes con secuencias del gen 18 S y 28S ARNr
con bacterias simbiontes del gen 16S rRNA para determinar sobre qué
ambiente evolutivo produce asociaciones modernas entre la familia
Lucinidae y bacterias simbiontes, obteniendo como resultado que de todas
la secuencias realizadas solo se encontraron 3 especies de bacterias
simbiontes(16S ARNr), los cuales pertenecen al Filo Proteobacteria y se
encuentran dentro de Lucinidae y dos de ellos se obtienen de los
manglares donde habitan.
No obstante, Gros et al. (2003),determinó que en las familias
Assuggestedpreviously, Solemiydae y Vesicomyidae existe relación
simbionte por transmisión vertical, mientras que en la familia Lucinidae
por relación con el medio ambiente, basado en 2 pruebas experimentales
tanto para conocer si es que las bacterias simbiontes son heredadas por
transmisión vertical de padres a hijos o por una transmisión horizontal.
7. Materiales y Métodos
7.1.Material
Ubicación de área de Muestreo
La recolección del material biológico (A.tuberculosa) se llevará a cabo
en los Manglares de Puerto Pizarro, Tumbes, Perú y el trabajo de
laboratorio se realizará en la empresa biotecnológica Inca Biotec
S.A.C, Tumbes, Perú.
Población
Serán recolectadas 15 individuos silvestres de A. tuberculosa a partir
de los bancos naturales ubicados en los manglares de Tumbes, en las
coordenadas 3°30’12.96”S - 80°23´55.87”O.
Las muestras serán extraídas manualmente con el seguimiento de un
Poblador extractor (Conchero), lavadas con agua de mar con el
objetivo de eliminar detritus impregnado en las valvas, además serán
seleccionados por sus tallas superiores o iguales a la talla mínima legal
de extracción.
Posteriormente serán trasladados a los laboratorios de Inca Biotec
S.A.C en la ciudad de Tumbes, y ubicado en el área de recepción de
muestras.
Muestra
Se extraerá la sangre de manera individual utilizando una aguja de
calibre 25 junto con una jeringa de 1ml, el cual contendrá citrato de
sodio al 10% y se insertará directamente en el musculo aductor
posterior, se succionará un máximo de 0.5 ml el cual se mezclará con
el citrato de sodio ya mencionado.
7.2.Metodología
7.3.Diseño de Contrastación de hipótesis:
La contrastación de la hipótesis se hará a través del diseño de una sola
casilla. (Goode y Hatt, 1986)
Aislamiento y purificación de cepas sulfato-oxidantes
Una vez obtenida mediante punción la sangre de A.tuberculosa en
condiciones asépticas se inoculará 500µl de sangre de A. tuberculosa
en tubos de centrifugación de 15ml que contengan 9 ml de medio
liquido especifico 9K(Rojas et al,2013), se llevará a incubar a 37°C
por 72 horas en homogenización constante , una vez visualizado el
crecimiento se procederá a aislar las bacterias inoculando 20 µl de la
muestra , se sembrará por el método de esparcido en placas Petri, que
contengan medio sólido no selectivo Tripticasa Soya Agar(TSA
sigma) suplementado con 2 % de cloruro de sodio y se evaluara el
crecimiento por periodos de 18 a 48 horas a 37 °C.
Se seleccionarán aquellas colonias que presenten morfología
diferente. Una vez seleccionadas las colonias se iniciará la
purificación mediante las siembras sucesivas por el método de
estriado en placa. La pureza de cada cepa se verificará mediante
tinción Gram y el proceso de aislamiento se repetirá hasta obtener
cepas totalmente puras. Las bacterias puras serán sembradas en medio
líquido Luria Bertani (LB sigma) suplementadas con 2% de cloruro de
sodio.
Para conservar las cepas se le agregará a cada una de ellas 25% de
glicerol estéril (v/v) en 1ml de cultivo en fase estacionaria y se
almacenará a -20°C.
Extracción de ADN genómico
Se extraerá 1 ml de cultivo de cada cepa que será centrifugado a 13000
rpm y el sobrenadante será descartado. El ADN del pellet será
obtenido siguiendo el protocolo de extracción descrito por el
fabricante (Kit Concepto azul).
Posteriormente La concentración fue determinada por lectura de
absorbancia a 260 nm y la pureza evaluada utilizando ratios A260/280
y A260/230 por espectrofotometría (Eppendorf biophotometer model
AG)
Caracterización molecular de las cepas sulfato oxidantes mediante
amplificación del gen 16S ARNr
Se realizará una amplificación de la región del gen 16S ARNr
mediante una prueba PCR utilizando los iniciadores universales 27Fy
1492R, los cuales generan un producto de alrededor de 1500pb.
Se le agregará un mix de PCR de un volumen final de 25 μl a cada una
de las muestras de ADN, posteriormente serán colocados en un
termociclador (Biometra)
Los productos de PCR serán observados en un gel de electroforesis a
una concentración de 1.5 % de agarosa, los amplicones de tamaño
esperado serán enviados a secuenciar a MACROGEN USA.
Procesamiento de datos
La obtención de secuencias de nucleótidos de las cepas de interés será
obtenido mediante secuenciamiento por Macrogen, dichas secuencias
serán alineadas mediante programas on line para la identificación
mediante homología de secuencia con la base de datos disponibles
(Gen bank), que permitirá la determinación de microorganismos a
nivel de género.
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